Comparison between the non-supplementation groups

Factores de crecimiento

Los factores de crecimiento (FC) corresponden a proteínas y/o péptidos biorreguladores cuya función es modificar las respuestas celulares, incluyendo la proliferación, la diferenciación y la migración celular (Cornejo, 2011). Los FC son primeros mensajeros que se unen a receptores glicoproteícos de la membrana celular y así inician la transducción de una señal (Barbeito y Andrés, 2005). El primer FC conocido fue el factor de crecimiento neuronal (NGF, por sus siglas en inglés) descubierto por la neuróloga Rita Levi-Montalcini en 1952 y por lo cual recibió el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1986.

En la actualidad se conoce una gran variedad de estas moléculas, como el factor de crecimiento de plaquetas (PDGF) cuya función es promover la quimiotaxis en un lugar de fractura, estimular la proliferación de células del músculo liso, endotelio, fibroblastos, etc. También posee un efecto angiogénico (González et al., 2013); el factor

de necrosis tumoral (TNF-alfa) causante de gran variedad de respuestas

celulares como inducción de citocinas y moléculas inmunorreguladoras, necrosis tumoral, proliferación y diferenciación celular, y apoptosis (Falfán, 2002); el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) que posee más de 23 miembros (FGF-1, FGF-2, KGF, etc.) y más de 96 receptores diferentes. Las funciones de FGF se relacionan con la cicatrización, angiogénesis, diferenciación de células sanguíneas, la hematopoyesis, el desarrollo embrionario, la captación de glucosa por adipocitos etc. (Giménez, 2002); el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) que presenta varios miembros (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF- β5, TGF-β1.2, etc.), es producida por células como los macrófagos, células T, fibroblastos, miocitos, condrocitos, astrocitos, plaquetas, etc. Esta proteína tiene como función inducir la transformación e inhibir la proliferación de una gran variedad de células (Peralta et al., 2001); el

factor de crecimiento epidérmico (EGF) descubierto en 1962, es un

células salivales, renales, queratinocitos, monocitos, macrófagos, fibroblastos y plaquetas. Esta molécula estimula la diferenciación celular de la epidermis, produce síntesis del tejido vascular endotelial y estimula la regeneración de nervios periféricos (Gama et al., 2014); el

factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) cuya estructura es

semejante en un 50% a la insulina y es producido principalmente por el hígado, siendo liberada al torrente sanguíneo por estimulación de la hormona del crecimiento (GH). Su acción permite aumentar la masa muscular (actividad sinérgica con GH), incrementar la utilización de glucosa, ayudar a la mantención ósea, aumentar la producción de testosterona e inhibir la producción de GH (Conchillo et al., 2007); el

factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) cuya función es

inducir la proliferación de células endoteliales, siendo también un mediador importante en la angiogénesis y la permeabilidad vascular. Se han descrito varias isoformas de este factor (VEGF-121, VGEF-145, VGEF-165, VGEF-206, etc.) y dos receptores que median el efecto de estas moléculas (Infanger et al., 2008); el factor de crecimiento nervioso (NGF) es el factor trófico mejor estudiado, actúa en la supervivencia y desarrollo de las neuronas durante el período embrionario y en el cerebro adulto actúa sobre neuronas noradrenérgicas y colinérgicas, ayudando a la sinaptogénesis (Kandel et al., 2013); y muchos otros factores de crecimiento.

Figura 4.1 Representación de dos factores de crecimiento. Las espirales representan alfa hélices, las flechas hojas plegadas beta y las líneas los giros

Factores neurotróficos

Los factores neurotróficos son proteínas endógenas que promueven la diferenciación y supervivencia neuronal, la neurogénesis y la sinaptogénesis. Existen varias familias de estos factores: a) la familia de las neurotrofinas, donde se encuentra el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la neurotrofina 3 (NT-3), la neurotrofina 4 (NT-4/5) y la neurotrofina 6 (NT-6); b) la familia de las citosinas o citoquinas, proteínas que regulan la función de gran variedad de células, donde algunas de ellas actúan sobre el sistema nervioso. Estas se dividen a su vez en la familia factor neurotrófico ciliar (CNFT) que contiene al mismo CNFT, el factor inhibitorio de leucemias (LIF) y la interleucina-6 (IL-6), y un grupo de citoquinas que incluyen la interleucina-11 (IL-11), oncostatin M (OSM), cardiotrofina-1 (CT-1), citocina parecida a cardiotrofina (CLC) y neuropoetina; c) la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) que incluye la familia TGF-beta, la familia de la proteína morfogénica ósea (BMP) y la familia del factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) que contiene al GDNF, persepina (PSPN), neurturina (NRTN) y artemina (ARTN).

