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Daphnia Magna es un invertebrado, perteneciente a los crustáceos, del suborden

Diplostracos o Cladocera, género Daphnia, especie Daphnia Magna. Es una de las especies más conocida de cladóceros. El tamaño de los crustáceos es aproximadamente 1 mm, lo que dificulta su observación visual. Su hábitat natural son aguas ricas en sustancias nutritivas, como lagos y estanques. Se alimenta de algas, detritus y bacterias que filtra previamente. En cuanto a su morfología, se caracterizan por tener un caparazón que protege el tronco, y presentar en la cabeza unas potentes antenas, responsables de la locomoción, desarrollando un movimiento vertical y espasmódico. En la figura 2.4.1 se muestra una fotografía realizada mediante microscopio electrónico acoplado a una cámara DCA (Dispositivo de Carga Acoplada), del crustáceo Daphnia Magna.

Figura 2.4.1. Fotografías de crustáceos de la especie Daphnia magna

La presencia de agentes tóxicos en el medio puede afectar al sistema nervioso o digestivo de estos crustáceos, que se manifiestan en su capacidad de movilidad. La toxicidad

aguda se determinó evaluando los diferentes efectos observados tras la exposición de los crustáceos a diferentes concentraciones de sustancias tóxicas.

Reactivos, material e instrumentación.

- Kit DaphtoxkitTM de Trademark Products de CREASEL BVBA, (Deinze, Bélgica). Permite la evaluación de la toxicidad de vertidos, residuos o sustancias químicas en agua dulce, utilizando los individuos neonatos de Daphnia magna desarrollados en 3 o 4 días a partir de su forma de resistencia (efipias), obtenidos mediante un ciclo de producción partenogenética. El kit (Figura 2.4.2) contiene los siguientes reactivos: ¾ Efipias de Daphnia magna, huevos uniformes protegidos por una cápsula quitinosa

denominada efipium. En esta forma latente pueden mantenerse durante largos períodos de tiempo, sin pérdida de viabilidad. En condiciones ambientales óptimas son capaces de generar los neonatos, en un período de 3 o 4 días.

¾ Los neonatos son los dáfnidos utilizados en el bioensayo de toxicidad. Las efipias han de estar protegidas de la luz y mantenida a una temperatura de 4ºC hasta su utilización para el bioensayo.

¾ Soluciones concentradas de sales: NaHCO3, CaCl2, MgSO4, KCl, para la preparación del medio de ubicación y para la preparación de las diluciones de sustancias tóxicas a analizar.

¾ Spirulina, es una alga utilizada como nutriente de los neonatos. Este alga es suministrada en forma deshidratada para su mejor conservación.

- Placas petri de 10 cm de diámetro para la incubación de las efipias. Las placas han de ser grandes para que el volumen de medio cultivo sea mayor, e impida un deterioro en la calidad del medio debido a la producción de metabolitos y al gran consumo de oxígeno disuelto en el medio por parte de los neonatos, durante la eclosión de los huevos. Un deterioro en la calidad del medio provocaría el estrés y el debilitamiento de los organismos.

- Placas de poliestireno de 30 pocillos para desarrollar el análisis de toxicidad.

- Bandas de Parafilm, para cubrir las placas de pocillos y minimizar la posible evaporación de las diluciones de muestras, durante el período de incubación.

- Pipetas Pasteur, para la transferencia de los neonatos a las placas de análisis.

- Micro-tamiz, de 100 μ de malla, para el lavado de las efipias y preconcentración de los organismos.

- Incubador, estufa refrigerada de 4 - 40ºC. - Lupa de aumento.

Figura 2.4.2. DaphtoxkitTM_{, bioensayo basado en la movilidad de Daphnia magna}

Procedimiento:

1.- Incubación de efipias: el cultivo se inicia 3 o 4 días antes de comenzar el bioensayo. Las efipias se lavan con agua del grifo para eliminar las trazas del medio de conservación, para ello se utiliza un micro-tamiz que permite su retención y lavado.

Una vez lavadas, se incorporan en el medio de incubación (40-50 mL), en placas petri. El medio de incubación se prepara por dilución de las soluciones concentradas de las sales, explicadas anteriormente, en agua destilada y se airea intensamente mediante agitación, durante al menos 30 minutos, para disminuir el riesgo de anoxias. Las placas petri se cubren para evitar procesos de evaporación y se incuban las efipias durante 3 o 4 días a 20 ºC y en condiciones de luminosidad constante de 6000 lux. El medio de incubación se renueva cada 24 horas, utilizando el tamiz para evitar la pérdida de los organismos.

El período de incubación no es sincrónico y depende, entre otros factores, de la edad de la efipia. Algunos huevos de Daphnia pueden eclosionar antes de los tres primeros días de incubación, mientras que otros lo pueden hacer a las 94 o más horas.

Los organismos nacidos antes de los tres días se desecharon. Si después de los tres primeros días de incubación (84-88 horas) el número de eclosiones es suficientemente elevado como para realizar el test completo, éste puede adelantarse y no esperar al cuarto día.

2.- Preparación de las muestras: se lleva a cabo mediante filtración de las mismas por 0.22 μm. En las muestras de los tratamientos con foto-Fenton es necesaria la eliminación del H₂O₂ por su toxicidad para estos organismos y para parar la reacción de Fenton en la oscuridad. Para ello se utiliza el método de la catalasa explicado con detalle en el apartado 2.2.7. Si fueron necesarias diluciones de estas muestras se preparan en el medio de cultivo, antes de llenar los 5 pocillos de las placas de análisis (ver punto 5).

