Automation Systems, Simatic S7

La Genética necesita de modelos animales para el estudio de los rasgos y proce- sos que serían imposibles en seres humanos, no sólo por motivos éticos sino también debido a limitaciones temporales.

Estos modelos animales permiten, entre otros, aislar fenotipos, cruzar sujetos consanguíneos, incluir o excluir genes del genoma de los sujetos experimentales, clo- nar sujetos, sobreexpresar productos biológicos, etc.

En Psicogenética, la principal utilidad de estos modelos animales son: 1) el estu- dio de rasgos en base a comparar diferentes cepas de una misma especie; 2) el estu- dio de rasgos a través de mutaciones espontáneas; 3) estudio mediante la potencia- ción de rasgos fenotípicos sin manipulación genética; y 4) el estudio de rasgos utilizando técnicas de manipulación genética.

Figura 20. A) Secuencia de una muestra de ADN genómico metilado después tratarlo con bisul- fito. La metilación de las citosinas las protege de su conversión en uracilos. B) Secuencia de ADN genómico no metilado después de tratarlo con bisulfito. Las citosinas se han convertido en uraci- los y serán determinados como timinas en el protocolo de secuenciación (Figura de Applied- Biosystems).

El genoma de los animales utilizados en los tres primeros tipos de estudios pue- den analizarse (careotipado, PCR, QTL, chips de ADN,...) con el objetivo de estudiar los patrones de expresión génica y encontrar genes potencialmente implicados en la expresión de un rasgo (genes candidatos). Sobre la base de los resultados obtenidos de estos tres tipos de modelos animales se obtiene información valiosa que puede ser útil a la hora de decidir qué genes deberían manipularse genéticamente para estudiar con más profundidad un rasgo determinado (el cuarto tipo de estudio).

Los estudios genéticos utilizan diversos organismos para sus estudios, entre ellos bacterias, levaduras, moscas, gusanos, peces y diversos tipos de mamíferos (roedores, conejos, ovejas,…). En el caso de la Psicogenética las especies más utilizadas son los roedores, tanto ratas como ratones.

3.1.1 Estudios de las diferencias entre cepas de una misma especie

Siempre que se escoja trabajar con roedores, hay que tener en cuenta que existen diferentes cepas (razas) de ratas/ratones, cada una con sus propias características con- ductuales, lo cual puede influir en los resultados obtenidos.

La comparación conductual de la expresión de un rasgo (p. ej.: agresividad) entre cepas nos permite saber si existe carga genética en dicho rasgo: si al comparar la expre-

Ventajas del uso de roedores en Psicogenética • son fáciles de manipular

• salvo excepciones, no requieren cuidados especializados

• son especies muy fértiles y prolíficas (producen muchos óvulos, embriones muy resistentes, camadas de entre 7-12 crías)

• corto período de gestación (19-21 días), rápido destete y rápido celo después del parto

• amplio conocimiento de embriología de estas especies

• poseen un genoma muy similar a los humanos (aproximadamente un 80% de genes en común)

• queda demostrada su capacidad de aprendizaje, memoria, etc. en el caso que se quieran realizar pruebas conductuales con ellos

Desventajas del uso de roedores en Psicogenética

• el 20% de genes no compartidos pueden influir en los resultados y hacer que no sean completamente extrapolables a los humanos

• generación de animales artificiales, que no existen en la naturaleza

• aparición de efectos compensatorios no controlados debido a la manipulación de genes

sión de un rasgo en dos o más cepas de una misma especie criadas en el mismo ambien- te observamos diferencias entre las cepas, podemos afirmar que las diferencias se deben a componentes genéticos. Además, comparando los genotipos de estas cepas podemos encontrar variaciones alélicas que expliquen las diferencias fenotípicas observadas.

3.1.2. Estudios a través de mutaciones genéticas espontáneas

La aparición de animales que presentan mutaciones de forma espontánea en su genoma puede ayudar en el estudio de los rasgos o procesos psicobiológicos.