Figura 4.2 Clasificación de los factores neurotróficos (modificado de Kalinowska & Jerzy, 2012)

Los factores neurotróficos pueden afectar distintos grupos de neuronas, tal como una misma neurona puede ser afectada por diversos factores neurotróficos. Los mecanismos de liberación y captación de estos factores pueden ser: a) retrógrados, cuando la diana libera las proteínas y son captadas por los terminales axónicos y viajan hacia el soma; b) paracrinas, cuando las células que liberan las proteínas se ubican en las cercanías de la neurona; c) endocrinas, cuando las células que liberan las proteínas se ubican lejos de la neurona y los factores neurotróficos son transportados por la sangre; d) autocrinas, cuando la propia neurona produce el factor de crecimiento y posee los receptores que permiten la acción de la proteína, en estos casos se dice que la neurona se auto-estimula; e) mecanismo anterógrado, donde la neurona presináptica libera los factores neurotróficos y estimula a la neurona postsináptica (Gavalda, 2005).

Figura 4.3 Mecanismos de acción de factores neurotróficos.

Neurotrofinas

Las neurotrofinas son proteínas, que en etapa embrionaria estimulan el crecimiento y diferenciación celular, y en etapa adulta favorecen la supervivencia neuronal (Arévalo y Wu, 2006). Las neurotrofinas maduras están constituidas por dímeros de unos 13.500

Dalton, donde ambos monómeros se encuentran unidos por tres enlaces disulfuros, estructura denominada nudo de cisteína (Fig. 4.4). Esta situación se observa en varios factores de crecimiento como los TGF- beta y PDGF (Bothwell, 2014).

Figura 4.4 Estructura molecular del factor de crecimiento nervioso (NGF).

Las neurotrofinas son sintetizadas inicialmente como un precursor pro-neurotrofina la cual es escindida en el retículo endoplasmático y luego son transportadas al aparato de Golgi donde son empaquetadas en vesículas secretoras, aquí son escindidas por la enzima furina produciendo la forma madura de la neurotrofina (β- neurotrofina). También se ha observado que las pro-neurotrofinas pueden ser secretadas al medio extracelular (Bothwell, 2014, Lee et al., 2001).

Los mamíferos poseen cuatro tipos de receptores para las neurotrofinas: tirosina-kinasa A (TrkA), tirosina-kinasa B (TrkB), tirosina-kinasa C (TrkC) y p75NTR_{. Los receptores Trk se denominan}

receptores de alta afinidad donde las β-neurotrofinas se unen con mayor facilidad que las pro-neurotrofinas. El TrkA es receptor del NGF, el TrkB del BDNF y de NT-4/5, el TrkC es receptor NT-3, aunque este último puede unirse con menor afinidad a los otros receptores. El p75NTR

es denominado receptor de baja afinidad, ya que las pro-neurotrofinas se unen con mayor facilidad que las β-neurotrofinas (Mendoza, 2012).

Los receptores Trk poseen un dominio extracelular aminoterminal que está constituido por dos regiones ricas en cisteína (C1-C2) con tres regiones ricas en leucina (LLR), también posee dos

dominios parecidos a inmunoglobulinas (Ig1 e Ig2) siendo este último el lugar que interactúa con las neurotrofinas (Fig. 4.5); un dominio transmembrana y un dominio intracelular con un extremo carboxiloterminal, siendo este dominio el que interacciona con proteínas en el citosol (Wehrman et al., 2007, Huang y Reichardt, 2003). Los genes NTRK codifican receptores Trk de unos 800 aminoácidos, donde el gen NTRK1 (ubicado en el cromosoma 1q21-q22) sintetiza la proteína TrkA, el gen NTRK2 (ubicado en el cromosoma 9q22.1) la proteína TrkB y el gen NTRK3 (ubicado en el cromosoma 15q25) la proteína TrkC (Amatu et al., 2016).

Figura 4.5 Estructura cristalizada del receptor TrkA y de p75NTR _(modificado

de Liu et al, 2018 y He & García, 2004).

La unión de β-neurotrofinas a los receptores Trk permite su dimerización (unión de los dos monómeros en una estructura), lo cual produce autofosforilación de tirosina intracelular, que a su vez comienza una cascada de señales que producirá actividad

transcripcional en el núcleo neuronal que produce neurogénesis y plasticidad sináptica (Maureira, 2018, Meeker & Willimas, 2014). Estos procesos se describirán en detalle más adelante.

