Plantas de jitomate se cultivaron en el invernadero durante la temporada de verano de tres años consecutivos (Figura 16). En comparación con el cultivo orgánico, el manejo convencional produjo frutos más grandes (Figura 16d) y se consiguió un rendimiento de frutos de 17% más alto en base al peso fresco (Figura 16a). Los jitomates convencionales eran más grandes y más pesados debido a su mayor contenido relativo de agua. El porcentaje de materia seca fue consistentemente mayor en las frutas cultivadas orgánicamente (Figura 16c), lo que llevó a un 24% más de peso seco por planta (Figura 16b). En el mercado, los cultivos se pagan tomando como referencia el peso fresco, no por el peso seco, por lo que es común que los productores se enfoquen en aumentar este rendimiento sin considerar el peso seco o aporte nutricional de su producción.
Figura 16. Rendimiento del fruto del jitomate cherry cultivado bajo manejo orgánico o convencional. (a) Peso fresco. (b) Peso seco. (c) Porcentaje de peso seco en fruta (n = 9). (d) Tamaño de las frutas recolectadas en 2016. Las letras indican diferencias significativas (p=0.05) en
prueba Tukey.
Los principales metabolitos primarios de las frutas se analizaron mediante ensayos dirigidos que involucraban reacciones acopladas enzimáticas en formato de microplaca (Sección 5.4.2 Determinación de azúcares). Como se esperaba, los frutos de jitomate mostraron una alta actividad de invertasa, y los niveles de hexosa fueron mucho más altos (~ 6 veces) que los niveles de sacarosa (Figura 17). La fructosa también fue 30% más alta que la glucosa (Figura 17). Sobre la base del peso seco, no se encontraron diferencias significativas a lo largo de los años y entre los tratamientos para la glucosa (Figura 17a), fructosa (Figura 17b), sacarosa (Figura 17c) y niveles de aminoácidos totales (Figura 17d). Estos resultados sugieren que la posible distinción entre jitomates orgánicos y convencionales probablemente no se deba a un contenido variable de azúcares solubles o aminoácidos en base al peso seco.
Figura 17 Análisis de carbohidratos (glucosa, fructosa y sacarosa) y aminoácidos totales de muestras de frutos de jitomate cultivados bajo manejos agronómicos Orgánicos y Convencionales
durante 3 años consecutivos (2014, 2015 y 2016).
Los extractos de los frutos de jitomate se analizaron con DIESI-MS con el fin de obtener sus huellas ionómicas representativas (enfoque no dirigido). Las muestras de los tres años se
consideraron como réplicas biológicas independientes para el análisis de la varianza (AOV) utilizando el software R. Se detectó un total de 1,647 señales mz en el espacio metabólico (rango -2,000 Da a 2,000 Da), de los cuales 619 fueron negativos y 1,028 iones positivos (Figura 18). Se detectaron diferencias significativas (p <0,001) para el 54% de los iones negativos y el 27% de los iones positivos (Figura 18). El manejo orgánico llevó a un aumento de 547 iones positivos y 145 negativos, mientras que 12 iones positivos y 21 negativos disminuyeron (p <0,001) en comparación con el cultivo convencional (Figura 18).
Figura 18 Iones positivos y negativos con comportamiento diferencial estadísticamente significativo entre muestras cultivadas bajo manejo agronómico orgánico y convencional. Entre menor es el
valor p, mayor es la significancia de esos iones.
El análisis de heatmap bicluster mediante correlación como función de distancia agrupó las muestras de los tres años de acuerdo con la práctica de cultivo orgánico (ORG) y convencional (CON). En la Figura 19 se muestra un heatmap representativo con los datos de las señales mz más intensas de 1-51. El dendrograma superior reveló dos ramas grandes que distinguen las muestras de ORG y CON (Figura 19). Los iones con relación de carga de masa (mz) 301.3, mz 204.3 y mz 203.3 fueron más abundantes en las muestras CON, mientras que
otros iones como mz 104.3, 105.3, 87.3, 86.3 y 72.3 fueron más intensos en las muestras ORG (Figura 19). Otros heatmaps de datos en escala logarítmica de señales de masa carga (mz) menos intensas también confirmaron la presencia de dos ramas grandes de dendrogramas que distinguieron las muestras ORG y CON.
