4.4 Research Method and Design
4.4.2 Data Collection
Con el propósito de determinar el mecanismo molecular por el cual, el gen Arid3b actúa en el proceso de formación de la cresta ectodérmica apical, se analizaron una serie de marcadores relevantes en la morfogénesis de la extremidad de vertebrado. El patrón de expresión de estos genes fue examinado tanto en embriones de pollo electroporados con las construcciones utilizadas en los ensayos de ganancia y pérdida de función, como en embriones mutantes homocigotos Arid3b-/- y sus respectivos
controles.
• Análisis del patrón de expresión de genes implicados en el establecimiento del eje dorso-ventral:
La cresta ectodérmica apical se localiza, de manera precisa, en el borde establecido entre el ectodermo dorsal y ventral. Ensayos de ganancia y pérdida de función en genes implicados en la formación del eje dorso-ventral han revelado, no sin cierta controversia, un papel fundamental de éstos en el correcto emplazamiento del AER (Ahn et al., 2001; Chen and Johnson, 1999; Fernandez-Teran and Ros, 2008; Laufer et al., 1997; Logan et al., 1997; Loomis et al., 1996; Loomis et al., 1998; Pizette et al., 2001; Rodriguez-Esteban et al., 1997).
Engrailed1 (En1) se expresa en el ectodermo ventral del primordio de la
extremidad de vertebrado. Este factor de transcripción es inducido por BMPs expresadas también en el ectodermo ventral proporcionando identidad ventral al primordio. En1, a su vez, reprime la expresión en el ectodermo ventral de la molécula de secrección WNT7a. Ésta, aparece restringida al ectodermo dorsal, y a través de Lmx1b, expresado en el mesénquima dorsal confiere identidad dorsal al primordio.
El fenotipo observado en los mutantes Arid3b-/-, así como en los ensayos de
electroporación en embrión de pollo, resultaban compatibles con una alteración en el adecuado establecimiento del eje dorso-ventral.
Para analizar el posible rol de Arid3b en este proceso en el embrión de pollo se analizó el patrón de expresión de Bmp7, En1 y Wnt7a en embriones electroporados con la construcción que sobreexpresa la forma wt de Arid3b a 30 horas, 48 horas y 72 horas post-electroporación. No se detectó, en ningún caso, alteración en el patrón de expresión de estos genes respecto al primordio control (n=2 por tiempo de recogida) (Fig. 48). En los embriones recogidos a 72 horas en los que se observaron AERs ectópicos, no se establecieron nuevos bordes dorso- ventrales a cada lado de estas estructuras (Fig. 48).
A continuación se realizó este mismo estudio de marcadores dorso-ventrales en embriones electroporados con una de las formas dominantes negativas (cArid3bDNhW) y recogidos a 30 horas y 48 horas. No se evidenció ninguna
variación en el patrón de expresión de dichos genes (n=2 por tiempo de recogida) (Fig. 49).
Figura 48: La sobreexpresión de
Arid3b en el ectodermo del primordio
no modifica el patrón de expresión de marcadores dorso-ventrales. A-D) Secciones transversales consecutivas de un embrión electroporado con la forma wt de Arid3b y recogido a 30 horas postelectroporación. A) Expresión de GFP/Arid3b observada al microscopio de fluorescencia. B C y D) Hibridaciones in situ en secciones transversales con las sondas de
Wnt7a, En1 y Bmp7. No se observan
cambios en el patrón de expresión de estos genes. E y F) Secciones transversales al eje próximo-distal de un primordio recogido a 72 horas postelectroporación. Expresión de
Fgf8 y Wnt7a mediante hibridación in situ en secciones consecutivas. No se
generan nuevos bordes dorso- ventrales flanqueando al AER ectópico (punta de flecha).
Figura 49: La sobreexpresión de formas dominantes negativas de Arid3b no produce cambios en
el patrón de expresión de marcadores de ectodermo dorsal (Wnt7a) o ventral (Bmp7 y En1) ni a 30 horas (A-H) ni a 48 horas (I-K) postelectroporación. A-D) Expresión de GFP en un embrión electroporado con una de las formas dominantes negativas y recogido a 30 horas. E-H) Hibridación in situ con la sonda de Fgf8 y las sondas anteriormente nombradas. I) Expresión de GFP a la lupa de fluorescencia de un primordio electroporado con una de las formas dominantes negativas y recogidos a 48 horas después de la electroporación. J, K) Hibridación in situ con las sondas de Fgf8 y Wnt7a en secciones consecutivas de estos embriones.
Posteriormente se llevaron a cabo hibridaciones in situ en secciones de parafina con los genes Bmp7 (n=3), En1 (n=3), Wnt7a (n=3) y Lmx1b (n=2) en embriones mutantes Arid3b-/- a estadio de desarrollo E10.5. En ninguno de los genes
analizados se detectó variación alguna respecto a su control (Fig. 50).
Figura 50: Hibridaciones in situ en secciones transversales demuestran que el patrón de expresión
de marcadores dorso-ventrales se mantiene inalterado en embriones Arid3b-/- con respecto a sus
respectivos controles. A-D) Hibridación in situ en secciones con las sondas especificadas en embriones control. E-H) Hibridación in situ en secciones con las sondas especificadas en embriones Arid3b-/-.
Estos resultados nos permiten concluir que Arid3b no parece controlar la morfología de la cresta ectodérmica apical a través de un correcto establecimiento del eje dorso-ventral
• Análisis del patrón de expresión de genes implicados en la inducción de la cresta ectodérmica apical.
