The implications for school governance

3.3.1. Identificación del nivel de ploidía mediante el análisis de la longitud de los estomas

Material vegetal: Se utilizaron plantas haploides (H) o doblehaploides (DH) producidas mediante cultivo de microsporas. Se analizaron 18 plantas de la variedad Chris y 75 plantas procedentes del cruzamiento F1 de interés agronómico 40xS83.

Metodología:

Se recogieron secciones de la segunda o tercera hoja más joven, a unos tres centímetros del extremo. Estas secciones se colocaron en una gota de agua bajo la lupa. Con un bisturí se realizó un corte transversal en la parte adaxial de la hoja, y con ayuda de unas pinzas se separó la epidermis y se colocó sobre una gota de agua en un portaobjetos.

En el cultivar Chris, se calculó la longitud media de los estomas de plantas en dos estadios de desarrollo distinto:

-Estadio 1: plántulas durante la fase de aclimatación en cámara de cultivo y que están comenzando la etapa de ahijamiento (hasta 4 hojas).

-Estadio 2: plantas durante la fase de cultivo en el invernadero que están en el comienzo de la etapa de encañado (8-12 hojas).

Los estomas se observaron bajo campo claro en un microscopio Nikon Eclipse T300. Se hicieron fotos a 100 aumentos de 8-10 campos con el programa Cool Snap. Para cada planta, se midió la longitud de 20 estomas.

Estas mismas plantas fueron analizadas mediante citometría de flujo (apartado 3.2.9) o se continuó su cultivo en el invernadero para obtener de semilla.

3.3.2. Tratamientos diploidizantes en planta

3.3.2.1. Método de inmersión de la raíz

Material vegetal: Se trataron plantas H, regeneradas a partir del cultivo de microsporas de los cruzamientos F1 de interés agronómico 23x21, 5x18 y 40xS83.

Solución de colchicina: La colchicina (concentración final del 0,1%) se disolvió en DMSO (2% del volumen final) y se enrasó hasta el volumen final con H2O destilada

(Jensen 1983).

Tratamiento: Las raíces se lavaron y se seccionaron a unos 5 cm de la corona. El tratamiento se llevó a cabo sumergiendo las raíces en un vaso de precipitados con la solución de colchicina, en la luz y con aireación. Plantas H de los cruzamientos 23x21 y 5x18 en estadio de 3-4 hojas fueron tratadas durante 3h y 5h. Plantas H del cruzamiento 40xS83 en estadio de 3-4 hojas y en estadio de encañado, fueron tratadas durante 5 h.

Una vez finalizado el tratamiento se lavaron las raíces en agua corriente y se plantaron en macetas de 15 cm de diámetro en el invernadero para producción de semilla.

3.3.2.2. Método del vial invertido

Material vegetal: Se utilizaron 45 plantas H del genotipo Chris, regeneradas a partir del cultivo de microsporas.

Solución de colchicina: La colchicina se disolvió en DMSO (2% del volumen final) y se enrasó hasta el volumen final con H2O destilada (Jensen 1983).

Tratamiento: Cuando las plantas comenzaron a espigar se cortaron los tallos más avanzados, dejando solo los tallos más jóvenes. Se colocó un vial con la solución de colchicina en una de las cañas cortadas y se fue rellenando durante el tratamiento, de forma que el nivel del líquido superara siempre el extremo cortado (Bell 1950).

Se realizaron 4 tratamientos diferentes, en los que se utilizaron dos concentraciones de colchicina (0.15% y 0.25%) y dos tiempos de duración del tratamiento (48 y 72 h).

El tratamiento se realizó en el invernadero a 18-22ºC con 16 h de luz (luz natural suplementada con focos).

3.3.3. Aplicación de colchicina durante las primeras fases del cultivo in vitro

3.3.3.1. Colchicina añadida al medio de pretratamiento de las anteras.

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Chris, Pavon y Caramba.

Tratamiento: Las anteras se inocularon en tres medios de pretratamiento (Tabla 3.1) a los que se había añadido diferentes concentraciones de colchicina: 0 mg/l, 150 mg/l y 300 mg/l (Fig. 3.5).

La colchicina se disolvió en H2O destilada y se esterilizó por filtración junto con

el manitol (apartado 3.2.2.1).

