Chapter 4: Mobile Agent Modelling Modelling
4.3 Concepts of Multi-agent Systems
Existen numerosas técnicas para analizar la SDF, y cada vez surgen más publicaciones que se centran en el estudio del daño en el ADN espermático y de su utilidad para predecir fertilidad. Sin embargo, nunca se ha considerado que la condición de la matriz nuclear en células espermáticas también podría aportar información útil para predecir el éxito en la reproducción. Hay evidencias que indican que la matriz nuclear espermática desempeña un papel en la función que realiza el genoma paterno durante el desarrollo temprano (Ward et al. 1999) y se ha demostrado que la organización del ADN en dominios en forma de bucle, por medio de la matriz nuclear, es necesaria para que se produzca la formación del pronúcleo masculino y el inicio de la síntesis del ADN (Shaman et al. 2007a; Yamauchi et al. 2007a; Yamauchi et al. 2007b). Por otro lado, el estudio de la matriz proteica en células espermáticas con el ADN fragmentado podría aportar datos que nos permitan avanzar en el estudio del origen de la SDF. Los resultados obtenidos en el primer objetivo de este trabajo indican una clara relación entre la SDF y la presencia de daño oxidativo en las bases del ADN, en forma de 8-oxoG. El estrés oxidativo podría provocar directamente la fragmentación del ADN o podría inducir una cascada apoptótica que, en último término, daría lugar a la fragmentación del ADN por la acción de ROS liberadas por la mitocondria. La inducción de un proceso apoptótico en células somáticas se asocia con diferentes cambios a nivel morfológico, como condensación de la cromatina, contracción del núcleo y formación de cuerpos apoptóticos. Estos cambios morfológicos se producen como consecuencia de alteraciones a nivel molecular, como proteólisis de polipéptidos, modificaciones post-traduccionales de proteínas nucleares y fragmentación del ADN y ARN (Martelli et al. 2001). Esto nunca se ha estudiado en espermatozoides. No se sabe si hay diferencias o no en la matriz proteica nuclear entre espermatozoides con el ADN fragmentado y los que no lo tienen. Así, la cuestión es si el fenómeno que lleva a la fragmentación del ADN en espermatozoides también se asocia a modificaciones en la matriz proteica.
Para tratar de estudiar de manera simultánea la fragmentación del ADN y la condición de la matriz nuclear proteica, se probaron diferentes protocolos en muestras espermáticas de veinte hombres, cuatro fértiles y el resto infértiles, con un rango de fragmentación del ADN de 5,13% a 48,00%.
Cuando las células espermáticas humanas son lisadas en un microgel para eliminar membranas y proteínas, tras la tinción de ADN, se observa que los núcleos que no tienen el ADN fragmentado presentan halos de dispersión
de bucles de ADN que se extienden en torno a un core central. Esto último es una consecuencia de la exitosa extracción de protaminas (Tsanev & Avramova 1981; Rodman et al. 1982). Por el contrario, los núcleos que tienen el ADN fragmentado presentan grandes halos de difusión de puntos de cromatina (Figuras 19 y 20). Esto es un ensayo de difusión típico para la determinación de la fragmentación del ADN (Singh 2000).
Tras lisar las células con una lisis fuerte (lisis con SDS), la tinción con el fluorocromo mercuridibromofluoresceína demostró que las proteínas de la matriz nuclear no permanecían el core de aquellas células espermáticas que no tenían el ADN fragmentado. Sorprendentemente, los espermatozoides con el ADN fragmentado tendían a retener proteínas residuales de la matriz nuclear en un estado colapsado y agregado (Figura 19).
Figura 19. Células espermáticas humanas tratadas con la solución de lisis fuerte (con SDS). Izquierda: Tinción de ADN con DAPI. Centro: Tinción de proteína con mercuridibromofluoresceína. Derecha: Fusión de las dos imágenes. *: Células con el ADN fragmentado. La tinción con DAPI muestra que los espermatozoides que no tienen el ADN fragmentado presentan halos de dispersión de bucles de ADN, mientras que las células que tienen el ADN fragmentado presentan grandes halos de difusión de fragmentos de ADN. La tinción de proteína muestra que sólo las células con el ADN fragmentado retienen una matriz proteica residual en un estado condensado y colapsado.
Se observaron diferentes grados de retención de proteína en espermatozoides con el ADN fragmentado, algunas células presentaban puntos residuales de proteína y otras mostraban una tinción de proteína muy tenue. Todas las muestras analizadas mostraron solubilidad diferencial de la proteína nucleoesquelética en células espermáticas con el ADN fragmentado. Las células espermáticas con el ADN fragmentado que no retuvieron proteína nuclear residual fueron muy escasas. La proporción de estas células fue diferente en las diferentes muestras y nunca excedió el 7,9% de células fragmentadas.