Los receptores TrkA se distribuyen en las neuronas colinérgicas de la región basal del cerebro, el estriado, el tálamo, los ganglios de la raíz dorsal y nervio trigémino. Por su parte, los receptores TrkB y TrkC están ampliamente distribuidos en todo el sistema nervioso central y periférico (Barbacid, 1995).

El receptor p75NTR _{pertenece a la familia del receptor de necrosis}

tumoral, presenta una región extracelular compuesta por 4 dominios ricos en cisteína (CR1 a CR4), un dominio transmembrana y una región citoplasmática donde se encuentra el dominio de muerte (Fig. 4.5). Este receptor puede actuar en forma aislada o puede asociarse a los receptores Trk y así modular la afinidad con las neurotrofinas (He & García, 2004, Bibel et al., 1999). Se han identificado 235 genes asociados a receptor p75NTR _{(Sajanti et al., 2020). Este receptor activa cascadas}

moleculares que producen supervivencia neuronal (cuando, por ejemplo, se encuentra unido al receptor Trk aumentando su afinidad a β-neurotrofinas), sin embargo, su respuesta más característica es la producción de apoptosis celular al unirse a pro-neurotrofinas (Kraemer et al. 2014 & Pérez, 2018).

El receptor p75NTR _{puede asociarse a la proteína sortilina, que}

esta codificada por el gen SORT1 en el cromosoma 1. Esta proteína actúa en el transporte de proteínas entre el aparato de Golgi, los lisosomas y la membrana plasmática (Kjolby et al., 2015). La activación del complejo p75NTR _{y sortilina por pro-neurotrofinas generan efectos}

neurotóxicos y la muerte neuronal (Volosin et al., 2006). p75NTR _también

puede unirse a la proteína NOGO (proteínas transmembranas asociadas al retículo endoplasmático que presenta 3 variantes: NOGO-1, NOGO-2 y NOGO-3) cuya unión a ligandos produce una inhibición del crecimiento de dendritas y axones (Pérez, 2018).

Factor de crecimiento nervioso (NGF)

Los factores neurotróficos se descubrieron de manera azarosa estudiando células de sarcoma (un grupo de cánceres), las cuales secretaban una sustancia que promovía el crecimiento de las fibras nerviosas, la primera de estas sustancias se denominó NGF. Esta

molécula se sintetiza como pre-proteína de 241 aminoácidos, la cual puede permanecer en su forma original o puede ser escindida por la enzima furina en forma intracelular o por metaloproteinasas en forma extracelular, formando en ambos casos un NGF maduro (β-NGF). Este polipéptido presenta 118 aminoácidos. En el sistema nervioso de mamíferos existe más pro-NGF que β-NGF (Ioannou & Fahnestock, 2017).

Cuando el β-NGF se une al receptor TrkA produce una dimerización del receptor, una autofosforilación y desencadena cascadas moleculares de señalización intracelular a través de tres vías: MAPK/ERK, PI3K/Akt o PLCγ.

La vía MAPK/ERK comienza con la activación de la proteína adaptadora Shc que forma un complejo proteico con Grb2 (proteína 2 unida al receptor del factor de crecimiento) y con SOS (factor de nucleósido guanidina). Este complejo activa la proteína GTPasa Ras (rats sarcoma) que a su vez estimula a la serina/treonina quinasa (Raf) que comienza con la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) y la quinasa reguladas por señales extracelulares (ERK). Esta vía influye en la proteína Ets LiKe gene1 (ELK 1) que es un factor de transcripción que ayuda a la diferenciación y supervivencia neuronal. Por otra parte, ERK 1/2 puede activar a la proteína quinasa S6 ribosomal (RSK) que a su vez activa el factor de transcripción CREB que se encuentra en el núcleo de la neurona (Fig. 4.6). Este factor actúa sobre el gen CRE que produce la transcripción de factores neurotróficos que provocan supervivencia, proliferación y diferenciación neuronal.

La vía PI3K/Akt comienza con la activación de la proteína adaptadora Shc que forma un complejo proteico con Grb2 (proteína 2 unida al receptor del factor de crecimiento) y con la proteína de unión asociada a GRB2 1 (GAB1). Este complejo activa la vía del PI3K (fosfoinositol-3-quinasa) que finalmente activa la Akt (proteína serina- treonina cinasa) y está a la GTPasa Rac, de esta forma comienza la vía MAPK. También Akt inactiva proteínas pre-apoptóticas como BCL-2 antagonista de muerte celular (BAD). Esta vía promueve la supervivencia neuronal y el crecimiento dendrítico y axonal.

