Improving Quality of Crystalline Product (An example of problem

BRUCELLA.

En los últimos años han surgido dos nuevas estrategias de inmunización altamente efectivas, basadas en la vacunación con moléculas de ácidos nucleicos, generándose la aparición de las vacunas de tercera generación, que son las vacunas ADN y las ARN, aplicándose este tipo de estrategia para la infección por Brucella.

Vacunas ADN. La inmunización con vectores de expresión plasmidial se basa en las expresiones in vivo de algún antígeno seleccionado, que induciría una respuesta inmune protectora, y tienen algunas de las ventajas que presenta el uso de los patógenos vivas o atenuadas, pero sin el riesgo de la infección (Tang y col 1992). En principio, el método de vacunación con ácidos nucleicos se basa en el uso de un plásmido bacteriano que tiene un promotor viral fuerte capaz de expresarse en células eucariontes, un gen que codifica para un antígeno seleccionado y una secuencia de término de la transcripción o poliadenilación. El plásmido se replica en una bacteria (E. coli), se purifica y

luego se inyecta por una vía determinada en el huésped. Las células del huésped son capaces de sintetizar, procesar y presentar el antígeno a los linfocitos, originando eventualmente una respuesta de células T y B específicas para el antígeno seleccionado. El plásmido es fabricado sin su origen de replicación funcional en células eucariontes, por lo tanto nunca se replica en una célula huésped de mamífero, ni se integra al ADN cromosomal del hospedador (Donnelly y col 1997).

Mecanismos celulares de captura de ADN. Un paso crucial en el desarrollo

de la terapia génica por medio de la inyección de ADN desnudo, es la translocación del ADN a través de la membrana plasmática, esto es importante para determinar el mecanismo real de captura de ADN desnudo por células en tejido animal (Satkauskas y col 2001). Estudios en el sitio de inyección con

heparina, una molécula policatiónica que inhibe la captación de ADN, indican que la inhibición es dosis dependiente y compatible con la unión al receptor o al sitio de unión específico, asumiendo que el mecanismo de captación de ADN plasmidial es la endocitosis mediada por receptores (Satkauskas y col., 2001). Sin embargo, los últimos estudios en keratinocitos humanos muestran que el mecanismo de captación de ADN es a través de diferentes vías, principalmente por macropinocitosis, y se han identificado las proteínas CD44 e ICAM-1 involucradas en la unión y el tráfico de ADN (Basner-Tschakarjan y col 2004).

Mecanismos celulares involucrados en la respuesta inmune generada por la inmunización genética.

Algunas de las cualidades de las vacunas ADN son: expresar antígenos de proteínas nativas in vivo para reconocimiento de células B y presentación

por moléculas MHC clase I y II para estimular células T ayudadoras, linfocitos T citotóxicos. Así, el modo preciso de estimulación inmune de las vacunas ADN se reduce a una combinación de tres mecanismos por los que las proteínas codificadas por el ADN plasmidial son presentadas y procesadas para generar respuesta inmune: a) estimulación directa por células somáticas (miocitos, keratinocitos, o cualquier célula MHC clase II negativa), b) transfección directa de células presentadoras de antígeno (CPA) profesionales (Ej. células dendríticas) y c) presentación cruzada (crosspriming) en la cual el plásmido ADN transfecta una célula somática y/o CPA profesional y la proteína secretada es tomada por otra célula CPA profesional y presentada a células T (Donnelly y col 2000, Gurunathan y col 2000).

