Las enzimas proteoliticas se caracterizan por catalizar la hidrólisis de las proteínas rindiendo cadenas polipeptidicas más pequeñas y, finalmente, aminoácidos libres. En los alimentos tienen un papel importante, tanto las que están presentes naturalmente en ellos como las añadidas intencionadamente como tales o a través de microorganismos.
Las enzimas proteolíticas han sido clasificadas según criterios muy variados: basándose en el intervalo de pH al que son activas (ácidas, neutras o alcalinas), en su capacidad para hidrolizar proteínas específicas (colagenasa, elastasa) o en su similitud con enzimas bien caracterizadas (tripsina, quimosina, catepsina, etc.) (Lóffler, 1986). El modo de clasificación más adecuado parece ser el basado en el mecanismo de acción (Hartley, 1960), que ha sido el utilizado por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica (Dixon y Webb, 1979). De esta forma se distinguen dos grandes grupos de enzimas proteolíticas: endo y exopeptidasas (Bergmann, 1942).
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rompiendo las proteínas en fragmentos más pequeños.
Existen cuatro tipos de endopeptidasas (Hartley, 1960; Belitz y Grosch, 1988): 1. Serín proteinasas (EC 3.4.21):
Se denominan también proteinasas alcalinas, ya que son activas a valores de pH comprendidos entre 7 y 11. Presentan en su centro activo un resto de serma y otro de histidina.
Gran número de bacterias y hongos producen serín proteinasas, entre ellos Bacillus
cereus, B. lícheniformis, 8. subrilis, Srreptomnycesfradiae, S. griseta y Aspergillus oryzae.
De origen animal son la tripsina, quimotripsina, elastasa y trombina.
La especificidad por el sustrato de cada una de las enzimas pertenecientes a este grupo es, a menudo, bastante diferente, ya que los ~ruposespecíficos implicados en la unión con dicho sustrato son distintos. Por ejemplo, la quimotripsina presenta especificidad por sustratos que contengan tirosina, fenilalanina y triptófano, mientras que la elastasa la tiene respecto a los que contienen alanina (Whitaker, 1972).
Su mecanismo de acción es, en cambio, similar en todos los casos; al principio se origina un éster por la reacción del oxigeno del resto de serna del centro activo y la porción acilo del sustrato con la liberación de la porción amino de éste. Se produce, por lo tanto, un compuesto intermedio acil-enzima que posteriormente reacciona con una molécula de agua para liberar la enzima y el producto de la reacción (Dunn, 1989).
Las serín proteinasas son inhibidas por compuestos tales como los organofosfatos, los fluoro sulfonilos, las cumarmnas, o por inhibidores proteicos, como el ovomucoide o el inhibidor de la tripsina presente en la soja, los cuales se unen reversiblemente a estas enzimas (Salvesen y Nagase, 1989).
2. flQi.pmminasns (EC 3.4.22):
Son endopeptidasas con cisteina en su centro activo; presentan una zona de actividad muy amplia, comprendida entre pH 4,5 y 10, encontrándose su actividad óptima dentro del intervalo 6,0-7,5. (Belitz y Grosch, 1988). Son bastante estables cuando se las somete a
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temperaturas entre 60 y 800C a pH neutro (Whitaker, 1972>.
Su mecanismo de acción presenta similitudes con el de las serín proteinasas. al formarse un compuesto covalente intermedio. Se cree que el anión sulfuro de la cisteina está implicado en un ataque nucleofílico directo sobre el sustrato carbonilo. La rotura del compuesto acil-enzima intermedio se realiza por la unión de una molécula de agua (Dunn,
1989). También presentan cisteina e histidina en su centro activo (Whitaker, 1972).
Los inhibidores de las tiol proteinasas son péptido diazometanos, péptido epóxidos e inhibidores proteicos naturales, como la cistatina (Salvesen y Nagase, 1989). También son inhibidas por iones de metales pesados (Sluyterman, 1967).
Las tiol proteinasas hidrolizan péptidos, amidas, ésteres y especialmente enlaces peptídicos en los que intervienen aniinoácido~ básicos, leucina o glicina (Becze, 1970).
