Chapter 7. USABILITY TESTING
7.3 Analysis of results
Considerando que trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que la supervivencia de las células MDCK en estado proliferativo no estimulado depende de la síntesis endógena de S1P, uno de los objetivos de la presente tesis fue evaluar la influencia del tono de síntesis de S1P sobre la proliferación y diferenciación de células MDCK. Para ello se procedió a definir la condición experimental en la cual la inhibición de la SphK module la proliferación sin afectar la supervivencia celular, evaluándose el efecto de la inhibición controlada de la SphK, sobre el número y la viabilidad celular.
Para realizar estos experimentos se procedió a ensayar diferentes concentraciones de dos inhibidores farmacológicos de la SphK denominados L-threo dihidroesfingosina (L-tDHS) y SKI-II que poseen diferente naturaleza química y actúan por distintos mecanismos de acción.
Figura 17. Curva de crecimiento. Se sembraron 30.000 células que fueron cultivadas en medio DMEM/F12 al 10% de SFB por 24 horas (Fase lag). Pasadas estas este tiempo se remplazó el medio con una concentración al 0,5% de SFB y se incubó por 24, 48 y 72 horas. Posteriormente se procedió al recuento del número de células y se determinó la viabilidad por el método de exclusión de trypam blue. (A) Imágenes de células MDCK correspondientes a un aumento de 6X en función de los diferentes tiempos ensayados. Se pueden observar células con medio al 10% SFB a tiempo 0 (fase lag) y post cambio de medio por 24-48 hs (fase exponencial) y 48-72 hs (células confluentes). (B) Número de células en función del tiempo. (C) log 2 del número de células en función del tiempo. (n=15 experimentos independientes; p< 0,05 vs control).
10% SFB 0,5% SFB 10% SFB 0,5% SFB
hs hs
células confluentes
fase lag fase exponencial fase lag fase exponencial
B
C
célulasconfluentes
63
2.1 Efecto del inhibidor competitivo lipídico L-tDHS
Para evaluar el efecto del inhibidor sobre el número y viabilidad celular se procedió a estudiar ambos parámetros en función de la concentración del inhibidor y el tiempo de incubación. El inhibidor fue agregado una vez finalizada la fase lag concomitantemente con el cambio de medio de cultivo por DMEM/F12 con 0,5% de SFB. Las concentraciones del inhibidor ensayadas fueron 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 10 y 15 µM y se incubaron las células durante 24, 48 y 72 hs posteriores al agregado del inhibidor, tiempos correspondientes al período de proliferación exponencial de las células MDCK en la condición experimental ensayada. Respecto al número de células puede observarse que las concentraciones de 0,5; 1; 2; 3 y 4 µM no presentaron efecto sobre el incremento del número de células a todos los tiempos ensayados (Figura 18 A). A partir de la concentración de 5 µM se observa un efecto inhibitorio de la proliferación celular. El tratamiento durante 24, 48 y 72 hs con 5 µM de L- tDHS produce una disminución en el incremento del número de células en un rango de 52 a 54%, mientras que a 10 µM el rango es de 90 a 95% y a 15 µM es de 98 a 99% en las tres condiciones ensayadas. Cuando se evaluó la viabilidad celular (Figura 18 B) el tratamiento con 5 µM de L-tDHS no afecta a la misma en ninguno de los tiempos ensayados, mientras que en las células tratadas con 10 y 15 µM de inhibidor se observa una pérdida de la viabilidad del 85% respecto del control desde las 24 hs de incubación.
Figura 18. Efecto del inhibidor farmacológico L-tDHS sobre el número y la viabilidad celular. Células MDCK fueron cultivadas a diferentes tiempos con concentraciones crecientes de L-tDHS. (A) y (B) representan el número y viabilidad celular correspondientes a 24, 48 y 72 horas en presencia y en ausencia de L-tDHS. (n=15 experimentos independientes; p< 0,05 vs control). Momento en el cuál es agregado el inhibidor (flecha)
A
B
hs hs
10% SFB 0,5% SFB 10% SFB 0,5% SFB
64
Por lo tanto se puede observar que la inhibición parcial de la SphK para la concentración de 5 µM de L-tDHS produce una disminución en el incremento del número de células, sin presentar cambios en la viabilidad, en todos los tiempos ensayados, sugiriendo una disminución en la tasa de proliferación.
2.2 Efecto del inhibidor competitivo no lipídico SKI-II
El SKI-II es un inhibidor no lipídico de SphK que difiere de L-tDHS no solo en su mecanismo de acción, sino también en su naturaleza química. Inicialmente se realizó una evaluación de la proliferación y viabilidad celular en función del tiempo de incubación a concentraciones crecientes del inhibidor SKI-II. En la Figura 19 A se puede observar que a bajas concentraciones de inhibidor (0,5-2 µM) el número de células no se encuentra afectado. El tratamiento con 3 µM de SKI-II produce una disminución en el incremento del número de células de 52-54 y 58% respecto del control a las 24, 48 y 72 hs de tratamiento respectivamente. Concentraciones superiores producen una profundización de la disminución del incremento de número de células en un rango de 56 a 72% de 24 a 72 hs para 4 µM y de 60 a 80% para 5 µM. A mayores concentraciones el número de células es inferior en un 95 % respecto del control en todos los tiempos ensayados. Cómo se muestra en la Figura 19 B, 3 µM de SKI-II no altera la viabilidad celular en ningún período de tiempo estudiado. Para las concentraciones de 4 y 5 µM no se observa pérdida de la viabilidad a las 24 y 48 hs de incubación, pero si se observa una pérdida del 20 % luego de 72 hs de incubación. Las concentraciones de 10 y 15 µM producen alrededor de 80% de pérdida de viabilidad respecto del control desde las 24 hs de incubación.
Figura 19. Efecto del inhibidor farmacológico SKI-II sobre el número y la viabilidad celular. Células MDCK fueron cultivadas a diferentes tiempos con concentraciones crecientes de SKI-II. (A) y (B) representan el número y viabilidad celular correspondientes a 24, 48 y 72 horas en presencia y en ausencia SKI-II. (n=7 experimentos independientes *p< 0,05 vs control). Momento en el cuál es agregado el inhibidor (flecha)
A
B
10% SFB 0,5% SFB 10% SFB 0,5% SFB
hs hs
65
Dado que es de nuestro interés evaluar la implicancia de la inhibición parcial de la enzima SphK en la proliferación, el arresto y la diferenciación celular, se seleccionaron aquellas concentraciones de los inhibidores donde se producía una disminución del incremento del número de células sin afectar la viabilidad celular. Es por ello que las concentraciones de 5
µM de L-tDHS y 3 µM de SKI-II fueron las elegidas para realizar nuestros experimentos
posteriores, ya que ambas cumplían con la condición de causar una disminución significativa en el incremento del número de células sin alteración de la viabilidad.