Se ha propuesto que Fgf10 expresado en el mesénquima es la molécula encargada de activar Wnt3/Wnt3a en el ectodermo de la extremidad. Este gen activa a Sp8 también en el ectodermo de la extremidad que a su vez promueve la expresión de
Fgf8 en los precursores del AER. Numerosos ensayos de pérdida y ganancia de
función en ratón, pollo o pez cebra han demostrado la relevancia de estos genes en la inducción de la cresta ectodérmica apical (Barrow et al., 2003; Kawakami et al., 2004; Kengaku et al., 1998; Min et al., 1998; Ohuchi et al., 1997; Sekine et al., 1999; Soshnikova et al., 2003). Msx2, expresado en el ectodermo ventral y a través
de una vía de señalización paralela dependiente de BMPs, es otro colaborador implicado en el proceso de inducción del AER (Pizette et al., 2001).
En embriones mutantes de falta de función Arid3b-/- de estadio E10.5 se llevaron a
cabo hibridaciones in situ en secciones de parafina con las sondas de Fgf10 (n=2),
Sp8 (n=2) y Msx2 (n=2). Los resultados obtenidos mostraron que no existían
alteraciones aparentes ni en el patrón ni en el nivel de expresión de estos genes en relación al control (Fig. 51).
Figura 51: Embriones Arid3b-/- no evidencian anomalías en el patrón de expresión de
genes implicados en la vía de inducción de la cresta ectodérmica apical. A-C) Hibridación in situ en secciones con las sondas especificadas en embriones control. D-F) Hibridación in situ en secciones con las sondas especificadas en embriones Arid3b-/-.
• Análisis del patrón de expresión de genes implicados en la morfología y homeostasis celular de la cresta ectodérmica apical.
La vía de Notch, implicada en numerosos procesos biológicos, también aparece involucrada en la formación de la cresta ectodérmica apical. Serrate2/jagged2, gen que codifica para un ligando de esta vía, se expresa en el AER y el mutante de pérdida de función de este gen presenta un evidente fenotipo en la morfología de esta estructura (Francis et al., 2005; Jiang et al., 1998; Pan et al., 2005; Sidow et al., 1997). Por otro lado DKK1, inhibidor secretado de la vía de Wnts se expresa en el ectodermo distal así como el mesénquima en embriones de ratón de E10.5. Tanto los diferentes mutantes de falta de función de este gen, como los ensayos en pollo, han evidenciado la implicación de Dkk1 en la correcta formación del AER (Adamska et al., 2003; Adamska et al., 2004; Grotewold and Ruther, 2002; MacDonald et al., 2004; Mukhopadhyay et al., 2001).
Se llevaron a cabo hibridaciones in situ en secciones de parafina en embriones de ratón con sondas específicas para los genes Serrate2 (n=2) y Dkk1 (n=2). No se observó variación en los niveles de expresión de estos genes en ninguno de los ejemplares (Fig. 52).
• Análisis del patrón de expresión de Shh
Los patrones de expresión de Shh y Arid3b solapan en ciertas regiones en el embrión de pollo y de ratón. Ambos genes se expresan fuertemente en estructuras tales como la notocorda así como en el floorplate. SHH es una molécula secretada que se expresa en altos niveles en la ZPA y que controla el establecimiento del eje antero-posterior así como el número y la identidad de los dígitos. El solapamiento en algunas regiones del patrón de expresión de Shh y Arid3b podía sugerir una posible interacción genética entre ambos.
Se realizó una hibridación in situ en secciones de embriones mutantes Arid3b-/- de
estadio E10.5 utilizando la sonda de Shh. En estos especimenes no se detectaron anomalías evidentes en el patrón de expresión de este gen (n=2) en ninguna de las estructuras del embrión. Para descartar la posibilidad de que fuese Shh el gen encargado de regular a Arid3b, se realizaron hibridaciones in situ en secciones de un embrión ShhGFPCre/GFPCre (Harfe et al., 2004) de estadio E10 con la sonda de Arid3b.
En este espécimen se pudo observar una ausencia de expresión de Arid3b en el floorplate y notocorda a excepción de las regiones más caudales. Sin embargo, no se detectaron cambios en el patrón de expresión de Arid3b en el primordio de la extremidad (Fig. 53).
En el análisis de marcadores implicados en el desarrollo de la extremidad de vertebrados, en muestras de ratón y pollo pertenecientes a ensayos de ganancia y pérdida de función de Arid3b, no se observaron alteraciones en su patrón de expresión en la extremidad. Estos resultados sugerían que el proceso afectado durante la formación del AER en estos especimenes, no estaba relacionado con la inducción o la formación de un correcto patrón, sino que podría tratarse de un mecanismo celular básico como por ejemplo supervivencia, proliferación, morfología o adhesión.
Para analizar si los fenotipos observados pudieran ser debidos a anomalías en la homeostasis celular se llevaron a cabo estudios de proliferación y apoptosis en los experimentos de ganancia y pérdida de función tanto en pollo, como en ratón. Los resultados se resumen a continuación.
Figura 52: Dkk1 y Serrate2,
implicados en la correcta formación del AER, presentan patrones de expresión similares en embriones Arid3b-/- y en sus
respectivos controles. A, B) Hibridación in situ en secciones con las sondas especificadas en embriones control. C, D) Hibridación in situ en secciones con las sondas especificadas en embriones Arid3b-/-.