Los pacientes con DM1 presentan defectos en el empaquetamiento de las fibras musculares, los núcleos están centralizados, existen variaciones en el diámetro de las fibras tipo 1 (fibra lenta para la contracción) y muestran degeneración muscular (Harper, 2001). En los modelos de DM1 en ratón también se reproducen estos defectos de centralización nuclear y heterogeneidad en el tamaño de las miofibras
Resultados
(Figura 11.1 Apartado 11.1 de Introducción) (Mankodi et al., 2000; Seznec et al., 2001).
En el adulto de Drosophila la mayor parte del tórax está ocupada por una serie de músculos que están especializados en el vuelo. En el tórax se encuentran los músculos directos (DFM) e indirectos de vuelo (IFM). Los IFM se dividen en músculos dorso-longitudinales (DLM) y dorso-ventrales (DVM) y son los encargados de producir el batido de las alas que permite a la mosca volar al actuar sobre el exoesqueleto del insecto. Por cada hemisegmento se localizan seis músculos DLM y siete DVM (Figura 2.11). Los IFM están muy organizados y son muy sensibles a alteraciones causadas por mutaciones en proteínas musculares. Las mutaciones que afectan a estos músculos son fáciles de detectar fenotípicamente porque los mutantes son incapaces de volar.
Figura 2.11. Músculos indirectos de vuelo. Sección transversal de tórax de Drosophila. Los músculos indirectos de vuelo se dividen en seis músculos dorso-longitudinales (flecha roja) y siete músculos dorso-ventrales (flecha azul) por hemisegmento. Imagen procedente de Bernard et al., 2003.
Con el fin de comprobar si podíamos detectar alteraciones histológicas semejantes a las descritas para pacientes con DM1 o modelos murinos de esta enfermedad, expresamos el transgén UAS-(CTG)480 en toda la musculatura de
Drosophila con el patrón de expresión de la cadena pesada de la Miosina. Estas moscas desarrollan un fenotipo característico de "alas hacia arriba" que impide a las moscas volar (Figura 2.3). Este fenotipo podía deberse a defectos en los músculos implicados en el vuelo por lo que decidimos utilizar un método clásico para analizar la estructura del músculo como es teñir las secciones con hematoxilina y eosina. Embebimos las moscas en parafina para posteriormente seccionar transversalmente el tórax de estas moscas y teñir. En una primera aproximación estos experimentos no revelaron defectos significativos en los paquetes musculares (Figura 2.12).
Resultados B C A
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Figura 2.12. La tinción con hematoxilina y eosina de secciones de tórax que expresan las (CTG)480 en el músculo no revelaron defectos. (A) Esquema de la orientación de las secciones
torácicas. Secciones de 12 μm de grosor procedentes de moscas embebidas en parafina. (B) Moscas control con el genotipo y w; Mhc-GAL4/ +. (C) Moscas que expresan la expansión (CTG)480 con el genotipo y w; Mhc-GAL4/ UAS-(CTG)480 1.1. En la sección se observa el esófago (flechas), los seis
músculos dorso-longitudinales (asteriscos) y los músculos dorso-ventrales (cabeza de flecha). Cruces realizados a 29 ºC.
Un análisis detallado de estas tinciones con hematoxilina reveló que en los músculos dorso-longitudinales la localización del núcleo era periférica (normal) pero el empaquetamiento de la fibra muscular no era compacto, presentaba una estructura laxa como ocurre en los pacientes con DM1 (Harper, 2001) (Figura 2.13).
B
A
B
Resultados
Figura 2.13 Los núcleos de las fibras musculares de Drosophila se localizan en la periferia de las miofibras. Sección transversal de un paquete muscular (A, B y C) y sección longitudinal (D) de 12 μm de grosor de músculos teñidos con hematoxilina-eosina. (A) Moscas control con el genotipo w; Mhc-GAL4 muestran una masa muscular compacta. (B) Moscas con el genotipo y w; Mhc-GAL4/ UAS-(CTG)480 1.1
muestran los núcleos en la periferia del paquete muscular (flechas) y una compactación laxa. (C) En moscas y w; Mhc-GAL4/ UAS-(CTG)480 1.1 se observa que algunos músculos dorso-longitudinales
muestran mayor desorganización de las fibras musculares, compárese con la compactación muscular que muestra la fotografía A. (D) Sección longitudinal de moscas con genotipo y w; Mhc-GAL4/ UAS-(CTG)480
1.1 aparentemente no se observan defectos. Cruces realizados a 29 ºC.