Conociendo el fenotipo normal de los sujetos de una especie podemos detectar aquellos que son portadores de mutaciones. Puede tratarse de alteraciones genéticas que se manifiesten físicamente (ej.: albinismo), alterando los mecanismos fisiológi- cos (ej.: alteraciones en la síntesis de proteínas u hormonas) o traducirse en cambios conductuales (ej.: mayor ansiedad).

Una vez detectada fenotípicamente la mutación, mediante técnicas moleculares pueden detectarse las regiones del genoma mutados e identificar con precisión los genes implicados en el rasgo/proceso que fenotípicamente aparece alterado.

Así, los resultados obtenidos del análisis de animales que presentan mutaciones espontáneas pueden orientarnos en el estudio genético de la conducta, presentando genes candidatos a la regulación de un fenotipo.

3.1.3. Modelos clásicos en Psicogenética: abordaje desde el fenotipo

La investigación en Psicogenética empezó utilizando modelos animales que no implicaban ningún tipo de manipulación genética y que se basan en apareamientos programados. De esta manera se conseguían aislar fenotipos concretos y con ello a los genes asociados a esos fenotipos , por eso se dice que este tipo de abordaje es desde el fenotipo al gen.

Figura 21. La cepa de ratas Wistar es la más dócil, mientras que la cepa Long-Evans es la más agresiva.

Existen dos estrategias metodológicas: : la cría selectiva y las cepas consanguí- neas.

3.1.3.1. Cría selectiva o Selección artificial

Mediante este procedimiento se persigue obtener líneas de animales extremos para una característica fenotípica. En el caso de la Psicogenética, lo más interesante es criar dos líneas opuestas para un rasgo para poder comparar sus genotipos.

Para ello se parte de una población heterogénea, de manera que estén represen- tados todos los genes, la cual se evalúa para el rasgo que quiere estudiar, por ejemplo: la inteligencia. En este caso, y tratándose de roedores, se podrían utilizar un laberin- to de Tolman.

El laberinto de Tolman es un laberinto elevado en el que el roedor es situado en un compartimiento de salida y debe encontrar la meta, en la que obtendrá un refor- zador (normalmente comida). El recorrido es el siempre el mismo, de manera que los animales deben aprenderselo y evitar entrar en los brazos del laberinto que no con- ducen a la meta.

A partir de las puntuaciones obtenidas se escogen aquellos sujetos que tienen puntuaciones más extremas para ese rasgo y se agrupan en función de los resulta-

Figura 22. La gráfica representa el número de errores cometidos en el laberinto de Tolman (entra- das en brazos que no conducen a la meta). La generación 0 es la población de la que se parte. De esta primera generación se escogen los animales con menos errores (grupo de ratas listas) y el grupo de ratas con más errores (ratas torpes), y se aparean los animales de cada grupo entre si. Este procedimiento se repetirá durante diversas generaciones, de forma que en la 20ª generación tenemos dos líneas de ratas con puntuaciones totalmente opuestas en la ejecución del laberinto.

dos en dos grupos opuestos (grupo de animales más listos y grupo de animales más torpes). Una vez hechos los grupos opuestos, se aparean los animales de cada grupo entre ellos. Con las crías nacidas se repite el mismo procedimiento durante genera- ciones sucesivas (unas 20), evitando apareamientos consanguíneos.

Si el rasgo estudiado depende de factores genéticos, después de varias genera- ciones conseguimos fenotipos opuestos en las cepas seleccionadas: una línea de animales extremadamente listos contra una línea de animales extremadamente torpes.

Pese a que se evitan los cruces consanguíneos, los sujetos que pertenecen a la misma línea comparten una homozigosis aproximada del 60% de sus alelos.

Así pues, la cría selectiva es una metodología basada en el fenotipo: se seleccio- na a los animales con puntaciones extremas para un rasgo para crear dos líneas opues- tas para ese fenotipo.