Vacunas ADN para B. abortus. Se ha demostrado que vacunas ADN

que contienen el gen para la proteína L7/L12 (Kurar y Splitter 1997) y lumazina sintetasa (Velikovsky y col 2002) inducen un significativo nivel de protección contra brucelosis en el modelo ratón. Por otro lado, ratones BALB/c vacunados con un plásmido ADN que tiene el gen (sodC) que codifica para la proteína

SOD Cu/Zn de Brucella abortus (pcDNA-SOD), desarrollan anticuerpos

específicos contra la proteína SOD recombinante (SODr), exhibiendo una dominancia de inmunoglobulinas de tipo IgG2a sobre IgG1, lo que induce una respuesta proliferativa por parte de células T, con la producción INF-γ pero no de IL-10 o IL-4, demostrando de esta forma que la inoculación con pcDNASOD

induce los anticuerpos adecuados y una respuesta inmune celular de tipo Th1, respuesta que es protectora frente al desafío con la cepa patógena de Brucella

(Oñate y col 2003). Además, se ha demostrado en el modelo murino que la inmunización intraesplénica con pcDNASOD induce una eficiente respuesta inmune tipo Th1 protectora y que la producción de IFN-γ es realizada por células T CD4+ y la inducción de actividad citotóxica, importante para la eliminación de bacterias facultativamente intracelulares como Brucella, es

realizada por las células T CD8+ (Muñoz y col 2004).

En bovinos, actualmente el único trabajo que ha estudiado la utilización de una vacuna ADN para Brucella describe que la inmunización con pcDNA-

SOD es capaz de estimular una respuesta inmune celular y una eficiente estimulación de células T citotóxicas, respuestas clave en la inducción de protección frente a Brucella. Lo que además destaca el trabajo, es la gran

variabilidad de respuesta observada en el ganado bovino, lo que podría atribuirse a la constitución genética de la especie bovina con la cual se trabajó, especies que no son 100% genéticamente puras (Guzmán y col 2004).

Vacunas ARN. Además de los vectores plasmidiales existen otros

vectores de expresión como los basados en el virus Semliki Forest (SFV). Estos vectores son partículas virales suicidas del virus Semliki Forest, cuyo genoma corresponde a un ARN desnudo autorreplicable, cuya secuencia contiene inserto el gen de interés que codifica para la proteína con capacidad inmune. Experimentos previos han demostrado la alta eficiencia de estos sistemas de expresión para expresar proteínas heterólogas en células eucariotas, así como también la capacidad para conferir excelentes niveles de protección en animales inmunizados con estos sistemas de expresión, superando incluso a las vacunas ADN (Andersson y col 2001, Fleeton y col 1999).

Virus Semliki Forest. El virus Semliki Forest es un Alfavirus que

pertenece a la familia Togaviridae. Este virus se transmite principalmente a través de mosquitos y es capaz de infectar al ser humano causándole fiebre, artritis y encefalitis (Willems y col 1979.). El virus Semliki Forest es un virus ARN que puede infectar una gran variedad de hospedadores y se replica de manera efectiva en células en cultivo. Este virus se ha utilizado en el estudio de

la biología molecular de los virus ARN y además se ha investigado su uso como instrumento en la expresión de proteínas recombinantes (Olkkonen y col 1993, Lundström y col 1994).

Entrada del virus a la célula hospedadora. El virus Semliki Forest

entra a la célula hospedadora por endocitosis mediada por receptores (probablemente antígenos de histocompatibilidad), que fijan la partícula viral a la membrana plasmática (Helenius y col 1978); estos receptores se concentran principalmente en invaginaciones de la membrana plasmática, recubiertas en su cara citosólica por una red de la proteína clatrina (DeTulleo y Kirchhausen 1998). En el citoplasma, la vesícula endocítica se fusiona con un endosoma, dentro del cual el pH es ácido, lo cual induce la disociación de la proteína estructural del virus E1E2, lo cual genera la formación del homotrímero E1E1E1, el que facilita la fusión de la membrana viral con el endosoma, liberándose la nucleocápside al citoplasma de la célula. Finalmente, las proteínas de la cápside liberan el genoma viral, mediante una reacción gatillada por ribosomas que se unen a algunos aminoácidos de esta proteína (residuos 94 al 106), los cuales están directamente implicados en la unión de la cápside con la molécula de ARN (Singh y Helenius 1992).

