El BrGTP interfiere con la polimerización de FtsZ (Lappchen et al., 2005), lo que muestra que es posible inhibir FtsZ con compuestos que se unan específicamente al sitio de nucleótido. El estudio de diferentes análogos del GTP sustituidos en C8 facilita la exploración del sitio de nucleótido, lo cual puede aportar información para el diseño racional de compuestos inhibidores con una química diferente al GTP.
Los análogos del GTP ensayados compiten con mant-GTP por el sitio de nucleótido de FtsZ con un rango de afinidades entre 108 y 106, aproximadamente. Además, se observó que la afinidad de un análogo por FtsZ correlaciona positivamentecon su capacidad de inhibir la polimerización (medido como IC50 de polimerización) de BsFtsZ y EcFtsZ. Así, la búsqueda de compuestos que se unen al sitio de nucleótido de FtsZ con afinidades altas puede dar como resultado inhibidores efectivos de ensamblaje. Una estrategia de este tipo se ha empleado para la optimización de agentes estabilizadores de microtúbulos (Buey et al., 2004, Dietrich et al., 2009).
Una pregunta importante es el origen de las diferencias de afinidad entre los diferentes análogos. Se pueden proponer algunas explicaciones a través de la conformación adoptada por el nucleótido en el sitio de unión de FtsZ. El grupo guanina del GTP puede
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existir en posición anti, que deja a la base alejada del grupo ribosa, o en posición sin, donde la base está girada hacia la ribosa (Figura 36).
Figura 36: Conversión del grupo guanina del GTP entre la conformación anti y sin
Normalmente el equilibrio estará desplazado hacia la posición anti, ya que éste provoca el número menor de choques estéricos con el azúcar. La presencia de un grupo voluminoso en posición C8 podría provocar un desplazamiento del equilibrio entre estas dos posiciones hacia el estado sin. Todas las estructuras cristalográficas de FtsZ resueltas hasta el momento en presencia de nucleótido lo muestran en posición anti, incluyendo la estructura cristalográfica de FtsZ de Aquifex aeolicus con MorphGTP (Lappchen et al., 2008). Es posible que la presencia del grupo morfolino sustituyente desplace el equilibrio de MorphGTP en solución hacia el estado sin. Dado que MorphGTP se une a FtsZ en posición anti, esto obligaría FtsZ a tomar ligandos para unión en anti de una fuente de MorphGTP dominada por la conformación sin, lo que podría contribuir a su menor afinidad. En un estudio reciente se han predicho unas relaciones de energías libres de unión entre el BrGTP, ClGTP y GTP compatibles con las encontradas en esta Tesis (Hritz et al., 2010). Dichos cálculos predicen una conformación anti para los análogos unidos a FtsZ de A. aquifex pero una mezcla de conformaciones anti y sin en solución, con diferentes proporciones de las conformaciones para diferentes análogos, siendo esto un factor determinante para las diferencias de energía libre de unión de los análogos de GTP.
Otro factor que podría afectar la afinidad es la interferencia estérica adicional de los grupos sustituyentes Los análogos con sustituyentes más pequeños generalmente presentan una afinidad mayor, pero esta relación no es del todo precisa, ya que PyrrGTP, a pesar de tener un sustituyente voluminoso, tiene una afinidad mayor que
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ClGTP, BrGTP e IGTP. Una manera de representar los requerimientos estéricos mínimos de un sustituyente es a través del parámetro Sterimol B1, que es la medida de la anchura mínima del sustituyente (Fauchere et al., 1988). Se calcularon los parámetros sterimol B1 de cada ligando (Lappchen et al., 2008) y se compararon con las constantes de disociación (Kd) de cada ligando de apoFtsZ de M. jannaschii (Figura 37). Aunque hay una cierta tendencia a mayores afinidades (menores Kd) a menores parámetros Sterimol B1, el MorphGTP destaca por desviarse de la tendencia general, teniendo una afinidad menor de lo que se predice por su parámetro Sterimol B1.
La estructura cristalográfica FtsZ de A. aquifex con MorphGTP no presenta ningún cambio conformacional significativo respecto a la misma proteína unida a GDP (Lappchen et al., 2008). La parte no-morfolino de MorphGTP muestra una conformación muy similar a la observada en la estructura con GDP (Oliva et al., 2007). El grupo morfolino está a un ángulo de 55º respecto al plano de la guanina. Además, la densidad electrónica en esta zona de la estructura es menor al resto de la molécula, indicando que el grupo tiene una cierta libertad. Este posicionamiento en teoría tampoco causaría perturbaciones importantes dentro de la estructura conocida del dímero de FtsZ de Methanococcus jannaschii (Oliva et al., 2004, Lappchen et al., 2008). En función de esto es difícil explicar por qué MorphGTP inhibe la polimerización de EcFtsZ y BsFtsZ. Una posibilidad es que el análogo se una a estas proteínas de manera diferente a como lo hace a FtsZ de Aqueolux aquifex. Esto parece en principio poco probable, dado que se han resuelto más de 20 estructuras de FtsZ, de diferentes especies bacterianas y diferentes nucleótidos unidos, sin que se hayan detectado hasta el momento diferencias importantes entre ellas. Por otra parte, algunas diferencias deben
Figura 37: Comparación entre el tamaño y la afinidad de los análogos de GTP. Comparación del parámetro
Sterimol B1 con la constante de disociación (Kd).
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de existir en la unión de los ligandos a la proteína, dado que las afinidades varían entre sí. Estos pequeños reordenamientos en las interacciones del nucleótido con la proteína podrían provocar la pérdida de interacciones longitudinales esenciales para la formación del polímero. De momento no se conoce la verdadera estructura del polímero de FtsZ. Una posibilidad es que la estructura del dímero (Oliva et al., 2004, Oliva et al., 2007) represente un estado pre-hidrólisis del protofilamento, y que tras la hidrólisis los monómeros de FtsZ se acerquen más entre sí (Oliva et al., 2004), lo que aumentaría la posibilidad de interferencias directas o indirectas con el sustituyente en C8. La resolución del mecanismo molecular de los efectos inhibitorios de estos análogos, facilitará el diseño de compuestos que se unan específicamente al sitio de unión de nucleótido de FtsZ con grupos unidos dirigidos a interferir en las interacciones entre monómeros durante el ensamblaje.