BIBLIOGRAPHY

El análisis e identificación de microorganismos ha experimentado un notable avance en los últimos años, ligado al desarrollo de las técnicas de biología molecular. La sencillez y reproducibilidad de estas técnicas, ha permitido sustituir o complementar las técnicas tradicionales de microbiología clásica, basadas fundamentalmente en el aislamiento de microorganismos en medios de cultivo y posterior identificación mediante pruebas bioquímicas, por otras que se basan fundamentalmente en el análisis de algunas de las macromoléculas (ADN, ARN, proteínas) de los microorganismos o de las comunidades microbianas (Escalante, 2007).

El interés en la búsqueda de medios para el estudio de la diversidad microbiana ha crecido enormemente desde 1975. La gran mayoría de ellos está enfocada a la caracterización de los microorganismos, estando la mitad de ellos basados en el análisis de DNA total, o de secuencias objetivo de DNA (Morris et al., 2002).

Más de la mitad de los estudios realizados en los últimos 25 años han estado enfocados al estudio del efecto de factores ambientales específicos en la biodiversidad, con el fin de medir cambios sobre la biodiversidad en el tiempo y el espacio, o para comparar la similitud de una población en un sitio dado, con el de esa población en presencia de una fuente de contaminación. Estos objetivos son paralelos a otros, como lo es el estudio del efecto de los fertilizantes en los cultivos o en la actividad microbiana, o el estudio de la densidad de población en relación a la distancia a una refinería (Morris et al., 2002).

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Teóricamente, es posible definir como "marcador" biológico cualquier característica heredable que permita estudiar la diversidad genética. Hasta hace algunos años, la mayoría de los "marcadores" que se utilizaban eran caracteres morfológicos (fenotípicos); sin embargo, con el advenimiento de las técnicas de estudio del material genético desarrolladas a partir del descubrimiento de la estructura del DNA en 1953, y el incremento de su uso en forma explosiva durante la última década, la tendencia actual es de definir un grupo de marcadores genéticos (preferentemente cromosómicos) que permitan generalizar los estudios de diversidad y variabilidad del material genético y, en consecuencia, de las poblaciones bacterianas (Contreras-Moreira et al., 2008).

Para el análisis de marcadores de DNA se usan diferentes métodos que se pueden agrupar de manera muy general en dos categorías. La primera categoría integra las técnicas fundamentadas en la hibridación DNA/DNA y la segunda categoría, la cual contiene el mayor número de técnicas, agrupa a las metodologías que se basan en la Reacción de Polimerización en Cadena (PCR, por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction).

2.7.1 Análisis de secuencias del 16S rDNA

Los genes del RNA ribosomal (rDNA) han contribuido ampliamente al estudio y percepción de la ecología microbiana, la diversidad y la evolución. Los ortólogos de genes de rRNA se encuentran en cada organismo viviente, y participan como componentes de los ribosomas, responsables de la síntesis de polipéptidos. Se sabe que los dominios dentro de los genes ribosomales y/u operones evolucionan a diferentes velocidades, permitiendo los análisis filogenéticos en varios niveles de resolución taxonómica, de manera que las diferentes regiones de los operones ribosomales han sido blanco para análisis de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) de diversos grupos bacterianos. La estructura del operón rDNA (rrn) de

los procariontes incluye los genes rRNA, rrf, rrs y rrl, que codifican para la molécula

estructural de rRNA requerida para el ensamble y función (rRNA: 5S, 16S y 23S respectivamente) (Rademaker et al., 2005).

El RNA ribosomal 16S es un polirribunucleótido codificado por el gen rrs también

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información filogenética y taxonómica. Como de cualquier secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, la cadena de DNA del gen 16S rDNA se pliega en una estructura secundaria, caracterizada por la presencia de segmentos de doble cadena, alternando con regiones de cadena sencilla, lo que confiere a los rRNAs estructuras secundarias altamente conservadas que permiten el alineamiento de secuencias de rRNA de taxa lejanamente relacionadas (Rodicio y Mendoza, 2004). Su transmisión es principalmente vertical y se considera que es muy limitada la transferencia génica horizontal entre microorganismos. La longitud de su secuencia tiene un tamaño adecuado para proporcionar suficiente información y permite realizar reconstrucciones filogenéticas de los microorganismos (Rodicio y Mendoza, 2004; Nogales, 2005).

El análisis de la secuencia de los genes 16S rDNA de distintos grupos filogenéticos reveló la presencia de una o más secuencias características que se denominan oligonucleótidos firma, las cuales se tratan de secuencias específicas cortas que aparecen, o no, en la mayor parte de un grupo filogenético determinado, por lo que los oligonucleótidos pueden utilizarse para ubicar a cada bacteria en un grupo (Rodicio y Mendoza, 2004).

La comparación de las secuencias del gen 16S rDNA es una herramienta poderosa para inferir la filogenia (evolución y relación) entre bacterias.

La identificación basada en la secuencia del gen 16S rDNA en los laboratorios microbiológicos se ha expandido hacia el estudio de organismos cuya identificación por métodos fenotípicos resulta imposible o muy difícil, como es el caso de bacterias no cultivables, hecho que en ocasiones ha conducido a la descripción de nuevos microorganismos (Rodicio y Mendoza, 2004).

Por otro lado, el análisis de restricción de amplificados del DNA ribosomal 16S (ARDRA) es una alternativa para buscar información filogenética y taxonómica que encierra el gen 16S rDNA, con base en un análisis de los perfiles electroforéticos obtenidos después de la digestión del amplificado con enzimas de restricción. La relación matemática entre el número de los sitios compartidos por la enzima de restricción y los amplificados del DNA es lo que determina la divergencia genética. El ARDRA ha sido reportado por muchos autores como una herramienta para estudios de ecología microbiana, para estudios de diversidad de poblaciones del suelo, e incluso

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dirigidas a poblaciones de interés, como lo es el caso de los fijadores de nitrógeno (Aquilanti et al., 2004; Ben-Dow et al., 2006; Case et al., 2007). Sin embargo, un punto

crítico de este análisis es la correcta identificación de las enzimas para una caracterización adecuada.