Como representantes típicos de este grupo se encuentran diversas proteinasas de origen vegetal, como la papaína (procedente de Carica papaya), bromelaína (de Ananas
comosus) y ficina (de Ficus spp
),
y proteinasas procedentes de estreptococos.La papaína cruda es una mezcla de proteasas de baja especifidad. Puede hidrolizar desde proteínas hasta sustratos de bajo peso molecular, siendo los enlaces peptídicos más susceptibles los formados por grupos carboxilo de la lisina y arginina a-amino sustituidas (Hill, 1965) y el segundo enlace peptídico desde el grupo carboxilo de la fenilalanina (Schechter y Berger, 1968). La papaína purificada es una única enzima, compuesta por una cadena polipeptídica sencilla con 212 restos aniinoacidicos y cuyo peso molecular es de 23.900 d. La molécula presenta una profunda hendidura que la separa en dos partes. Sólo tres segmentos de la cadena cruzan esta hendidura, encontrándose a un lado el resto de cisteina 25, esencial en el centro activo. Durante la reacción, el sustrato se sitúa en la hendidura de forma que el enlace susceptible de hidrólisis se coloque en posición adyacente al grupo sulfhidrilo. Existe un segundo grupo implicado en el centro activo de la papaína que está formado por un grupo carboxflico (Asp-158), un resto de histidina o por ambos (Whitaker, 1972).
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Recientemente, Baeza y col. (1990) han aislado otro tipo de papaína de Canco
candamarcensís que presenta una elevada actividad proteolítica y esterasa, entre 5 y 8 veces
mayor que la papaína procedente de Carica papaya. 3. Metalo proteinasas (EC 3.4.24):
Son proteasas que presentan iones metálicos en el centro activo, principalmente Zn2~. Son activas en el intervalo de pH comprendido entre 6 y 9, y presentan una baja especifidad (Belitz y Grosch, 1988).
Este grupo de enzimas no forma compuestos covalentes intermedios durante su actuación. La proteinasa nativa presenta una molécula de agua en una de las posiciones de coordinación del átomo metálico, la cual se desplaza al coordinarse en su lugar el grupo carbonio del enlace peptídico atacado. La m¿lécula de agua está unida también a un resto de ácido glutámico por un puente de hidrógeno, cuyo grupo carboxilo sirve para ayudar al ataque de esta molécula de agua sobre el carbonilo peptídico (Dunn, 1989).
La mayoría de los inhibidores específicos de este grupo de enzimas basan su acción en la quelación del átomo de Zn2~ (por ejemplo el EDTA). Existen también otros inhibidores, como el TIMP (inhibidor tisular de las metaloproteasas), de naturaleza proteica, o el dodecil sulfato sódico (Salvesen y Nagase, 1989).
A este grupo pertenecen proteasas bacterianas y fúngicas, como las procedentes de
Bacillus cereus, 8. subtilis, 8. themoproreolyricus (termolisina), Streptomyces griseus
(pronasa) y Aspergillus oryzae.
La pronasa, procedente de Streptomyces griseta, no es realmente una sola enzima sino una mezcla de al menos siete proteinasas, dos o más aminopeptidasas y una carboxipeptidasa (Narahashi y col., 1968), Contiene varias proteinasas neutras estables a pH entre 7,0 y 7,5 en ausencia de Ca2+ o entre 5 y 9 en presencia de este elemento. Respecto a su especifidad de sustrato, Morihara y col. (1968) indican que hidrolizan enlaces peptídicos que contengan un grupo amino de leucina, fenilalanina o tirosina. En la pronasa existen también tres proteinasas alcalinas (a, b y c). El tipo b es inestable a valores de pH inferiores a
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5, mientras que tos otros dos presentan un intervalo de estabilidad más amplio, entre 4,0 y
6,5.
Las amino y carboxipeptidasas son metaloenzimas y se inactivan, al igual que las proteinasas neutras, con EDTA (Narahashi y col., 1968; Narahashi, 1970) y son estables a pH 5-8 en presencia de calcio.
4. Carboxil oroteinasas (EC 3.4.23):
Se denominan también proteinasas ácidas, ya que presentan grupos ácidos en su centro activo.
Existen representantes de este tipo de enzimas tanto de origen animal como microbiano. Entre las primeras se encuentran la pepsina y la quimosina, cuyo pH de actividad óptima está comprendido entre 2 y 4, y la catepsina D, que presenta una actividad óptima a un pH entre 3 y 5 (Belitz y Grosch, 1988). A valores de pH superiores pierden rápidamente actividad, al sufrir una desnaturalización (Whitaker, 1972). Las proteinasas procedentes de microorganismos presentan su pH óptimo de actividad en el intervalo de 1 a 5, y están presentes tanto intra como extracelularmente. Las más estudiadas han sido las de origen fúngico y, en menor medida, las bacterianas (Clostridium spp, lactobacilos) y las de protozoos (Tetrahymena pyrQ’ormis) (Sodek y Hofmann, 1970).
