Flow of Data and Order of Computations

Durante la replicación viral, los fluoronucleótidos pueden incorporarse al material genético del virus ya sea DNA (Dragun et al., 1990) o RNA (Gordon & Staehelin, 1959, Munyon & Salzman, 1962) lo que le convierte en agente antiviral para un gran número de virus (Tabla 2.1).

Tabla 2.1 El 5-fluorouracilo como antiviral de amplio espectro.

FAMILIA GÉNERO ESPECIE EFECTOa REFERENCIA

Adenoviridae Mastadenovirus Replicón del

adenovirus humano tipo 5

↓ Título viral (Wildner et al.,

2003)

Arenaviridae Arenavirus Virus de la

coriomeningitis linfocitaria de Ratón

↓ Título viral

Causa mutación (Grande-Perez et al., 2005, Grande- Pérez et al., 2002) (Ruiz-Jarabo et al., 2003)

(de la Torre, 2005)

Bunyaviridae Phlebovirus Virus de la fiebre

del valle del Rift

↓ Título viral

Causa mutación (Caplen et al., 1985)

Coronaviridae Coronavirus Virus de la

hepatitis de ratón

↓ Título viral Mutagénico

(Haspel et al., 1978)

Flaviviridae Flavivirus Virus de la

encefalitis japonesa

Causa mutación (Eastman & Blair,

1985)

Simplexvirus Virus herpes

simple ↓ Efecto citopático ↓ Título viral (de Clercq, 1987) (Dragun et al., 1990)

Herpesviridae

Cytomegalovirus Citomegalovirus

humano ↓ Título viral (Suzuki et al., 1985)

Leviviridae Levivirus Bacteriofago R17 ↓ Título viral

↓ Síntesis de RNA

(Graham & Kirk, 1965)

Orthomyxoviridae Influenzavirus A Virus de la gripe

aviar ↓ Efecto citopático (Dragun et al., 1990)

Papillomaviridae Alfapapilomavirus Papilomavirus

Humano Desaparición de la infección (Niwa et al., 2003)

Morbillivirus Peste Bovina ↓ Título viral

↓ Síntesis de RNA Causa mutación (Ghosh et al., 1996) Paramyxoviridae Avulavirus Virus de la enfermedad de Newcastle

↓ Efecto citopático (Dragun et al., 1990)

Aftovirus Virus de la fiebre

aftosa ↓ Efecto citopático ↓ Título viral ↓ Síntesis de RNA Causa mutación (Pariente et al., 2001, Sierra et al., 2000) (Pariente et al., 2003, Pariente et al., 2001) Picornaviridae Enterovirus Virus de la

poliomelitis ↓ Título viral Causa mutación (Cooper, 1964)

Rhabdoviridae Vesiculovirus Virus de la

estomatitis vesicular ↓ Efecto citopático ↓ Título viral Causa mutación (Pringle, 1970) (Holland et al., 1990) (Lee et al., 1997)

Rhabdoviridae Tobamovirus Virus del mosaico

del tabaco ↓ Título viral Causa mutación (Davern & Bonner, 1958) (Wittmann & Wittmann- Liebold, 1966) (Staehelin & Gordon, 1960)

Togaviridae Alfavirus Virus de la

encefalomielitis equina del oeste

↓ Efecto citopático (Dragun et al., 1990)

Se muestra la familia, el género y la especie de los virus en los que se ha descrito efecto antiviral por 5-fluorouracilo o sus derivados.

a _{Indica los efecto antivirales del 5-fluorouracilo o sus derivados descritos en la bibliografía para cada uno de los} virus. “↓” indica disminución.

2.8.1.2.1 Mutagénesis inducida por halogenoderivados del uracilo

La capacidad mutagénica de los 5-halogenoderivados sobre el DNA es debida al menos a dos efectos, alteraciones en los niveles de dNTPs, y apareamientos de base incorrectos inducidos por la presencia del grupo halógeno de estos análogos de nucleótido (Hopkins & Goodman, 1980).

El FU es un inhibidor de la timidilato sintasa (Figura 2.13), reduciéndose sensiblemente los niveles celulares de dTTP, lo que afecta a la síntesis del DNA (Ghoshal & Jacob, 1997, Ingraham et al., 1982, Tyrsted, 1982). Esto provoca perturbaciones en los niveles del resto de desoxinucleotidos: disminuyen moderadamente los niveles de dGTP y dCTP (Ghoshal & Jacob, 1997, Kunz & Kohalmi, 1991, Parker & Cheng, 1990) y aumentan los de dUTP (Aherne et al., 1996, Mitrovski et al., 1994). En estas condiciones de niveles bajos de dTTP, tanto dUTP como FdUTP se incorporan al DNA celular (Parker & Cheng, 1990).

Figura 2.13. Metabolismo del 5-fluorouracilo. En letra cursiva aparecen las abreviaturas de las enzimas implicadas.

Las abreviaturas son: TP, timidín fosforilasa; UP, uridin fosforilasa; OPRT, ororato fosforribosil transferasa; UK, uridín kinasa; RR, ribonucleótido reductasa; DCTD, dCMP deaminasa; TS, timidilato sintasa. (-) Inhibición.