Ventajas de la cría selectiva • la selección hace que los alelos

participantes en un rasgo se acumulen en una cepa y desciendan en la otra • evidencia el grado de determinación

genética de un rasgo (cuánto más aumenta el valor del rasgo seleccionado, más alto es)

• los animales obtenidos pueden ser valiosos para posteriores investigaciones

Desventajas de la cría selectiva • hay que controlar las variaciones

ambientales durante el tiempo que se realiza la selección (nuevas técnicas conductuales, nuevo personal,…), por lo que hay que utilizar con una línea de control (apareamientos sin selección)

Consideraciones de la cría selectiva

• no aparear hermanos entre ellos ya que la endogamia disminuye la fertilidad y la supervivencia

• llegada al techo de la selección (p.e.: hacer una cría basada en la agresividad, llegando a un nivel extremo de agresión que impida el apareamiento)

• si existiera dominancia completa, podrían haber problemas en la selección (pe: en el caso de los genes A y B, el objetivo es llegar a los genotipos AABB y aabb, pero al guiarnos por el fenotipo podemos escoger sujetos AABb, AaBb o AaBB, con lo cual la respuesta a la selección es menor)

• pueden haber diferencias en función de la prueba conductual escogida para realizar la elección (p.e.:no tiene porque ser la misma ansiedad medida con el campo abierto que con la evitación activa)

3.1.3.2. Cepas consanguíneas

Este tipo de cría selectiva pretende obtener sujetos homocigóticos para todos los loci en base a cruzar hermanos entre sí y así, después de sucesivas generaciones, obtener sujetos idénticos tanto genotípicamente como fenotípicamente.

A las cepas consanguíneas también son denominadas cepas inbred (endogámico en inglés), que es un término que se contrapone al de outbred, que indica que los apareamientos se realizan evitando cualquier parentesco genético.

Se parte de una población general y se inician los apareamientos entre hermanos, las crías de estos hermanos se aparean entre ellos, y así sucesivamente, durante apro- ximadamente unas 20 generaciones.

Las diferencias individuales dentro de una cepa se deben a factores ambientales. En cambio, cuando se comparan dos cepas inbred que viven bajo el mismo ambien- te, las diferencias entre éstas ponen de manifiesto influencias genéticas para la con- ducta estudiada.

3.1.3.3. Recombinación de cepas consanguíneas

Se basa en cruzar animales de dos cepas consanguíneas, preferiblemente con feno- tipos opuestos,seguido de unos veinte cruces consanguíneos entre hermanos y her- manas, de forma que los cromosomas se recombinan varias veces, dando lugar a un

Ventajas de las cepas inbred • reducción de la variabilidad

interindividual ya que se trata de sujetos genéticamente idénticos, lo que permite comparar con mayor fiabilidad los resultados de diferentes experimentos (tanto los realizados en diferentes momentos, como en diferentes laboratorios)

• es más fácil detectar las mutaciones • poca variabilidad genética a lo largo del

tiempo

Desventajas de las cepas inbred • no son animales que existan en la

naturaleza, así que no representan genotipos naturales

• la consanguinidad reduce la fertilidad • pueden fijarse genes letales en

homocigosis

Consideraciones de las cepas inbred • son animales más delicados y más sensibles al estrés y a enfermedades • cada cepa inbred es genéticamente única

único patrón de recombinantes de los cromosomas de cada cepa. A partir de la utili- zación de esta técnica se pueden hacer mapas genéticos de la localización de distin- tos genes utilizando enzimas de restricción y polimorfismos genéticos.

3.1.4. Modelos con animales manipulados genéticamente: abordaje desde el genotipo

Las recientes técnicas de manipulación genética han permitido alterar a voluntad el genotipo de los individuos, tanto excluyendo genes, como haciendo que los genes se expre- sen en momentos determinados, como introduciendo genes de una especie en otras. El objetivo de estas manipulaciones es observar cómo afecta la manipulación de un gen con- creto al fenotipo de los sujetos, por eso se trata de un abordaje desde el genotipo. Los ani- males que suelen utilizarse para este tipo de manipulaciones son los ratones (modelos murinos), ya que el genoma de esta especie está ampliamente caracterizado.