Figura 19 Heatmap Bicluster de las 50 señales de iones DIESI-MS más intensas. (CON) para manejo convencional, (ORG) para manejo orgánico, (2014), (2015) y (2016) para el año de
cosecha, y (01), (02) y (03) para la repetición biológica. n = 6.
Los gráficos de caja y bigote (boxplots) de las señales mz abundantes y representativas mostraron algunos iones que aparecieron solo en un tipo de muestras (Figura 20). Por ejemplo, iones negativos como mz -649.39, mz -535.32 y mz -342.25 estaban presentes en
las muestras de ORG (Figura 20a-c), mientras que iones como mz 140.07, mz -235.25 y mz 482.37 estaban presentes en el CON pero ausente de las muestras de ORG (Figura 20d-f). Dichas señales mz podrían considerarse biomarcadores para manejo agronómico de jitomate. La variabilidad metabólica entre las muestras repetidas indica que, en lugar de depender de iones individuales para la clasificación de la muestra, fue estadísticamente más robusto considerar el conjunto completo de iones positivos y negativos. Por lo general, los iones más intensos se seleccionan para el trazado de heatmaps y el análisis de agrupamiento (Figura 19), pero encontramos que algunas señales mz abundantes representaban un tipo de solvente, picos atmosféricos y mecánicos, y se volvieron menos útiles para la correcta discriminación de las muestras. Los picos mz abundantes disminuyeron el poder discriminatorio de las huellas de DIESI-MS en comparación con las plataformas de LC-MS convencionales para el perfilado metabólico.
Figura 20 Boxplots de los iones más selectivos de acuerdo con las señales de iones DIESI-MS. (a) mz=649.39 con ionización negativa. (b) mz=535.32 con ionización negativa. (c) mz=342.25 con
ionización negativa. (d) mz=140.07 con ionización positiva. (e) mz=235.25 con ionización negativa. (f) mz= 482.37 con ionización positiva. (CON) para manejo convencional (ORG) para manejo
orgánico, (2014), (2015) y (2016) para el año de cosecha y (01), (02) y (03) para la repetición biológica. n = 6.
Los datos de elución en el tiempo generados por los cromatogramas LC-MS generalmente permiten compensar tales problemas de ionización, ya que los artefactos de la máquina y del disolvente no forman picos de elución cromatográficos estrechos. A pesar de la alta intensidad, debido a que son constitutivas, tales señales mz se consideran una línea de base en los experimentos LC-MS, mientras que en el flujo de trabajo DIESI-MS, a veces se requiere la curación manual de señales mz específicas para determinadas combinaciones de disolvente y muestra. Por lo tanto, en lugar de centrarse únicamente en las señales más intensas, para el análisis DIESI-MS es mejor explorar todo el espacio metabólico, incluidos los iones positivos y negativos de baja abundancia. Los umbrales están mejor definidos por las estadísticas que por las intensidades absolutas. Por lo tanto, adquirimos rutinariamente 6 réplicas técnicas de cada muestra, ejecutamos análisis de varianza y utilizamos datos transformados de registro para trazar todos los heatmaps.
El cultivo orgánico frente al cultivo convencional en el invernadero incluyó procedimientos de fertilización diferentes y distintos tratamientos con pesticidas químicos. Por lo tanto, se realizaron experimentos de invernadero adicionales para establecer las causas de estos cambios.
6.4. Experimento “Fertilizantes”
Las plantas de jitomate cherry se cultivaron suministrando cuatro fuentes diferentes de nitrógeno como fertilizantes (Sección 5.1.4 Experimento “Fertilizantes”). En comparación con el tratamiento de control (sin nitrógeno aplicado), los cuatro tratamientos con fertilizantes aplicados [Composta Orgánica certificada (COMP), sulfato de amonio (NH4SO4), nitrato de potasio (KNO3) y urea (UREA)] dieron lugar a un rendimiento de fruta estadísticamente mayor en base al peso fresco (Figura 21a). Se obtuvieron resultados fenotípicos similares a los de los experimentos ORG vs CON anteriores; por ejemplo, el porcentaje de materia seca fue mayor en las frutas cultivadas orgánicamente (Figura 21c), lo que llevó a un mayor peso seco de la fruta por planta (Figura 21b). El hecho de que tanto en las mediciones de peso
fresco como peso seco (Figura 21a-b) los valores se mantuvieran superiores al control, indica que bajo ninguno de estos tratamientos las plantas experimentaron un estrés por falta de nitrógeno.
