pDU.GUS, doce plantas para pGU.US y seis para pCISceI (Tabla 4.2). Estas plantas se analizaron por PCR, empleándose la pareja de cebadores Hyg-L/Hyg-R que amplifica un fragmento de unas 450 pb del gen Hph en el caso de las plantas transformadas con las construcciones pIU.GUS y pDU.GUS; los cebadores Bar-Fw/Bar-Rev en el caso de la construcción pGU.US, que amplifican un fragmento de unas 500 pb del gen Bar; y los cebadores 35S-L/ISce-R para la construcción pCISceI, amplificando un fragmento de algo más de 700 pb que comprende parte del promotor 35S y el inicio del gen para la enzima ISce-I. Así mismo se realizaron ensayos de Southern blot empleando como sondas estos mismos fragmentos. En ninguno de los casos se pudo confirmar la presencia del transgén, lo que supone que todas las plantas regeneradas serían escapes a la selección, con excepción de aquellas transformadas con la construcción pCISceI que no fueron sometidas a ningún tipo de selección.
En la siguiente temporada se escogieron dos de estas variedades de trigo por ser las que presentan mejores tasas de regeneración, y además se empleó la cebada. Se transformaron en total 2.627 embriones de la variedad ‘Bobwhite 26’ y 3.043 embriones de la variedad ‘Florida’, con las cuatro construcciones según se describe en la siguiente tabla (Tabla 4.3). Los resultados obtenidos para la transformación de cebada se indican en el siguiente apartado. Construcción Embriones transformados Plántulas regeneradas Positivos por PCR Positivos por Southern Blot pIU.GUS 912 2 0 0 pDU.GUS 1.098 5 0 0 pDGU.US 1.083 12 0 0 pCISceI 1.127 6 0 0
Variedad pIU.GUS pDU.GUS pDGU.US pCISceI
Bobwhite26 675 627 668 657
Florida 764 721 727 831
Tabla 4.3 Número de embriones inmaduros transformados con cada una de las construcciones para las dos variedades de trigo.
Tabla 4.2 Resumen de datos de la transformación de trigo. Se han agrupado según la construcción empleada, sin hacer distinción entre las distintas variedades de trigo.
Resultados
58
Tras la transformación de los embriones mediada por Agrobacterium y el posterior paso por una etapa de callo, comenzaron a regenerarse plántulas que fueron sometidas a una selección mediante el antibiótico o el herbicida añadidos a los medios de regeneración. Tras esta selección sólo se obtuvieron plantas procedentes de los embriones transformados con la construcción pCISceI, un total de 20 plantas, mientras que en el caso de las otras tres construcciones no regeneró ninguna planta tras el período de selección. Se analizaron las plantas obtenidas para la construcción pCISceI mediante PCR para determinar la presencia o no del transgén. Se empleó para ello la pareja de cebadores 35S-L/ISceI-R que amplificaba un fragmento de aproximadamente 700 pb, sin encontrarse ninguna planta que contuviese el transgén. Para confirmar esto se realizaron también ensayos de Southern Blot usando como sonda el fragmento amplificado con los cebadores mencionados anteriormente, marcado con digoxigenina. Los resultados obtenidos fueron los mismos, no encontrándose ninguna planta transgénica.
Transformación de la variedad de cebada ‘Golden Promise’
Dados los escasos resultados obtenidos en la primera tanda de transformación de trigo, en la siguiente ronda se realizaron conjuntamente con los experimentos de trigo anteriormente comentados, experimentos de transformación de otro cereal, la cebada, utilizando la variedad ‘Golden Promise’, transformándose en un primer momento un total de 3.105 embriones (Tabla 4.4).
Al igual que en el caso de los trigos, se realizó una selección de los embriones transformados añadiendo bien higromicina (pIU.GUS y pDU.GUS) o fosfinotricina (pGU.US) a los medios empleados durante el proceso de cultivo para la obtención de callos y la regeneración de plántulas. Tras este proceso de selección, se obtuvieron siete plantas resistentes a la selección en el caso de la construcción pIU.GUS, ocho plantas resistentes para pDU.GUS, y treinta y seis plantas en el caso de la transformación con pGU.US. En el caso de los embriones transformados con la construcción pCISceI, al no llevar ésta ningún tipo de marcador seleccionable para la detección de los eventos de transformación, regeneraron al menos dos mil plántulas, de las cuales se seleccionaron aleatoriamente 720 plantas que serían posteriormente analizadas mediante PCR.