Decidimos utilizar una técnica histológica de mayor resolución para analizar los paquetes musculares de las moscas que expresaban (CUG)480. Incluimos las moscas en resina epoxi y seccionamos los tórax de moscas jóvenes que estaban expresando tanto RNAs (CUG)480 como RNAs (CUG)60 en los músculos torácicos. En estas tinciones observamos que los músculos que expresaban RNAs con 60 repeticiones CUG no mostraban defectos (Figura 2.14B) en cambio en moscas que expresaban 480 repeticiones CUG se observaban vacuolas en los paquetes musculares (Figura 2.14C).
Otro aspecto definitorio de la DM es su carácter degenerativo. Comprobamos si la expresión continuada de RNAs (CUG)60 o RNA (CUG)480 en la musculatura provocaba un aumento en los defectos histológicos encontrados comparando secciones torácicas de moscas de 2-3 días de edad con moscas de 38 días. En estas tinciones observamos un aumento en el tamaño de las vacuolas así como una disminución en el tamaño de los músculos dorso-longitudinales de los músculos indirectos del vuelo, siendo ambas señales típicas de músculos distróficos (Harper, 2001). También encontramos en moscas envejecidas que algunos músculos dorso- longitudinales estaban completamente ausentes (Figura 2.14F). Estos defectos solamente se detectaron cuando se expresaban los RNA (CUG)480. No vimos defectos en moscas envejecidas que expresaban (CUG)60 (Figura 2.14E). Todos estos defectos se reprodujeron en un total de quince individuos analizados.
Resultados Control (CTG)60 (CTG)480
B C
A
38 días 2- 3 díasD E F
Secciones torácicas con orientación transversalFigura 2.14. Defectos musculares en moscas que expresan RNAs (CUG)60 y RNAs (CUG)480.
Secciones de tórax de moscas con los siguientes genotipos; (A, D) UAS-(CTG)480, (B, E) Mhc-GAL4/
UAS-(CTG)60 y (C, F) Mhc-GAL4/ UAS- (CTG)480. Secciones de moscas de 2-3 días (A, B, C) o de 38 días de edad (D, E, F). Solamente se detectan defectos en las moscas que expresan las (CTG)480 (C, F).
Se observan músculos con vacuolas (cabeza de flecha) y en moscas envejecidas (F) se observa una reducción de la masa muscular (flecha) e incluso ausencia de algún músculo dorso-longitudinal (asterisco).Los cruces y el envejecimiento de las moscas se realizaron a 25 ºC.
La DM puede definirse genéticamente como una falta de función de MBNL provocada por la expresión de RNAs mutantes con expansiones largas de repeticiones CUG. Así, las proteínas de la familia Muscleblind colocalizan con foci ribonucleares de RNAs CUG, se unen a estos RNAs in vitro y los mutantes de falta de función de muscleblind y MBNL1 reproducen aspectos definitorios de la enfermedad (Artero et al.,
Resultados
1998; Miller et al., 2000; Kanadia et al., 2003a; Machuca-Tzili et al., 2006; Vicente et al., 2007). Si la expresión de RNAs CUG en los tejidos de la mosca reproducía la DM esperábamos poder detectar fenotipos descritos en los mutantes muscleblind de Drosophila. Uno de estos fenotipos musculares es la desorganización de las bandas Z de los sarcómeros. Esta alteración puede observarse en microscopia óptica con una tinción con un anticuerpo anti-Kettin, una proteína mayoritaria de las bandas Z, a baja resolución o bien mediante un análisis ultraestructural en microscopia electrónica. En un primer análisis expresamos las expansiones (CTG)480 en músculo utilizando las líneas GAL4 Dmef2-GAL4 y Mhc-GAL4 a 29 ºC. Diseccionamos larvas de tercer estadío y con un anticuerpo anti-Kettin detectamos un patrón bandeado en los músculos larvarios semejante al de los controles silvestres (dato no mostrado). Estas tinciones descartaban defectos importantes en las bandas Z pero nuestros resultados con el procesado de los transcritos primarios de otra proteína de las bandas Z, la α- actinina, sugieren que en efecto las bandas Z están afectadas en las moscas modelo. Los defectos que provoque la expresión de RNAs CUG pueden ser sólo detectables con técnicas de alta resolución como la microscopia electrónica.