Los microportadores son diminutas esferas (usualmente con diámetros en el intervalo de 90 a 300 µm), cuya superficie debe promover adhesión para facilitar el crecimiento de células que requieren de anclaje. El principal beneficio del uso de microportadores es la gran relación de superficie/volumen comparado con sistemas tradicionales de cultivo como frascos T, lo que permite el cultivo de grandes cantidades de células con una densidad elevada en sistemas de compactos, reduciendo significativamente la contaminación por manipulación y las necesidades de medio y aumentando la productividad debido al mejor control de las condiciones de cultivo. Existen diferentes tipos de microportadores ofrecidos por un número de compañías comerciales.
General Electric Health Care ofrece Citodex 1 (basado en una matriz de dextrano substituido con
DEAE), Citodex 3 (basado en una matríz de dextrano recubierta con colágeno denaturado), Cytopore (microportador de alta porosidad basado en celulosa entrecruzada) y Cytoline (microportador macroporoso basado polietileno de alta densidad y sílica) (GE-Healthcare, 2005).
SoloHill Engineering Inc. también ofrece una amplia variedad de microportadores basados en
poliestireno cubierto de una serie de moléculas incluyendo sílica, diversos cationes, proteínas recombinantes con motivos RGD y colágeno porcino tipo 1. Debido a que cada tipo celular tiene requerimientos específicos para adhesión y crecimiento, el tipo de microportador debe ser seleccionado experimentalmente; esto es especialmente cierto si se utiliza un ambiente con altos esfuerzos cortantes, como los existentes en cultivos en suspensión o en un biorreactor (SoloHill-Eng-Inc., 2013).
Desde su concepción por van Wezel (1968), los microportadores han sido ampliamente usados para el cultivo y amplificación de diferentes tipos de células adherentes. Ejemplos incluyen la expansión de células para la producción a gran escala de factores de crecimiento, vacunas (Meignier et al., 1980; Aunins et al., 1997), anticuerpos (Shirokaze et al., 1997), células madre (Phillips et al., 2008a), virus (Genzel et al., 2006; Wu et al., 2006; Hundt et al., 2007).
El uso de microportadores en biorreactores bien agitados para mejorar significativamente la expansión es ampliamente utilizado para la poliferación de distintos tipos celulares, entre los que se destacan: hueso (Park et al., 2013), hígado (Palakkan et al., 2013), células madre (Zhou et al., 2013), cartílago (Mercier et al., 2005)y tejido cardiaco (Reichardt et al., 2013), entre otros. En
todos los casos, tanto la densidad celular de siembra como la distribución de células en el soporte son esenciales, puesto que una distribución heterogénea de células en el soporte puede afectar las propiedades del tejido (Pörtner et al., 2005).
A pesar de su probada eficacia en términos del crecimiento celular, la presencia de poliestireno, polietileno, celulosa o dextrano en los microportadores disponibles comercialmente se considera inconveniente para efectos de un equivalente dérmico puesto que estos elementos quedarían insertos en dicho equivalente. Aunque es posible cosechar las células y retirar el microportador utilizando tripsina u otro tipo de proteasa equivalente, es importante considerar que la adición de estas sustancias impone un estrés adicional a las células y alarga el tiempo de obtención del equivalente. Es por esta razón que el presente proyecto considera la fabricación de microportadores de fibrina, en los cuales realizar el crecimiento celular en condiciones óptimamente controladas y a mayor velocidad; y una vez expandidas las células, los microportadores quedarían embebidos en una capa del equivalente dérmico basado en el mismo material. El éxito de esta aproximación se basa en dos premisas:
1- Las células efectivamente se adhieren y se multiplican homogéneamente en la superficie del microportador.
2- El material con el cual está hecho el microportador estimula el crecimiento celular.
En el presente capítulo se evalúa cada una de estas dos premisas, como requisito para la continuación del desarrollo de un equivalente dérmico.
4.3 Materiales y métodos
4.3.1 Plasma sanguíneo humano crioconcentrado (PHCC)
Se emplearon 50 unidades de PHCC (c/u de 17-20 mL aprox.), las cuales fueron suministradas por el Hemocentro Distrital de Bogotá (Colombia). Las unidades de PHCC fueron transferidas desde el Hemocentro (en donde se mantienen almacenadas a -70°C) hasta el laboratorio en una nevera que se mantuvo a -20 °C; al llegar al laboratorio, las unidades fueron descongeladas sumergiendo las bolsas en un baño termostático a 37°C. Una vez alcanzada dicha temperatura, se revisó cada unidad y se descartaron aquellas que presentasen cualquier signo de material precipitado. El contenido de todas las unidades restantes se mezcló en condiciones estériles para formar un lote homogéneo de manera que cualquier variación de los resultados por efecto de diferencias en las características del PHCC pudiese ser descartada. Este lote fue dividido en alícuotas de 25 mL, las cuales fueron almacenadas en tubos Falcon transparentes de 50 mL y congeladas a -20 °C hasta el momento de su uso. Los tubos fueron cubiertos exteriormente con Parafilm® M (Structure Probe, Inc., West Chester, USA) para reducir los riesgos de contaminación.
4.3.2 Alginato de sodio 3% p/v.
Se disolvieron 31,02 gramos de alginato de sodio (Sigma-Aldrich A2033, Saint Louis MO, USA) en 700 mL de agua destilada. Se sometió a agitación magnética y a calentamiento (50°C) durante 12 horas, para favorecer la disolución del alginato de sodio. Transcurrido este tiempo se dejó la mezcla a temperatura ambiente durante 12 horas para permitir el ascenso de burbujas de aire atrapadas y luego se llevó a un volumen final de 1000 mL con agua destilada en un matraz aforado para obtener una solución de alginato de sodio 3% p/v. Dicha solución fue sometida a un proceso de esterilización por calor empleando un autoclave a 15 psig (25,8 psia) durante 30 minutos. La solución de alginato se mantuvo refrigerada a 4 °C y se descartó luego de un mes de preparada.
4.3.3 Solución de CaCl
2al 3% p/v
Se preparó una solución de CaCl2 (3% p/v) mediante dilución de 39,74 g de CaCl2·2H2O (Carlo Erba Reagents Ref: 433381,, Rodano, France) en 700 mL agua destilada, agitando con una varilla de vidrio hasta completa disolución; una vez disuelto el CaCl2·2H2O, la solución se llevó a un matraz aforado de 1000 mL y se completó a volumen con agua destilada, para dar lugar a una solución de Ca+2 de 270 mM.