Appendix A: Interview schedule

1. OBJETIVO

Aplicará técnicas de cultivo sumergido para la producción de ácidos orgánicos y evaluará su rendimiento.

2. INTRODUCCION

El ácido cítrico (ácido 2 hidroxipropano-1,2,3 tricarboxílico) es un producto metabólico primario y se forma en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La glucosa es la principal fuente de carbono utilizada para la producción de este ácido. En muchos microorganismos el 80% de la glucosa utilizada para esta biosíntesis se metaboliza por reacciones de la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) y 20 % por reacciones del ciclo de la pentosa fosfato.

El descubrimiento del ácido cítrico se atribuye al alquimista islámico Jabir Ibn Hayyan en el siglo octavo d.C. El ácido cítrico fue el primer ácido aislado en 1784 por el químico sueco Carl Wilhelm Scheele, que lo cristalizó a partir del jugo del limón. La producción de ácido cítrico a nivel industrial comenzó en 1860, basado en la industria italiana de los cítricos, en 1880 la compañía Pfizer fundada por los hermanos alemanes Charles Pfizer, Charles Erhart, comenzaron a fabricar ácido cítrico, utilizado por varias industrias, volviéndose su producto más importante.

En 1893, C. Wehmer descubrió que cultivos de Penicillium podían producir ácido cítrico a partir de la sacarosa molecular. Sin embargo, la producción microbiana del ácido cítrico no llegó a ser industrialmente importante hasta la Primera Guerra Mundial que interrumpió las exportaciones italianas de limones. En 1917, el químico americano James Currie descubrió que ciertos cultivos de Aspergillus niger podían ser productores eficientes de ácido cítrico, desde 1920 en adelante fueron desarrollados con éxito procesos de fermentación, en donde se utiliza generalmente

cepas del hongo Aspergillus níger, aunque también han sido empleadas ciertas cepas de levaduras. En 1923, los hermanos Pfizer logran obtener ácido cítrico a partir de Aspergillus níger y la fermentación del azúcar, utilizó como sustrato la melazas de remolacha y se diversificó en sustratos como sacarosa, melazas de caña o jarabe de glucosa. En 1950, la producción de ácido cítrico alcanzaba las 50.000 toneladas/año. Posteriormente, se registró una importante expansión debido al desarrollo del proceso de fermentación sumergida, mucho más económico.

El ácido cítrico puede ser producido tanto en procesos de superficie como sumergidos. Varios factores afectan la elección del tipo de proceso: la existencia de capital de inversión, la abundancia de energía, el costo, el entrenamiento de la mano de obra, la existencia de técnicas para la medida y la regulación.

El ácido cítrico actualmente es obtenido principalmente en la industria gracias a la fermentación sumergida de azúcares como la sacarosa o la glucosa, utilizando cepas modificadas para industria del género Aspergillus. El proceso de obtención tiene varias fases como la preparación del sustrato de melaza, la fermentación aeróbica de la sacarosa por el hongo, la separación del ácido cítrico del sustrato por precipitación al añadir hidróxido de calcio o cal apagada para formar citrato de calcio. Después se añade ácido sulfúrico para descomponer el citrato de calcio. La eliminación de impurezas se realiza con carbón activado o resinas de intercambio iónico, se continúa con la cristalización del ácido cítrico, el secado o deshidratación y el empaquetado del producto.

3. CORRELACION CON EL PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA (ING.

BIOQUIMICA BQO-0525)

Tema. Crecimiento y propagación de microorganismos.

Subtema. Cultivo sumergido.

El proceso para la obtención del ácido cítrico nos permite utilizar las técnicas del cultivo sumergido para la producción de un metabolito de interés, y relacionar el laboratorio con el amplio mundo de las industrias pues cuenta con aspectos genéricos utilizados en la elaboración de muchos otros productos.

4. MATERIAL Y EQUIPO

Descripción del material Cantidad Equipo

PDA (g/l) 39 Autoclave

Tubos de 18 x 150 mm con tapón de rosca

5 Campana de flujo laminar vertical

Probeta de 250 ml 1 Horno

Matraz Erlenmeyer de 250 ml 15 Mechero bunsen Matraz Erlenmeyer de 1000 ml 1 Vortex

Gradilla 1 Espectrofotómetro

Asa para picadura 1 Incubadora agitadora

Bureta 1

Pipetas de 1 ml 5

Pipetas de 10 ml 2

Microespátula o Espátula 1 Medio de producción

5. METODOLOGIA Preparación

1. Medio de cultivo básico para producción.

Componentes principales (g/l) Trazas (mg/l)

Sacarosa 140 CuSO4.5 H2O 0.24

(NH4)2SO4 2.5 ZnSO4.7 H2O 1.50

KH2PO4 0.15 FeSO4.7 H2O 0.1

NaCl 0.15

MgSO4.7H2O 1.1

Procedimiento

1. Esporulación: Tomar una azada de una colonia de Aspergillus niger e inocular en agar inclinado de PDA, se incuba (hasta su esporulación) durante 7 días a 30°C.

a. Cosecha de esporas: Las esporas se resuspenden en 5 ml de solución de estéril de Tween-80 de solución salina (0.85%), rasgando suavemente el cultivo esporulado.

b. Las células resuspendidas se homogenizan durante 1 minuto con el vortex. 2. Inoculación: Se inoculan 11 matraces Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 50 ml de

medio de cultivo con 0.5 ml de la suspensión de esporas.

3. Cultivo: Los cultivos se incuban durante 10 días a 30°C en un agitador a 200 rpm para favorecer una buena oxigenación del medio, se tomará un matraz cada día para determinar los parámetros de producción de ácido cítrico y biomasa a través del tiempo de fermentación.

4. Cosecha: Los cultivos se filtran sobre un papel de filtro pesado colocado en un embudo Buchner conectado a una trampa de agua. Se guarda el filtrado sobre el que se realizará la determinación de ácido cítrico y el micelio se lava con 50 ml de agua para eliminar los hidratos de carbono remanentes que caramelizarían y afectarían la determinación de peso seco. Se determinará peso seco (biomasa), consumo de azúcar y producción de ácido cítrico.

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS

1. Fomentar la investigación a través de observar el proceso para la obtención del ácido cítrico.

2. Relacionar sus resultados con la discusión con la industria biotecnológica.

7. REPORTE DEL ALUMNO

1. Reporte de los datos de fermentación. Tiempo (hs) Sustrato (g/l) Concentración celular* (g/l) Acido Cítrico (g/l) 0 140 24 etc *Biomasa

2. Grafique los resultados en una sola tabla.

3. Determine el rendimiento de la producción de ácido cítrico. Yp/s (g cítrico producido / g azúcar consumida)

4. Compare sus resultados con los resultados de sus compañeros y presente un resumen.

5. Escriba sus conclusiones.

8. BIBLIOGRAFIA

1. Bradshaw J., 1979. “Microbiología de laboratorio”. Editorial El manual Moderno, S.A.

2. Quintero R., 1981. “Ingeniería bioquímica. Teoría y aplicaciones”. Editorial Alhambra Mexicana, S:A.