Chapter 7. Vanishing Point: The Loop as Narrative System 7.0 Vanishing Point
7.4. Closing the Loop: Providing a Posthuman Context
Se han descrito una gran variedad de proteínas que mediante su interacción con Akt actúan como moduladores de su actividad más que de sustratos [206]. En la figura R.18 se detallan gran parte de estos cofactores de Akt y el efecto que tienen sobre su actividad.
Figura R.18 Listado de diferentes proteínas que interaccionan con Akt y modulan su actividad. http://www.cellsignaling
Una vez comprobado que Snail1 y Akt interaccionaban (figura R.17) se planteó la hipótesis de si Snail1 podría actuar como un cofactor directo de Akt, aumentando su actividad a través de su interacción directa. Para ello, se realizaron ensayos quinasa en los cuáles Akt1 fusionada con GST, purificada de células HEK 293 tratadas con IGF-1 durante 5 min, fue preincubada con la proteína de fusión GST-Snail1, así como con varios mutantes de Snail1. Como control se preincubó la quinasa con la
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GST sola. Seguidamente, se midió la actividad de Akt1 mediante la detección de la radiactividad incorporada por el crosstide.
Como se observa en la figura R.19 A sólo el dominio C-terminal de Snail1, el que contiene el dominio de unión al DNA, fue capaz de aumentar la actividad quinasa de Akt1. Nótese, que cuando este dominio fue bloqueado por unión al DNA (en este caso con el promotor CDH1), Snail1 ya no pudo incrementar la actividad quinasa de Akt1 (figura R.19 A, tercera condición). Este resultado verificó que esta región, aminoácidos 152-264, es importante para la activación de la quinasa. De todas formas, la activación observada con el mutante Snail1-Ct fue menor que con la proteína WT. Como se puede observar, la GST sola no mostró ningún efecto sobre la actividad. Lo mismo sucedió con el mutante de Snail1 que mimetiza la conformación “abierta”, el Snail1-S/D. En la figura R.19 B se muestran las medias comparadas de las diferentes mediciones realizadas de la actividad de Akt preincubada con Snail1- Ct y Snail1-WT. En los dos casos las diferencias entre la actividad de la quinasa preincubada con GST y la preincubada con Snail1-WT y Snail1-Ct fueron significativas (p<0,05).
Figura R.19 Snail1-WT incrementa la actividad quinasa de Akt1. A Ensayo quinasa in
vitro en el que se preincubó Akt1 (expresada y purificada de células HEK 293 deprivadas de suero durante 12 h y tratadas 5 min con IGF-1), con 1 µg de la proteína GST-Snail1-WT durante 10 min a 30ºC. Las reacciones se realizaron en presencia de [γ32]ATP, durante 30 min a 30ºC y 30 µM de crosstide se utilizaron como sustrato. Se detuvo la reacción y se prosiguió a contar la radioactividad incorporada por el sustrato en cada condición. Como control, se preincubó la quinasa con la GST sola. En la gráfica se representa la media de tres mediciones de la quinasa procedente de un lisado. B. Ensayos quinasa in vitro en el que se preincubó Akt1 con 1 µg del mutante de Snail1, GST-Snail1-Ct y con Snail1-WT durante 10 min a 30ºC. Después de 30 min a 30ºC, las reacciones se detuvieron y se midió la cantidad de radioactividad incorporada por el sustrato. En la gráfica se muestran las medias de 4 experimentos, cada uno realizado por triplicado y el valor p obtenido mediante la prueba T (programa SPSS).
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Para explicar como Snail1 podía incrementar la actividad de Akt1 in vitro se plantearon dos ideas: o bien la interacción con Snail1 producía un incremento o acumulación de Akt1 fosforilado en la T308 y en la S473, o la interacción de Snail1 con Akt1 incrementaba su actividad, manteniendo una conformación activa de la quinasa sin incrementar el estado de fosforilación de los residuos responsables de su activación.
Para discernir entre las dos hipótesis, se procedió a realizar ensayos quinasa in vitro en presencia de ATP no marcado radioactivamente. Seguidamente, se analizó el nivel de fosforilación de la T308 y la S473 por western-blot de la GST-Akt preincubada con GST-Snail1. Dicha señal se comparó con la de la GST-Akt preincubada con la GST sola como control negativo.
Como muestra la figura R.20, cuando se compararon las señales obtenidas por los fosfo-anticuerpos, éstas fueron iguales preincubando con GST-Snail1-WT como con la GST sola. Por tanto, el aumento in vitro de la actividad de Akt1 por interacción con Snail1 no es consecuencia de un aumento en la fosforilación de los residuos responsables de su activación, la T308 y la S473.
Figura R.20 El incremento in vitro de la actividad quinasa de Akt1 por Snail1, no es debido a una mayor fosforilación de los residuos responsables de su activación, al menos para el caso de la T308. A Ensayo quinasa in vitro en el que GST-Akt1 purificada, de
células HEK 293, bajo diferentes condiciones de activación (en condiciones basales de actividad (0% FBS) y en condiciones de activación mediante estimulación con IGF-1) fueron preincubadas con GST-Snail1-WT durante 10 min a 30ºC. Seguidamente se realizó el ensayo quinasa en presencia de ATP no marcado radioactivamente. Las reacciones, se pararon después de 30 min a 30ºC. Las direntes condiciones se dividieron en tres y se cargaron en un
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gel de poliacrilamida al 10% para conseguir una buena separación de las diferentes proteínas. Se transferieron a una membrana de nitrocelulosa y se analizaron los residuos T308 y S473 con anticuerpos anti-P-T308 y anti-P-S473. Como control de la presencia de cantidades iguales de todas las proteinas se usó el anticuerpo anti-GST.
RESUMEN
Los resultados de este capítulo evidencian un mecanismo mediante el cual Snail1 aumentaría la actividad quinasa de Akt1 por interacción directa. Se ha demostrado que esta interacción aumenta la actividad quinasa de Akt1 in vitro. Al no aumentar la fosforilación de los residuos responsables de la activación de Akt parecería que la interacción con Snail1 facilitaría una conformación más activa de la quinasa. También se muestra como Snail1 es un sustrato de Akt1 in vitro. Probablemente, el residuo fosforilado se encuentra entre los últimos 28 aminoácidos, descartando la serina 246.