Cuando se utilizó una solución de lisis menos agresiva, en la que se había sustituido el SDS por Tritón X-100 y NaCl, las células espermáticas con el ADN fragmentado retenían las proteínas nucleares residuales incluso más densamente agregadas, observándose una intensidad de tinción 2 veces más fuerte que cuando se utilizó la lisis más fuerte. Pero en este caso, la matriz nuclear residual de proteína también permanecía en las células espermáticas sin fragmentación del ADN, aunque homogéneamente distribuidas en el core y mostrando una intensidad de tinción media 4,9 veces menor que en las células con el ADN fragmentado (Figura 20, Tabla 5).
Figura 20. Células espermáticas humanas tratadas con una solución de lisis suave (sin SDS). Izquierda: Tinción de ADN con DAPI. Centro: Tinción de proteína con mercuridibromofluoresceína. Las colas de los espermatozoides se mantienen. Derecha: Fusión de las dos imágenes. *: Células con el ADN fragmentado. Las células con el ADN intacto presentan matrices proteicas homogéneas y tenuemente teñidas, mientras que las que tienen el ADN fragmentado presentan matrices densas y agregadas.
Cuando se utilizó el test SCD, el tratamiento ácido antes de la lisis impidió la respuesta diferencial a la eliminación de las proteínas (Figura 21, Tabla 5).
Figura 21. Células espermáticas humanas procesadas con el test SCD. Arriba: Tinción de ADN con DAPI. Abajo: Tinción de proteína con mercuridibromofluoresceína. *: Células con el ADN fragmentado. No se observaron diferencias en cuanto a la matriz proteica nuclear entre células fragmentadas y no fragmentadas.
Tampoco se observaron diferencias en la tinción de proteína en células espermáticas intactas no lisadas (Figura 22).
Figura 22. Células espermáticas humanas intactas incluidas en un microgel. Izquierda: Tinción de ADN con DAPI. Derecha: Tinción de proteína con mercuridibromofluoresceína. No se observaron diferencias entre células.
Estado del ADN Área DAPI Área proteína Intensidad Media Proteína Lisis Fuerte Fragmentada 50100,6 ± 7620,1a 223,3 ± 121,2 1261,3 ± 820,0 No Fragmentada 29126,7 ± 3612,2a - - Lisis Suave Fragmentada 47073,2 ± 7550,9b 612,6 ± 236,2d 2487,5 ± 1055,1e No Fragmentada 26956,0 ± 3920,1b 2538,4 ± 1075,7d 506,0 ± 174,2e SCD Fragmentadas 3723,1 ± 2672,5 c 2182,1 ± 986,4 838,0 ± 113,8 No Fragmentadas 19582,6 ± 12912,1c 2691,4 ± 1013,1 706,1 ± 102,3 Sin Lisis 740,4 ± 112,7 997,1 ± 161,4 4353,5 ± 1036,4 Tabla 5. Resultados del análisis digital de imagen (media ± desviación estándar) de 80 células espermáticas de cada tipo. El área se mide en píxeles y la intensidad media en unidades arbitrarias. a, b, c, d, e: p < 0,05.
Los resultados obtenidos parecen indicar que la SDF se asocia con algún tipo de modificación en las proteínas de la matriz nuclear y que el paso de lisis desenmascara esta condición nuclear proteica diferencial presente en espermatozoides con el ADN fragmentado. Estas modificaciones podrían deberse a alteraciones químicas o enzimáticas cualitativas en algunas o en todas las proteínas de la matriz nuclear. También podrían ser el resultado de variaciones cuantitativas o desequilibrios estequiométricos. Se ha publicado que la deficiencia de protaminas o proteínas de transición en ratones y humanos puede dar lugar a fragmentación del ADN (Cho et al. 2001; Cho et al. 2003; Meistrich et al. 2003). Sin embargo, tales desequilibrios nunca se han descrito para otras proteínas nucleares estructurales. Estas observaciones también podrían ser el resultado de un ensamblaje estructural anormal de las proteínas nucleoesqueléticas. De hecho, se han descrito diferentes grados de desorganización e inestabilidad de la matriz nuclear en pacientes con criptorquidia (Barone et al. 2000), sugiriendo que ésta podría ser la causa de la infertilidad en estos pacientes. También podría ocurrir que las proteínas nucleares se unan más ávidamente al ADN dañado pero, en este caso, la tinción de DAPI en el core tendría que ser más alta en nucleoides con el ADN fragmentado que en aquellos con el ADN no fragmentado. Sin embargo, el resultado fue opuesto, descartando esta posibilidad.