Figura 21 Comparación de (a) rendimiento de fruto en peso fresco y (b) en peso seco bajo diferentes tratamientos de fertilización. (c) Porcentaje de peso seco en la fruta para cada tratamiento de fertilización. n = 9. Turquesa= Control (CONT), Verde= composta (COMP), Rojo= sulfato de
amonio (AMMO), Rosa= nitrato de potasio (NITR), Azul= urea (UREA) n = 6.
Se detectó un total de 2,935 señales mz en el espacio metabólico (rango -2,000 Da a 2,000 Da), de los cuales 945 fueron positivos y 1,990 iones negativos (Figura 22). Se detectaron diferencias significativas (p <0.001) para el 78% de los iones positivos y el 57% de los iones negativos (Figura 22). La fertilización con composta (orgánico) condujo a un aumento de 285 iones positivos y 424 negativos (Figura 22). La fertilización con NH4SO4 condujo a un aumento de 310 iones positivos y 32 negativos (Figura 22). La fertilización con NO3 condujo a un aumento de 91 iones positivos pero no negativos (Figura 22).
Figura 22 Iones positivos y negativos con comportamiento diferencial estadísticamente significativo entre muestras cultivadas bajo distintos fertilizantes. Entre menor es el valor p, mayor es la
significancia de esos iones.
El análisis de similitud de huellas metabolómicas agrupó las muestras según el tratamiento del fertilizante. En la Figura 23 se muestra un heatmap representativo con 50 de las señales mz más intensas (de 10 a 60). El dendrograma superior reveló dos ramas grandes que distinguieron el control de todos los otros tratamientos de fertilizantes (Figura 23). Entre los
diferentes tratamientos con fertilizantes, las muestras de composta (COMP) se agruparon más cerca de las muestras de urea (UREA) en el dendrograma.
Figura 23 Heatmap de las 50 señales de iones DIESI-MS más intensas. Control (CONT), composta (COMP), sulfato de smonio (AMMO), nitrato de potasio (NITR), urea (UREA). (01), (02) y (03) repeticiones biológicas de 2015, (04), (05) y (06) repeticiones biológicas de 2016, (07), (08) y (09)
repeticiones biológicas de 2017. n = 6.
Algunos iones (por ejemplo, mz 69.3, mz 45.3, mz 85.3, mz 57.3, mz 99.3, mz 26.3 y mz 31.3) fueron más abundantes en las muestras de control (CONT) y menos abundantes en los cuatro tratamientos de fertilización (Figura 23 derecha). Estos iones pueden reflejar un estado
metabólico estable debido a la falta de nitrógeno. Otros iones como mz 116.3, mz 130.3, mz 381.3, mz 382.3, mz 87.3, mz 86.3, mz 175.3 y mz 182.3 fueron más intensos en las muestras de composta (COMP) y menos abundantes en el control (CONT), urea (UREA) y nitrato (NITR) (Figura 23). Estos iones pueden reflejar el tipo de fuente de nitrógeno proveniente de un fertilizante químico u orgánico.
Los gráficos boxplot de señales mz abundantes altas y bajas representativas mostraron algunos iones biomarcadores que aparecieron solo en un tipo de muestras. Por ejemplo, los iones negativos tales como mz -568.15 y mz -574.25 aparecieron solo en plantas limitadas con nitrógeno (CONT) y estuvieron ausentes en los otros tratamientos (Figura 24cd). En el sulfato de amonio (AMMO) se detectó un aumento del ion mz 237.14 (Figura 24a), el tratamiento de composta se caracterizó por el aumento del ion mz 382.22 (Figura 24b), el nitrato de potasio se caracterizó por el ion mz 479.4 (Figura 24e), mientras que el tratamiento de la urea se caracterizó por un aumento de mz -187.12 (Figura 24f).