Las proteinasas ácidas microbianas se han dividido en enzimas tipo pepsina, entre las que se encuentran las producidas por Aspergillus oryzae, A. awamori, A. niger y
Penicillium spp ; y las de tipo quimosina, con acción coagulante de la leche, como las
producidas por Aspergillus usamii y Mucor spp (Belitz y Grosch, 1988).
Se cree que el mecanismo de acción de estas enzimas no se basa en un ataque nucleofílico de un grupo funcional de la enzima (Hoffmann y col., 1984) y, por lo tanto, no aparece un compuesto intermedio covalente entre la enzima y un fragmento del sustrato. El centro activo de estas enzimas contiene dos restos de ácido aspártico, que establecen enlaces de hidrógeno con el sustrato formando un compuesto tetraédrico intermedio. La rotura de éste da lugar a un producto complejo que contiene dos mitades del sustrato y su disociación
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origina un complejo acilo o amino (Dunn, 1989).
Tanto la quimosina como la pepsina parecen presentar una especificidad por el sustrato similar. Esta última muestra una especificidad primaria por el resto aniinoacídico que proporciona el grupo -NH del enlace peptídico susceptible. El resto es, preferentemente, de fenilalanina, tirosina o triptófano (Whitaker, 1972).
Estas proteinasas se inhiben con diversos ésteres de diazoacetilaminoácidos, que reaccionan con los grupos carboxflicos del centro activo (Belitz y Grosch, 1988). Las aspartil proteinasas aisladas de mamíferos (pepsina, quimosina, catepsina D) son inhibidas por la pepstatina A, que es un compuesto semejante a un pentapéptido producido por Streptomyces
spp que contiene dos restos del fi-aminoácido estatina (Salvesen y Nagase, 1989).
B) Exopeptidasas: actúan bien desde el extremo carboxilo o bien desde el amino, liberando los aminoácidos terminales uno a uno.
Las exopeptidasas comprenden los siguientes grupos de enzimas (Belitz y Grosch, 1988):
a) a-aminoacetilpéptido-hidrolasas (EC 3.4.11):
Escinden los aminoácidos desde el extremo N-terminal. Comprende diversas aminopeptidasas, como la aminopeptidasa presente en el citosol de las células eucariotas, de gran actividad sobre péptidos con un resto L-leucina en el extremo N-terminal con un grupo a-amino libre; y la tripéptido aminopeptidasa, que hidroliza sólo tripéptidos con un grupo a-amino libre y a-carboxílico libre (Dixon y Webb, 1979).
b) Dipéptido-hidrolasas (EC 3.4.13):
Escinden dipéptidos que presentan tanto el grupo NH2 terminal como el grupo COOH terminal no substituidos. Algunos ejemplos son la carnosinasa, anserinasa,
glicil-glicina dipeptidasa o prolinasa (Dixon y Webb, 1979). c> Dipeptidilpéptido-hidrolasas (EC 3.4.14):
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Liberan dipéptidos desde el extremo N-terminal. Un ejemplo típico es la catepsina C.
d) Peptidilpéptido-hidrolasas (EC 3.4.15):
Escinden dipéptidos del extremo carboxiterminal. En este grupo se encuentra la carboxicatepsina.
e) Serín-carboxipeptidasas (EC 3.4.16):
Separan aminoácidos desde el grupo carboxiterminal y tienen un resto de serna en el centro activo. La especificidad de estas enzimas viene determinada primariamente por el aminoácido que porta el grupo carboxflico libre. La presencia de aminoácidos aromáticos en la tercera posición desde el extremo C-terminal aumenta considerablemente la afinidad de la enzima por el sustrato, aunque no el grado de catálisis (Abranowitz y col., 1967). Representantes de este grupo son la carboxipeptidasa C y la catepsina A.
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Metalo-carboxipeptidasas (EC 3.4.17):Al igual que las anteriores atacan el extremo C-termina], pero presentan un átomo metálico en el centro activo (Zn+ o Co2+). Pertenecen a este grupo las carboxipeptidasas A y B.