Las principales técnicas de manipulación genética utilizadas por la Psicogenética son la eliminación de genes (knock-out) y la introducción de genes de una especie en otra (transgénicos).

3.1.4.1. Animales knock-out

Esta técnica permite inactivar/silenciar la expresión de un gen (gen diana), así se puede observar el efecto de la falta de ese gen en el fenotipo. Experimentalmente se fundamenta en el principio de la recombinación homóloga y en la utilización de células madre embrionarias.

Una vez escogido el gen que se quiere modificar (gen diana), mediante técnicas de ingeniería genética se genera una modificación en alguna de las secuencias del gen objeto de estudio que permita inactivarlo, normalmente se escoge la secuencia corres- pondiente al exón de inicio del gen. Además de la secuencia que inactivará el gen diana, se añaden dos genes más, uno de selección positiva y otro de selección negativa. El gen de selección positiva es un gen resistente a los antibióticos (normalmente el gen Neo, resistente a la neomicina), que se inserta dentro de la zona de recombinación; y el de selección negativa, que suele ser el gen timidina quinasa del virus del herpres (HSV-tk), se sitúa en el extremo de la secuencia, fuera de la zona de recombinación homóloga. Toda esta secuencia manipulada se introduce en un vector, normalmen- te un retrovirus.

Una vez que el vector está preparado, se realiza una extracción de células madre embrionarias (embrionic stem cells), obtenidas de blastocitos de roedores gestantes y mantenidas en cultivo. A estas células se las somete a un choque eléctrico que abri- rá un poro en la membrana celular (electroporación) por el que penetrará el vector.

La secuencia mutada que ha sido introducida por el vector se incorpora a la cadena de ADN de las células embrionarias mediante el proceso de recombinación homólo- ga, produciéndose el reemplazo del gen modificado.

Hay que tener en cuenta que no todas las recombinaciones serán exitosas, por lo que debe comprobarse cuáles de las células son las que han incorporado la secuen- cia del vector. Para ello se aplica el antibiótico para el que se ha introducido la resis- tencia (neomicina) al cultivo de células embrionarias, de manera que morirán aque- llas que no posean el gen resistente (selección positiva), y un agente antivírico (ganciclovir) que eliminará las células hayan incorporado la secuencia vírica (selec- ción negativa). Las células en cultivo que sobrevivirán a los procesos de selección serán aquellas que hayan incorporado en gen mutado y se llaman recombinantes. En este paso pueden utilizarse técnicas de biología molecular para comprobar que real- mente la secuencia que hemos introducido se ha incorporado en las cèlulas que han sobrevivido (Southern, PCR).

En una segunda fase, se microinyectan las células embrionarias recombinantes en embriones de ratón de un color diferente al de la hembra de la que se extrajeron las células embrionarias (p.e.: si la hembra donante de las células embrionarias es marrón, los embriones pueden proceder de una hembra negra). Estos embriones se implan- tan en hembras pseudopreñadas de un color diferente a las anteriores (pe: blanca).

Las crías que nazcan estarán formadas por los dos tipos de células (células embrionarias manipuladas y células embrionarias sin manipular) y se llaman qui- meras, es fácil identificarlas por su pelaje (en este caso, mitad marrón, mitad negro). De todas formas debe confirmarse el genotipo mediante técnicas de biología mole- cular, analizando una muestra de células obtenidas de la cola.