Resultados
59
Construcción Embriones transformados Plántulas regeneradas Positivos por PCR Positivos por Southern Blot Plantas con semillas pIU.GUS 806 7 4 4 2 pDU.GUS 764 8 1 1 0 pDGU.US 773 36 19 19 12 pCISceI 762 >2.000 1 1 0Todas estas plántulas regeneradas, resistentes a la selección aplicada durante el proceso de cultivo in vitro, fueron analizadas en primer lugar mediante PCR con unas parejas de cebadores específicas que amplificaban parte del transgén con el que se había transformado la planta. En el caso de las construcciones pIU.GUS y pDU.GUS se emplearon las parejas de cebadores GUS-L/GUS-R e Hyg-L/Hyg-R para detectar, respectivamente, la presencia del gen Gus y del gen Hph en el genoma de las distintas plantas. La primera pareja de cebadores amplificó un fragmento de unas 400 pb del gen
Gus incluido en las construcciones, mientras que Hyg-L/Hyg-R amplificó un fragmento
de unas 500 pb del gen Hph. Tras el análisis por PCR de estas plantas se detectó la presencia del transgén en cuatro de las siete plantas analizadas en el caso de la construcción pIU.GUS y sólo una de las ocho plantas resistentes a la selección resultó presentar el transgén en el caso de la construcción pDU.GUS (Figura 4.2).
Las plántulas que resultaron resistentes a fosfinotricina transformadas con la construcción pGU.US fueron igualmente analizadas por PCR, empleando para ello dos parejas de cebadores, por un lado la pareja previamente utilizada GUS-L/GUS-R para amplificar un fragmento del gen Gus, y por otro la pareja Bar-Fw/Bar-Rev que amplifica un fragmento de 500 pb del gen Bar (Figura 4.3). En este caso se encontró que de las
Tabla 4.4 Datos sobre la transformación de cebada con las distintas construcciones. Se indica el número de embriones transformados con cada construcción, las plántulas regeneradas resistentes a la selección y las transgénicas obtenidas en cada caso.
Figura 4.2 Análisis mediante PCR de algunas de las plantas regeneradas. En el gel se encuentran las muestras de 5 plantas transformadas con pDU.GUS y 7 plantas transformadas con pIU.GUS. En este caso se emplearon los cebadores GUS-L/GUS-R. Los números en la parte superior identifican las plantas, y el color rojo marca las plantas positivas por PCR.
Resultados
60
treinta y seis plantas regeneradas y analizadas por PCR, diecinueve contenían el transgén pues en todas ellas se amplificaron ambos genes.
De las plantas transformadas con la construcción pCISceI, al no llevar ésta ningún tipo de agente de selección, se obtuvieron más de dos mil plántulas regeneradas a partir de los callos obtenidos, de las cuales 720 fueron analizadas mediante PCR empleando la pareja de cebadores 35S-L/ISceI-R utilizados anteriormente. Se encontró una planta positiva para la presencia del transgén que fue confirmada mediante Southern Blot, aunque esta planta murió antes de llegar a dar semillas.
Las plantas en las que se obtuvo un resultado positivo mediante los análisis por PCR, fueron analizadas mediante Southern Blot para confirmar la presencia del transgén en su genoma. Además, mediante estos análisis, se pudo también determinar el número de copias del transgén que se integraron en el genoma de las plantas. Para ello se cortó el ADN genómico de las plantas con una enzima de restricción con una única diana de corte en la secuencia del segmento de ADN que se integra en la planta, de forma que permite determinar el número de copias del transgén. La hibridación se llevó a cabo con una sonda marcada con digoxigenina y amplificada con los mismos cebadores usados en los análisis por PCR. En las Figuras 4.4 y 4.5 se muestran los resultados de estos ensayos para algunas de las plantas analizadas.
Figura 4.3 El gel contiene las muestras de 16 plantas procedentes de la transformación con la construcción pGU.US, amplificados con los cebadores Bar-Fw/Bar-Rev. Los números en la parte superior identifican las plantas, y el color rojo marca las plantas positivas por PCR.