Elaboración de partículas virales suicidas del virus Semliki Forest.

A partir del virus Semliki Forest, Smerdou y Liljeström el año 1999 elaboraron una partícula viral recombinante que tiene la capacidad de infectar una célula eucariota animal y liberar su genoma en su interior. Esta partícula viral contiene en su interior un segmento de ARN mensajero, el cual puede ser traducido por la célula hospedera (Smerdou y Liljeström 1999). Para la construcción del virus se separó su genoma en tres plásmidos (pSFV4.2, pSFV-Helper-Capsid y pSFVHelper- Spike), plásmidos que son transcritos in vitro (transcrito ARNm), utilizándolos luego para transfectar una línea celular eucariota, obteniendo de esta forma partículas virales que son empaquetadas y liberadas al medio de cultivo. Durante el proceso de elaboración de las partículas virales in vitro, sólo el ARNm transcrito a partir del plásmido pSFV4.2

contiene la información necesaria para ser empaquetado al interior de la partícula viral, por ende, sólo éste ARNm formará parte del genoma viral (Smerdou y Liljeström 1999). El plásmido que codifica este transcrito contiene

un gen que codifica para la replicasa viral y un sitio de multiclonaje, en el cual se puede insertar un gen que codifique una proteína heteróloga (Frolov y col 1996). Estas características le confieren una alta bioseguridad al sistema, debido a que permiten elaborar partículas virales con un genoma incompleto, el cual no puede replicarse (partículas virales suicidas), funcionando como un simple pero eficiente vector de expresión de proteínas heterólogas (Smerdou y Liljeström 1999).

Vacunas ARN para B. abortus. Se ha evaluado en un modelo murino la

inducción de respuesta inmune y protección, por un ARN recombinante que codifica la proteína SOD Cu/Zn de B. abortus empaquetado en el interior de

partículas suicidas del virus Semliki Forest (VSF-SOD). Describiéndose que la inmunización con VSF-SOD estimula preferentemente una respuesta inmune de tipo Th1, con la inducción de proliferación de linfocitos T antígeno específica y activación de células T citotóxicas. Respuesta que fue protectora frente al desafío con una cepa patógena, indicándose su potencial uso como vacuna para Brucella (Oñate y col 2005).

Bandara, AB et al.en el 2009, en el Centro de Medicina Molecular y Enfermedades Infecciosas de la Facultad Regional de Virginia-Maryland de Medicina Veterinaria, Instituto Politécnico de Virginia y Universidad Estatal de Washington, en su experimento investigan la posibilidad de expresar un antígeno homólogo y un antígeno heterólogo de forma simultánea en una cepa atenuada de Brucella melitensis. El gen que codifica una Brucella wboA manosiltransferasa implicadas en la biosíntesis del lipopolisacárido antígeno O, y Bacillus anthracis la pag gen que codifica el antígeno protector (PA) se clonaron en el plásmido pBBR4MCS. El plásmido resultante se introdujo en el antígeno O deficientes de B. melitensis cepa WRRP1 para producir WRSPA. Colar WRSPA producido O-antígeno y una serie de productos PA, la protección inducida en ratones Balb / c frente al desafío con la cepa B. melitensis 16M, se dio pero no protegio a los ratones j frente al desafío con B. anthracis cepa Sterne. Clin Vaccine Immunol. 2009 Apr;16(4):535-40. Epub 2009 Jan 28.

