tamaño menor a 500 nm, realizando diversas síntesis en donde se combinaron distintas concentraciones de CHI y TPP. Para este propósito, se prepararon soluciones de TPP en agua y de CHI en ácido acético a pH 4,9, a diferentes concentraciones, 0,25; 0,5; 0,75 y 1 mg/mL. La síntesis de las NPs se llevó a cabo de acuerdo al procedimiento descrito anteriormente en esta sección.
Capítulo 3: Nanopartículas Poliméricas
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Las suspensiones obtenidas se evaluaron en primera medida visualmente, clasificándolas en tres clases, según su apariencia (Calvo y col., 1997).:
• Soluciones claras: ausencia de NPs.
• Soluciones opalescentes: pequeñas partículas.
• Soluciones con separación de fases: formación de agregados
Posteriormente, se midió el tamaño de las partículas presentes en las muestras por DLS. De esta manera, se pudo establecer una relación entre la apariencia de las muestras obtenidas y el tamaño de partículas allí presentes.
3.1.2.2 Inclusión del Complejo HCT/βCD en las NPs
Una vez que se seleccionaron las condiciones óptimas para la obtención de
las NPs, éstas se sintetizaron conjuntamente con el complejo HCT/βCD. Con
este procedimiento se pretendió incorporar el complejo de HCT/βCD en las NPs.
Se trabajó con el complejo de la HCT y no con el fármaco solo, debido a que de esta manera se solubiliza mayor cantidad de principio activo.
El complejo HCT/βCD se disolvió en la solución de TPP, ya que ésta se prepara en agua y a temperatura ambiente, posteriormente se enfría a 4 °C. La concentración del complejo en la solución de TPP fue de 1,44 mg/mL, equivalente a una concentración de HCT de 0,22 mg/mL. La síntesis de las NPs se realizó según el procedimiento descrito anteriormente en la sección 3.1.2.1.
El contenido de cada vaso de precipitado se colocó en tubos tipo Falcon, con una base de glicerol (aproximadamente 10 µL), para ultracentrifugarlos a 13000 rpm, por 40 min, a 20 °C. Este procedimiento se realizó para aislar las NPs del exceso de principio activo y así obtener el
pellet
de NPs cargadas con el complejoHCT/βCD. Se realizaron 3 ciclos de lavados, con el agregado de 7 ml de agua
en cada uno. El glicerol se utilizó con el fin de evitar la agregación de las NPs centrifugadas (Rampino y col., 2013).
Se calculó la cantidad de fármaco encapsulado, utilizando un método indirecto que consistió en restar la cantidad de fármaco presente en el sobrenadante luego de aislar las NPs, a la cantidad inicial de principio activo
98
agregado1. El porcentaje de fármaco encapsulado en las NPs, se obtuvo de
acuerdo a la ecuación 3.1 (Krauland y col., 2007):
á = á − á
Ecuación 3.1
La cuantificación de la HCT incorporada en las NPs, se llevó a cabo
utilizando un espectrofotómetro UV-Vis, a una longitud de onda (λ) de 270 nm.
La curva de calibrado se realizó en agua, en un rango de (1,2 - 6) x10-5 M.
3.1.2.3 Determinación de Tamaño y Potencial Z
El tamaño y el valor de potencial Z de las NPs se determinó utilizando la técnica de DLS.
La determinación del tamaño y del índice de polidispersidad (PDI), asociado a la muestra, se realizó colocando la suspensión de las NPs, debidamente diluida, en una celda de vidrio e indicando las condiciones de solvente e índice de difracción correspondiente en el software del equipo, Beckman Coulter Inc. Cada muestra fue medida 35 veces, por triplicado. La determinación del potencial Z se llevó a cabo bajo las mismas condiciones experimentales, colocando la muestra en una celda de electroforesis capilar, realizando 70 mediciones, por triplicado.
El tamaño promedio (nm), el índice de polidispersidad y el valor de potencial Z (mV) se calcularon utilizando la función de correlación CONTIN que provee el software del equipo.
1Si bien se trabaja con el complejo HCT/βCD, éste complejo es inestable, por lo tanto, lo
que se cuantifica en todos los casos es la HCT. El complejo fue ampliamente descrito y caracterizado en el capítulo 2 de este trabajo de tesis.
Capítulo 3: Nanopartículas Poliméricas
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3.1.2.4 Estudios de Estabilidad
Los estudios de estabilidad se realizaron con el objetivo de determinar si las NPs sufren algún cambio a nivel macroscópico y/o nanométrico, cuando son sometidas a ambientes con diferentes valores de pH, en distintos períodos de tiempo.
El análisis a nivel macroscópico se realizó observando cambios en las soluciones, en relación a su aspecto general, separación de fases, etc. En cuanto al nivel nanométrico, se midió el tamaño y el PDI de las NPs por DLS.
Estos estudios se llevaron a cabo resuspendiendo el
pellet
de NPs, ya seanvacías o cargadas con el complejo HCT/βCD, en soluciones tamponadas de HCl
o fosfatos, según corresponda a los diferentes valores de pH (1,2; 5,5; 6,8; 7,4) y agua. Las suspensiones se mantuvieron a temperatura ambiente durante 20 días, simulando de esta manera las condiciones de almacenamiento.
Se consideró que las muestras son estables, cuando no se observan cambios significativos en cuanto a su apariencia y/o tamaño medido.
3.1.2.5 Microscopía Electrónica de Barrido
La técnica de microscopía electrónica de barrido (SEM), fue utilizada con el objetivo de analizar la morfología, la superficie y la dispersión de tamaños de las NPs sintetizadas. También se utilizó un SEM, acoplado a espectroscopia de rayos X (EDX), para analizar los componentes químicos presentes en la superficie de las NPs sintetizadas. Esta técnica corroboró la presencia de HCT en las NPs, ya que se pudieron identificar átomos característicos del principio activo.
En ambos casos las muestras se prepararon de la misma manera. Los
pellets
se resuspendieron en agua y una gota de cada una de estas suspensiones se colocó sobre un soporte para SEM. La muestra se secó en una cámara de vacío y luego se metalizó con oro para poder analizarla por SEM.
100
3.1.2.6 Estudios de Liberación
in vitro
Los estudios de liberación