Figura 23. Las células en las que se haya producido la recombinación con éxito poseerán el gen diana modificado y el gen de la resistencia al antibiótico (selección positiva), y habrán perdido la secuencia del gen de la HSV-tk (selección negativa)

El último paso consiste en establecer una línea de knock-out. Para ello, se inicia- rá un primer apareamiento entre las quimeras y ratones de la cepa de la cual se han

obtenido los blastocitos (en nuestro ejemplo, de color negro). Las crías nacidas de este cruce que sean de color marrón serán las que porten el gen modificado (hay que tener en cuenta que en esta primera generación sólo un 50% de las crías de las qui- meras serán recombinantes). Estos animales se aparearán entre sí para llegar a gene- rar una cepa de animales en que toda la descendencia posea el gen diana inactivado. Así pues, en los animales knock-out se introduce una manipulación genética que inactiva la expresión de un gen, así nos permite estudiar el efecto de su eliminación sobre el fenotipo.

Figura 24. Ratón quimera.

Ventajas de los knock out • permite estudiar la aportación de un gen

al fenotipo

• creación de una línea de animales genéticamente similares con el gen silenciado

Desventajas de los knock out • es un proceso largo, sólo la segunda

parte del proceso puede durar unos 5-8 meses

• es un proceso costoso económicamente • son animales delicados, que suelen ser

menos fértiles Consideraciones de los knock out

• debido a que se produce la inactivación de forma prenatal pueden producirse efectos compensatorios de otros genes

• puede que la inactivación del gen sea letal y que los embriones no sean viables o mueran a las pocas horas/días después del nacimiento

3.1.4.2. Animales transgénicos

La creación de organismos transgénicos consiste en introducir un gen de una espe- cie (p.e.: humana) en el genoma de otra especie (p.e.: ratones). De esta forma se puede aislar y caracterizar la expresión de ese gen, lo que facilita el estudio de su participa- ción en la expresión de rasgos y enfermedades, así como sus mecanismos de actua- ción. Además, pueden utilizarse estos animales para probar nuevos agentes terapéu- ticos.

En este caso la inserción del gen no está dirigida como en los knock-out si no que se produce de forma aleatoria.

En una primera fase se aísla la secuencia de ADN que contiene el gen objeto de estudio, llamado transgen. Mediante técnicas de manipulación genética se añade a esta secuencia un promotor propio de la especie a la que vamos a inyectar el trans- gen para garantizar la expresión génica. Aunque esta secuencia de ADN modificada puede introducirse en el genoma del receptor a través de la infección de células madre embrionarias (igual que en los knock-out), la técnica más utilizada y eficaz es inyec- tar la secuencia directamente en óvulos fecundados, concretamente en el pronúcleo masculino.

Los embriones/óvulos inyectados serán implantados en hembras pseudopreñadas, en las que se desarrollarán. Una vez nacidas las crías hay que comprobar cuáles han incluido la secuencia de ADN en el genoma. Para ello se genotiparán las crías anali- zando una muestra de células extraídas de la cola.

Figura 26. Esquema de la creación de un animal transgénico a partir la inyección del transgen en óvulos fecundados.

Con aquellos individuos que hayan incorporado el transgen se iniciará una serie de apareamientos programados siguiendo el procedimiento de cría inbred con el obje- tivo de crear una línea de animales que presente el transgen (se requieren al menos 10 generaciones).

Así los animales transgénicos se introduce un gen de otra especie para poder estu- diar de forma controlada su expresión y poder caracterizar sus mecanismos y probar nuevos agentes terapéuticos en ellos.

3.1.4.3. Otros procedimientos de manipulación genética en animales

A continuación se comentarán otras técnicas de manipulación genética que per- miten solventar algunos de los problemas que aparecen en los knock-out.

3.1.4.3.1. Animales knock-out inducidos

Para solventar el problema de silenciar genes vitales para el desarrollo se ha des- arrollado la técnica de los knock-out inducidos. Esta técnica permite silenciar el gen después de la etapa el desarrollo, cuando la inactivación del gen no es letal.

Se basa en la misma metodología que los knock-out pero añadiendo un gen pro- motor en la secuencia manipulada que se activa por una sustancia (factor de trascrip-