Figura 24 Boxplots de los iones más selectivos según el tratamiento de las señales de iones DIESI- MS. (a) mz= 237.14 con ionización positiva. (b) mz= 382.22 con ionización positiva. (c) mz=574.25 con ionización negativa. (d) mz= 568.15 con ionización negativa. (e) mz= 479.4 con ionización positiva. (f) mz= 187.12 con ionización negativa. Turquesa= Control (CONT), Verde=
composta (COMP), Rojo= sulfato de amonio (AMMO), Rosa= nitrato de potasio (NITR), Azul= urea (UREA). (01), (02) y (03) repeticiones biológicas de 2015, (04), (05) y (06) repeticiones
El promedio de todas las réplicas biológicas permitió simplificar los diagramas de boxplot iones biomarcadores (Figura 25). Por ejemplo, el tratamiento con sulfato de amonio se caracterizó por el ion mz=317.29 (Figura 25a), el tratamiento de composta se caracterizó por el ion mz=182.17 (Figura 25b), el tratamiento control se caracterizó por los iones mz=41.02 y mz=-44.99 (Figura 25c-d), el nitrato de potasio se caracterizó por el ion mz=479.4 (Figura 25e), mientras que el tratamiento con urea se caracterizó por iones mz=203.14 (Figura 25f).
Figura 25 Boxplots de los iones más selectivos según el tratamiento de las señales de iones DIESI- MS. (a) mz= 317.29 con ionización positiva. (b) mz= 182.17 con ionización positiva. (c) mz= 41.02
con ionización positiva. (d) mz= 44.99 con ionización negativa. (e) mz= 479.4 con ionización positiva. (f) mz= 203.14 con ionización positiva. Turquesa= Control (CONT), Verde= composta
(COMP), Rojo= sulfato de amonio (AMMO), Rosa= nitrato de potasio (NITR), Azul= urea (UREA). n=54.
Además del análisis de varianza (AOV), también aplicamos un enfoque de inteligencia artificial utilizando un algoritmo de Random Forest en R. Esto permitió generar varias listas de iones con su respectivo índice de GINI e importancia variable. La ventaja del Random Forest es que permitió construir un modelo predictivo para la clasificación de muestras desconocidas para experimentos futuros. Sin embargo, el análisis de AOV personalizado seleccionó iones que produjeron figuras de boxplots visualmente más entendibles y que se
podrían interpretar de manera más intuitiva (Figura 24, Figura 25). En lugar de depender de pocos iones biomarcadores, se puede obtener la mejor discriminación de las muestras seleccionando los iones más significativos independientemente de la intensidad de la señal. Se construyó una figura de heatmap, cuyos datos de iones biomarcadores preseleccionados muestran, por ejemplo, un grupo principal de iones que eran bajos en condiciones de control y luego aumentaron debido al abundante suministro de nitrógeno (Figura 26; efecto de N alto). Algunos iones aumentaron en las muestras de AMMO y NITR, mientras que otros fueron bajos en las muestras de NITR y UREA. Curiosamente, algunos iones fueron específicos para los tres fertilizantes químicos y se mantuvieron bajos en los tratamientos de control y composta (Figura 26).
Figura 26 Heatmap de las señales de iones DIESI-MS identificadas como las más representativas por su potencial como marcadores metabolómicos (MarkerIons). Control (CONT), composta
Con la intención de profundizar la búsqueda de iones con potencial para discriminar entre frutos cultivados bajo diferentes condiciones de fertilización, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) (Figura 27). En esta figura se puede observar que se generó un grupo muy claro de puntos provenientes del tratamiento control (CONT); al tratarse de una condición de estrés para la planta por la baja disponibilidad de nitrógeno, era de esperarse un cambio importante en el metabolismo de la planta. Por otro lado, no fue posible distinguir por tipo de fertilizante al resto de los tratamientos.
Figura 27 Análisis de componentes principales (PCA) Control (CONT), composta (COMP), sulfato de amonio (SULF), nitrato de potasio (NITR), urea (UREA). n = 54.