La vía de fosfolipasa Cγ (PLCγ) que produce hidrolización de la enzima inositol polifosfato 5-fosfatasa (PIP2) que se separa en diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3), este último implica un aumento de calcio intracelular y ambas moléculas permiten la

Figura 4.6 Vías de señalización del β-NGF al unirse al receptor TrkA. Explicación en el texto.

activación de la proteína quinasa C (PKC) que a su vez activa la proteína quinasa dependiente de calcio/calmodulina (CaMKs). Esta última activa el factor de transcripción CREB que actúa sobre el gen CRE produciendo supervivencia y plasticidad neuronal.

El β-NGF también puede unirse al receptor p75NTR _{activando el}

factor asociado a receptor TNF 6 (TRAF 6) que forma un complejo con la quinasa asociada al receptor de interleucina (IRAK). Este complejo activa la proteína quinasa C (PKC) que activa el complejo multiproteico

Figura 4.7 Vías de señalización del β-NGF y pro-NGF al unirse al receptor p75NTR _{y al receptor p75}NTR_{-sortilina respectivamente. Explicación en el texto}

(modificado de Sinobiological, 2020).

IKK, quien actúa sobre el factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-kB) el cual atraviesa la membrana nuclear activando una gran variedad de genes de supervivencia neuronal (Fig. 4.7). También puede ocurrir que la unión de β-NGF al receptor p75NTR _{produzca activación de la proteína}

inactivadora de ribosomas 2 (RIP2) que actúa directamente sobre NF- kB.

Finalmente, el pro-NGF puede unirse al receptor conformado por p75NTR _{y sortilina. En este caso activan la proteína adaptadora}

NRAGE también llamada MAGED1 quien actúa sobre la quinasa c-Jun N-terminal (JNK). La unión del pro-NGF al receptor p75NTR _{y sortilina,}

también puede activar el factor de interacción del receptor de neurotrofina (NRIF), el cual también activa a JNK. Esta quinasa actúa sobre la proteína supresora de tumores 53 (p53), la proteína 4 similar a BCL-2 (BAX) y la proteína BCL-2 antagonista de muerte celular (BAD). Esta actividad provoca la liberación del citocromo C desde el espacio intermembranal de la mitocondria hacia el citoplasma de la neurona, modulando las vías dependientes de caspasas. El citocromo C activa la caspasa 9 que a través de una cascada molecular da lugar a la caspasa 3, la cual entra al núcleo celular y activa genes de apoptosis, induciendo una fragmentación del ADN y produciendo la muerte celular.

Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)

El BDNF es la neurotrofina con mayor expresión en los mamíferos, sobre todo en el hipocampo y la corteza cerebral (Armas et al., 2010). Esta proteína en su forma inmadura (pro-BDNF) está constituida por 249 aminoácidos y en su forma madura (mBDNF) por 118 aminoácidos. Esta proteína es codificada por el gen BDNF ubicado en el cromosoma 11 (Zhang et al., 2000). El BDNF es expresado principalmente en las células nerviosas, pero también se produce en casi todas las células del sistema inmune periférico (Armas et al., 2010).

Figura 4.8 Estructura molecular del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF).

El pro-BDNF es sintetizado en el retículo endoplasmático, luego es plegado y empaquetado en vesículas secretoras que pueden ser movilizadas a los botones terminales a través de un transporte anterógrado para ser liberado en la hendidura sináptica, otras son liberadas en las dendritas y producen una auto-estimulación a través de los receptores de su membrana (Mowla et al., 1999). Esta proteína puede ser liberada en su forma inmadura o puede producirse un clivaje proteolítico de su predominio a cargo de la enzima plasmida o metaloproteinasa, adquiriendo su forma madura (Lee et al., 2001).

El mBDNF se une al receptor TrkB con quien posee gran afinidad o con el receptor p75NTR _{con quien posee baja afinidad. Al igual}

que el β-NGF, el mBDNF unido al receptor TrkB estimula la supervivencia neuronal y la neuroplasticidad (Maureira, 2016).

La unión de mBDNF al receptor TrkB produce la activación de la proteína adaptadora Shc que forma un complejo proteico con Grb2 (proteína 2 unida al receptor del factor de crecimiento) y con SOS (factor de nucleósido guanidina). Este complejo activa la proteína GTPasa Ras (rats sarcoma) que comienza con la activación de la vía MAPK/ERK (Fig. 4.9), la cual provoca, por una parte, la supervivencia, crecimiento, desarrollo y plasticidad neuronal, y por otra, activa el factor de transcripción CREB que promueve la transcripción del gen CRE que da origen al BDNF mRNA que viaja al retículo endoplasmático y provoca el ensamblaje de pro-BDNF con lo cual comienza nuevamente el ciclo (Maureira, 2016).