La fuerte electronegatividad del átomo de flúor altera la densidad electrónica del anillo pirimidínico favoreciendo la formación de puentes de hidrógeno con residuos de guanina, además de con adenina (Figura 2.14). En estudios bioquímicos realizados con DNA y otros halogenoderivados de uracilo se ha visto que este apareamiento tiene lugar tanto en el caso de halogenoderivado incorporado en el molde frente dGTP sustrato, como en el caso de guanina en el molde frente al halogenoderivado trifosfato sustrato (Lasken & Goodman, 1984, Yu et al., 1993). En consecuencia, los halogenoderivados del uracilo favorecen la aparición de transiciones durante la replicación del virus (Figura 2.15).

Figura 2.14. Promiscuidad en el aparemiento de bases por 5-fluorouridina. a) 5-fluorouridina aparea con A con

una estructura de tipo Watson-Crick. b) La naturaleza del átomo de flúor permite teóricamente a la 5-fluorouridina varias posibilidades de apareamiento incorrecto con G. La alta electronegatividad del flúor altera la densidad electrónica del anillo de pirimidina induciendo eventualmente una carga positiva en la molécula, incrementando la probabilidad de perder un protón en la posición N-1, lo que conduce a la transformación de la forma cetónica (grupo =O en el C-6 del anillo) a la forma enólica (-O-H) en un proceso independiente de pH. Con esta forma puede aparear con G con una estructura de tipo Watson-Crick (1). 5-fluorouridina en la forma cetónica (=O) puede aparear con G con un apareamiento con estructura inestable denominada wobble o tambaleante (2). La forma cetónica (=O) puede pasar a la forma ionizada (O-_{) en un proceso dependiente de pH. 5-fluorouridina en la forma ionizada puede aparear} con G con una estructura de tipo Watson-Crick (3). En estructuras de DNA y RNA solamente se han observado apareamientos de tipo 2 y 3 (Champe & Benzer, 1962, Sahasrabudhe & Gmeiner, 1997, Sahasrabudhe et al., 1995, Sahasrabudhe et al., 1996, Sowers et al., 1988, Sowers et al., 1989, Yu et al., 1993). R, ribosa.

Estudios realizados en nuestro laboratorio con células BHK-21 demostraron que FU se convertía en FUTP en el interior de las células. Tras 10 h de exposición a FU, el nivel de UTP intracelular disminuyó 2,5 veces, alcanzando una disminución de 4,2 veces a las 38 h, mientras que no se observaba ninguna variación significativa en los niveles de GTP, CTP y ATP durante este periodo (Pariente et al., 2003). Mediante secuenciación de clones moleculares de poblaciones de VFA y de virus de la coriomeningitis linfocitaria de ratón (LCMV) sometidas a tratamientos con FU en nuestro laboratorio, se ha determinado que las transiciones inducidas mayoritariamente en presencia de FU son A→G y U→C (Grande-Pérez et al., 2002, Pariente et al., 2001, Ruiz-Jarabo et al., 2003, Sierra, 2001, Sierra et al., 2000). Asimismo se observó un aumento en la complejidad del espectro de mutantes en las poblaciones mutagenizadas, medido tanto como incremento en la frecuencia de mutación como en la entropía normalizada de Shannon (apartado 4.17 de Materiales y Métodos), con respecto a poblaciones no tratadas (Pariente et al., 2001, Sierra et al., 2000).

Figura 2.15. Mutagénesis inducida por apareamientos incorrectos ocasionados por FU. Esquema de las

mutaciones que se inducen en el RNA viral debido al apareamiento incorrecto de FU con A ó G. A la izquierda se indica la hebra de RNA en que se encuentra cada nucleótido. Los nucleótidos presentes en cadena positiva (+) o cadena negativa (-) se representan con la letra correspondiente a la base nitrogenada; (A, adenosina; C, citosina; G, guanosina; U, uridina; FU, 5-fluorouridina). La base inicial y final de una vía mutagénica se indican de color blanco dentro de círculos negros y las mutaciones resultantes se resaltan mediante cuadros.

Nuestro laboratorio lleva mucho tiempo caracterizando las poblaciones de VFA surgidas durante el tratamiento con FU. Recientemente, en colaboración con el grupo de la Dra. Nuria Verdaguer se ha obtenido la estructura tridimensional de un complejo de 3D con un molde-cebador de RNA y FUMP incorporado en la posición +1 del iniciador. El FUMP establece enlaces de tipo Watson y Crick con el correspondiente AMP de la cadena molde formando un puente de hidrógeno adicional con la cadena lateral del residuo S304 (Ferrer-Orta et al., 2007).

En esta Tesis Doctoral se ha realizado el primer estudio in vitro con una RdRp encaminado a explicar las bases bioquímicas del carácter mutagénico e inhibitorio de FU para VFA.

2.8.2 Ribavirina

La ribavirina (1-β-D-ribofuranosil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxamida), también conocida como Virazol, es un análogo purínico antiviral de amplio espectro para muchos virus RNA y DNA tanto in vivo como in vitro (Figura 2.16). En la actualidad es utilizada para el tratamiento de infecciones por el virus de la hepatitis C (VHC), en combinación con interferon-α. (Cummings et al., 2001, Davis et al., 1998, Di Bisceglie et al., 2001, McHutchison et al., 1998) o PEG-interferon-α (interferón pegilado) (Mangia et al., 2005). Se emplea también para el tratamiento de infecciones por el virus respiratorio sincitial (Cooper et al., 2003, Hall et al., 1983) en forma de aerosol y el tratamiento de infecciones por virus Lassa (Andrei & De Clercq, 1993, McCormick et al., 1986). R es también un agente citostático.

Figura 2.16. Estructura química de la ribavirina (R), guanosina (G) y adenosina (A).