Las tres anteras de cada flor se distribuyeron de manera que cada tratamiento tuviera una antera de cada flor, reduciendo así la variabilidad causada por la asincronía en el estado de desarrollo de las microsporas dentro de una misma espiga. Se utilizaron aproximadamente 30 espigas por réplica.

Control T1 T2 Paso 1 Pretratamiento con 0 mg/l de colchicina Pretratamiento con 150 mg/l de colchicina Pretratamiento con 300 mg/l de colchicina Paso 2

Aislamiento Aislamiento Aislamiento

Paso 3 Cultivo Cultivo Cultivo

Fig. 3.5.- Tratamiento de anteras de trigo panadero con colchicina durante el pretratamiento. T: tratamiento.

Cultivo de microsporas: Se aislaron las microsporas de cada tratamiento por separado. El cultivo se continuó como se detalla en el apartado 3.2.6.2.

3.3.3.2. Colchicina aplicada durante las primeras horas de cultivo en el medio de inducción.

3.3.3.2.1. Cultivo de microsporas

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Chris y Pavon, y la línea DH 24033. Esta línea DH se escogió por sus bajos porcentajes de autoduplicación.

Tratamiento: Cada réplica consistió en un aislamiento en el que se utilizaron aproximadamente 50 espigas. Las microsporas procedentes de un mismo aislamiento se dividieron en cuatro partes iguales. Una de estas partes se inoculó en medio MSM-F300 tal y como se ha descrito en el apartado 3.2.6.2., y se utilizó como control sin tratamiento. Con las tres partes restantes se realizaron tres tratamientos en medio MSM: un control sin colchicina (0 mg/l) y dos concentraciones de colchicina, 150 mg/l y 300 mg/l (Fig. 3.6).

Los medios se prepararon disolviendo la colchicina en H2O destilada con los

demás componentes y esterilizando por filtración.

El tratamiento se realizó inoculando las microsporas en placas de 3 cm de diámetro con 2 ml de medio, durante 48 h a 24ºC en oscuridad.

Pretratamiento Aislamiento de microsporas Control T1 T2 T3 Paso 1 Cultivo Tratamiento 0 mg/l de colchicina Tratamiento 150 mg/l de colchicina Tratamiento 300 mg/l de colchicina

Paso 2 -- Lavado Lavado Lavado

Paso 3 -- Cultivo Cultivo Cultivo

Fig. 3.6.- Tratamiento de microsporas de trigo panadero con colchicina en el medio de cultivo. T: tratamiento.

Lavado: Después de 48 h se recogieron cuidadosamente las microsporas en el medio de tratamiento con una pipeta Pasteur y se traspasaron a un tubo de centrífuga de 15 ml. Para eliminar la colchicina se les añadió 12 ml de medio MSM fresco, se mezcló suavemente durante 1 min y se centrifugaron durante 5 min a 100 g. Se descartó el sobrenadante y las microsporas se suspendieron en unas gotas de medio MSM.

Cultivo: Las microsporas fueron inoculadas en medio preacondicionado MSM- F300 y cultivadas con ovarios como se detalla en el apartado 3.2.6.2.

3.3.3.2.2. Cultivo de anteras

Material vegetal: Se utilizaron las variedades Pavon y Caramba.

Tratamiento: Las anteras pretratadas se distribuyeron en tres tratamientos en medio MSM: un control sin colchicina (0 mg/l), y dos concentraciones de colchicina 150 mg/l y 300 mg/l.

Los medios se prepararon disolviendo la colchicina en H2O destilada con los

demás componentes y esterilizando por filtración.

Las anteras procedentes de una misma espiga se repartieron aleatoriamente entre los tres tratamientos. El tratamiento se realizó en placas de 3 cm de diámetro con 2 ml de medio, durante 48 h a 24ºC en oscuridad. Para cada réplica se utilizaron anteras de entre 2 y 3 espigas.

Lavado: El medio se extrajo con una pipeta Pasteur de punta fina de vidrio. Se efectuó un lavado con 2 ml de medio MSM sin colchicina durante 4-6 minutos.

Cultivo: Tras el lavado, se añadió el medio preacondicionado y los ovarios, para continuar con el cultivo como se detalla en el apartado 3.2.7.