La unión de mBDNF al receptor TrkB también puede provocar que Shc siga la vía que activa fosfoinositol-3-quinasa (PI3K) terminando en Akt (proteína serina-treonina cinasa) que produce supervivencia y plasticidad neuronal, y la activación del factor de transcripción CREB. La tercera vía tras la fosforilización del receptor TrkB puede producir reclutamiento de fosfolipasa Cγ (PLCγ) lo que conduce a la formación de IP3 (inositol trifosfato) con un aumento en el calcio (Ca2+_{) intracelular}

y la activación de la calmodulina dependiente de quinasa (CaMKs) que produce plasticidad neuronal y activación del factor de transcripción CREB (Cunha et al., 2010, Maureira, 2016).

El mBDNF también puede unirse al receptor p75NTR _{activando el}

factor asociado a receptor TNF 6 (TRAF 6) que forma un complejo con la quinasa asociada al receptor de interleucina (IRAK). Este complejo activa la proteína quinasa C (PKC) que cuya vía finalmente activa el

Figura 4.9 Vías de señalización del mBDNF al unirse al receptor TrkB. Explicación en el texto (modificado de Cunha et al., 2010, Maureira, 2016,

Reichardt, 2006).

factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-kB) que activa una gran variedad de genes de supervivencia neuronal (Fig. 4.10). También puede ocurrir que la unión de mBDNF al receptor p75NTR _{produzca activación de ceramida, un}

esfingolípido, que puede activar directamente NF-kB.

Finalmente, el pro-BDNF puede unirse al receptor conformado por p75NTR _{y sortilina. Esta vía activa la quinasa c-Jun N-terminal (JNK)}

que a su vez puede activar la proteína supresora de tumores 53 (p53) y la vía de caspasas o puede activar la proteína p39 de unión a Fos (c-Fos), pero en ambos casos se induce la apoptosis.

Figura 4.10 Vías de señalización del mBDNF y pro-BDNF al unirse al receptor p75NTR _{y al receptor p75}NTR_{-sortilina respectivamente. Explicación en}

el texto. NT-3, NT-4/5 y NT-6

La neurotrofina 3 (NT-3) fue el tercer factor neurotrófico descubierto (Fig. 4.11). En estado inmaduro (pro-NT3) esta proteína está constituida por 258 aminoácidos y en su forma madura (NT-3) por 119 aminoácidos (Maisonpierre et al., 1990). Su acción la ejerce uniéndose al receptor TrkC y uniéndose con menor afinidad a TrkA y TrkB. Su forma madura también puede interactuar (con menor afinidad) con el receptor p75NTR _{y pro-NT3 se une con mayor afinidad a dicho receptor. NT-3 se}

asocia con crecimiento, diferencias y supervivencia de neuronas del hipocampo, neuronas sensoriales y del sistema nervioso simpático (Hernández, 2020).

La neurotrofina 4/5 (NT-4/5) posee un estado inmaduro (pro-NT 4/5) constituida por 210 aminoácidos y un estado maduro (NT 4/5) con 130 (Fitzgerald et al., 2001). Esta proteína se une al receptor TrkB, pero también puede hacerlo con menor afinidad TrkA. Al igual que las otras neurotrofinas, NT 4/5 maduro posee baja afinidad por el receptor p75NTR_{, pero su precursor pro-NT 4/5 posee gran afinidad por dicho}

receptor. NT-4/5 se asocia a la supervivencia de neuronas motoras y sensoriales.

La neurotrofina 6 (NT-6) descubierta en la década de 1990, es una proteína presente sólo en peces y que parece no tener sus homólogos en aves o mamíferos (Huang y Reichardt, 2001). Tiene una acción similar al NGF en neuronas sensoriales y del sistema nervioso simpático, pero con menor potencia. Parece ser que la unión de NT-6 con heparina (un anticoagulante) modula su acción en el sistema nervioso (Götz et al., 1994).

Figura 4.11 Estructura de la neurotrofina 3.

Las cascadas moleculares activadas por NT-3 y NT-4/5 al unirse a sus respectivos receptores son similares a las mencionadas para NGF y BDNF. La unión de proteínas maduras de estas dos neurotrofinas a receptores Trk se asocia con crecimiento, diferenciación y supervivencia neuronal. Misma situación cuando se unen a receptores p75NTR_{. En}

cambio, la unión a pro-NT3 y pro-NT4/5 al receptor p75NTR _{y sortilina se}