Tras obtener estos resultados, la cuestión era si el fenómeno que daba lugar a la fragmentación del ADN en espermatozoides también daba lugar a
modificaciones en la matriz proteica nuclear o si estas modificaciones en la matriz ocurrían antes que la fragmentación. Para estudiar esto, se cultivaron cinco muestras de espermatozoides a 37ºC durante 48 h para inducir fragmentación en su ADN. El porcentaje de células con el ADN fragmentado aumentó de 10,6, 20,6, 26,5, 29,4 y 44,4, a 54,6, 50,5, 55,1, 61,9 y 79,4, respectivamente. Sólo esas células con el ADN fragmentado tendían a retener la matriz nuclear residual. En todos los casos, las nuevas células añadidas al resto de células con el ADN fragmentado adquirían estas características. Este experimento de incubación prolongada sugiere que la modificación de la matriz nuclear no es anterior a la fragmentación del ADN, sino que la acompaña, y parece razonable pensar que la modificación de la matriz nuclear espermática podría ser una consecuencia del mismo mecanismo que genera la fragmentación del ADN.
Estos resultados y los obtenidos en el primer objetivo de esta tesis parecen señalar al estrés oxidativo como responsable de ambos sucesos. El estrés oxidativo, especialmente si va acompañado por citoquinas inflamatorias y proteasas, puede inducir modificaciones químicas en el ADN y las proteínas nucleares. Así, la fragmentación del ADN y la modificación en la matriz nuclear podrían ser una consecuencia directa del estrés oxidativo. Por otro lado, el estrés oxidativo podría inducir una cascada apoptótica que, en último término, daría lugar a la fragmentación del ADN por la acción de ROS liberadas por la mitocondria (Koppers et al. 2011). Las modificaciones que observamos en la matriz proteica nuclear de los espermatozoides con el ADN fragmentado podrían ser similares al colapso y a la condensación de la cromatina que acompaña la degradación apoptótica del ADN que ocurre en células somáticas. De hecho, los resultados obtenidos tras lisar una muestra de leucocitos con la solución de lisis suave, sin SDS, son bastante similares a los obtenidos en espermatozoides con la solución de lisis más fuerte, con SDS (Figura 23). Sólo los leucocitos apoptóticos tendían a retener una matriz nuclear residual en un estado condensado y colapsado. Esto sólo se observó cuando se utilizó la solución de lisis suave y desapareció cuando empleamos la solución más fuerte, evidenciando una mayor resistencia del núcleo espermático, probablemente debido a su mayor compactación.
En células somáticas, la condensación cromatínica apoptótica ocurre como consecuencia de una proteólisis dependiente de caspasas (Martelli et al. 2001) que podría estar regulada a través de nucleoplasmina y acinus, dos proteínas activadas por caspasa 3 (Sahara et al. 1999; Lu et al. 2005). Estas características no han sido estudiadas en células espermáticas, aunque
diferentes caspasas, incluyendo caspasa 3, pueden ser activadas en espermatozoides humanos (Paasch et al. 2004). Además, Koppers et al. (2011) demostraron que la activación de una cascada apoptótica intrínseca en espermatozoides maduros daba lugar, además de a la activación de caspasas y externalización de fosfatidil serina en la membrana, a cambios ultraestructurales similares a los observados en células somáticas, específicamente resultaba en la aparición de grandes vacuolas y protuberancias en la membrana en la pieza media del espermatozoide.
Figura 23. Leucocitos humanos de sangre periférica tratados con la solución de lisis suave, sin SDS. Izquierda: Tinción de ADN con DAPI. Centro: Tinción de proteína con mercuridibromofluoresceína. Derecha: Fusión de las dos imágenes. *: Leucocito apoptótico. A diferencia de las células que no tienen el ADN fragmentado, los leucocitos apoptóticos retienen una matriz nuclear residual en un estado condensado y colapsado.
Aun así, no podemos descartar que la fragmentación del ADN y la modificación en la matriz proteica nuclear observados en las células espermáticas sea una consecuencia de las roturas provocadas por la topoisomerasa II durante la remodelación de la cromatina en la espermiogénesis, aunque este mecanismo parece improbable, debido a que la topoisomerasa II es una enzima específica de ADN y nunca se ha descrito ninguna modificación en la matriz proteica nuclear asociada a su actividad. De cualquier modo, nuestros resultados indican que el proceso que inicia la fragmentación del ADN en espermatozoides humanos también se expresa a nivel de la matriz nuclear.