3.- Se seleccionan las muestras más adecuadas para realizar los tests de una serie de muestras seleccionadas de entre todas las tomadas en cada tratamiento fotocatalítico.

4.- Proceso de nutrición de los organismos: Los neonatos de Daphnia consumen sus reservas internas de nutrientes rápidamente, debido a su elevada actividad metabólica. Por este motivo, dos horas antes de comenzar el test de toxicidad se alimentan los neonatos con algas (Spirulina). Esta alimentación ayuda a disminuir el porcentaje de muerte por inanición (a veces, superior al 10%). Las algas se suministran en forma liofilizadas y para que puedan ser consumidas como nutrientes por los neonatos, se hidratan por adición de medio de cultivo.

5.- Transferencia de las larvas neonatas a las placas de análisis (placas de pocillos): Cada placa de pocillos tiene 6 líneas de pocillos iguales. Cada línea de las placas de pocillos contiene 1 “pocillo de lavado” y 4 “pocillos de análisis”, para una evaluación estadística aceptable de los efectos (análisis por cuadruplicado). Cada uno de estos 5 pocillos se llena con 10 mL de muestra.

La transferencia de los neonatos activos desde la placa de incubación se realiza mediante succión con pipeta pasteur provista de una goma, de forma que al ejercer una presión adecuada sobre ésta, se produce la succión de los neonatos. De esta forma, poco a

poco se transfieren 20 neonatos a cada uno de los “pocillos de lavado”. A continuación, se realiza la transferencia de 5 neonatos desde el “pocillo de lavado” a cada uno de los 4 pocillos réplicas. De esta forma se previene la dilución de las muestras, debida a la succión conjunta de los organismos y del medio de cultivo, ya que la única posible dilución adicional ocurriría en el “pocillo de lavado” debido a la adición de los 20 neonatos conjuntamente con una pequeña cantidad de medio de cultivo. Las daphnias quedan con facilidad atrapadas en la superficie del medio líquido debido a fenómenos de tensión superficial. Los organismos sobrenadantes mueren rápidamente y pueden alterar el resultado del ensayo. Por ello, para evitar este fenómeno, se coloca la punta de la pipeta en el interior del medio antes de depositar los organismos en los pocillos y nunca se arrojan mediante goteo sobre la superficie. Si después de estas precauciones se producen fenómenos de atrapamiento de los dáfnidos en la superficie del medio, estos fenómenos se pueden corregir añadiendo unos granos de acetil-alcohol (tensioactivo no tóxico) durante unos minutos en cada pocillo.

Figura 2.4.3. Fotografía de las placas de pocillos para medidas de toxicidad aguda con Daphnia Magna.

Debido al pequeño tamaño de los neonatos, la transferencia se realiza con la ayuda de una lupa, además de una superficie oscura (negra) sobre la que se coloca la placa de análisis, para aumentar el contraste y facilitar la observación visual de los organismos.

6.- Incubación. Se cubre la placa de análisis con una banda de Parafilm y se coloca la tapadera de la placa para evitar fenómenos de evaporación de las muestras de análisis. La incubación se lleva a cabo en oscuridad y a una temperatura de 20 ºC, durante 24 y 48 horas.

7.- Finalizado el período de incubación, se procede a realizar la lectura a las 24 y 48 horas respectivamente. La lectura se efectúa mediante la observación y recuento del número de organismos inmovilizados frente al número de organismos móviles. Los organismos son considerados inmovilizados si después de 15 segundos de observación, éstos no desarrollan movimiento alguno de locomoción y permanecen en el fondo del pocillo.

Test de referencia:

Para comprobar la correcta ejecución del bioensayo en términos de sensibilidad de los organismos, así como de obtención de una respuesta homogénea, se desarrolla una evaluación de la respuesta de los dáfnidos frente a un control negativo y a un control positivo.

El control negativo corresponde con la exposición de los dáfnidos al medio de cultivo y el control positivo corresponde con la exposición de los dáfnidos a una sustancia tóxica de referencia, en este caso, el dicromato potásico. El valor de EC50 a las 24 horas de exposición, para el dicromato potásico debe ser de 1.0 mg/L y con unos límites de confianza al 95 % de 0.7 a 1.3 mg/L. El valor de EC50 a las 48 horas de exposición, debe ser 0.8 mg/L y con unos límites de confianza al 95 % de 0.6 a 1.0 mg/L: Para que el bioensayo sea válido, de acuerdo con el protocolo ISO 6341, la inmovilización en el control negativo no debe exceder al 10 %.

Evaluación de los resultados

La toxicidad aguda se evalúa mediante la exposición de los dáfnidos a diferentes diluciones de las muestras de los tratamientos de degradación de los contaminantes y determinación de los efectos tóxicos generados basados en la movilidad desarrollada por los dáfnidos. Los parámetros de toxicidad que se determinan son la concentración efectiva o EC50 y la menor concentración que produce un efecto observable o LOEC.

El EC50 es la concentración efectiva de agente tóxico que reduce la movilidad del 50 % de los organismos después de 24 o 48 horas de exposición. El EC₅₀ se determina mediante interpolación gráfica, en la relación establecida entre el efecto inhibitorio expresado en términos de porcentaje de inmovilidad y las concentraciones causantes de dichos efectos. Para este bioensayo, el LOEC se establece como la concentración de agente tóxico que produce un efecto inhibitorio de un 10 % en la respuesta biológica estudiada (movilidad).

2.4.2. Bioensayo basado en la actividad bioluminiscente de la bacteria Vibrio Fischeri