Rajasekaran, P, et al., del. Departamento de Ciencias Biomédicas y Patobiología y el Centro de Medicina Molecular y Enfermedades Infecciosas de la Facultad Regional de Virginia-Maryland de la medicina veterinaria, Blacksburg, EE.UU. en el 2009, en su artículo. Brucella abortus strain RB51 leucine auxotroph as an environmentally safe vaccine for plasmid maintenance and antigen overexpression. (Brucella abortus cepa RB51 auxotroph leucina como una vacuna seguro en medio ambiente para el mantenimiento del plásmido y la sobreexpresión del antígeno). Inducen una respuesta para evitar

la propagación de potenciar un marcador de resistencia a los antibióticos, un plásmido que expresa un gen leuB y un antígeno heterólogo, la proteína verde fluorescente (GFP), se demostró que un complemento de leucina auxotroph de ganado cepa de la vacuna Brucella abortus RB51, protegía a los ratones CD1 de cepas virulentas de B. abortus 2308 y produjo anticuerpos GFP. Proteína verde fluorescente. Vet Microbiol. 2009 Feb 2; 133(4):387-93.

Resultados y la respuesta inmune después de la infección de Brucella abortus en ratones adultos jóvenes y ancianos.

Alto, KP, et al., de la Sección de Enfermedades Infecciosas del Departamento de Medicina Interna, Wake Forest Escuela Universitaria de Medicina, Winston Salem, EE.UU. en 2007, publican y dan a conocer en su artículo, Outcome and immune responses after Brucella abortus infection in young adult and aged mice. (Consecuencia y la respuesta inmune después de la

infección de Brucella abortus en ratones adultos jóvenes y ancianos). Que el

envejecimiento en los resultados de una disminución general de la inmunidad y mayor susceptibilidad a muchos patógenos intracelulares. Sin embargo, en algunos casos, el envejecimiento va acompañado de las respuestas inmunitarias alternativa que puede ser igual, o incluso más eficaces que los de los adultos jóvenes. Brucella spp. es una bacteria intracelular e importantes patógenos humanos y animales, pero no hay datos sobre el efecto de la edad en la defensa del huésped en la brucelosis. Jóvenes o viejos ratones adultos (DBA / 2 o BALB / c) estaban infectados con una cepa atenuada o bien B. abortus que la sobre-expresó la superóxido dismutasa Brucella (cepa RB51- SOD) o una cepa virulenta plenamente (cepa 2308). Survival, la carga organismo en el bazo, y las respuestas inmunitarias fueron evaluados. Todos

los adultos jóvenes y los ratones viejos sobrevivieron la infección con RB51- SOD (hasta 6 x 10 (8) ufc) o la cepa 2308 (hasta 8 x 10 (8) ufc). Los ratones viejos tuvieron una carga inferior en el bazo que los ratones adultos jóvenes de cinco o más semanas después de la infección. La respuesta a anticuerpos y de citoquinas Th1 fueron centrados en ratones adultos jóvenes, pero Th mixto en ratones más viejos, incluidas las pruebas de la nueva definición de la respuesta Th17 subtipo inmunológico. La inmunización con la cepa RB51-SOD brindó protección contra la cepa desafío en 2308 los jóvenes y los ancianos BALB / c, pero sólo los ratones adultos jóvenes DBA / 2. Por lo tanto, los resultados clínicos de la infección por Brucella en animales viejos, son iguales o superiores a las de los ratones adultos jóvenes; la respuesta inmune en ratones más viejos son menos-Th1 específicas que existen formas alternativas puede contribuir a la defensa del huésped frente a Brucella en ratones de edad avanzada.Biogerontology. 2007 Oct; 8(5):583-93.

.

CONCLUSIONES

1. Brucelosis es una zoonosis que no ha podido ser erradicada en la gran mayoría de los países, a pesar de la aplicación de agresivos programas de vacunación con vacunas basadas en bacterias vivas atenuadas.

2. Debido al potencial epidémico de Brucella y la eficiencia de la infección por

aerosoles, este patógeno es considerado un agente potencial que puede ser utilizado como arma biológica liberado en bombas o a la forma de aerosoles secos.

3. La citotoxicidad es crucial en la erradicación de bacterias intracelulares. Linfocitos T CD8+ pueden actuar como células efectoras y eliminar células infectadas con Brucella directamente lisándolas, por esto es fundamental

determinar la especificidad de clones de linfocitos TCD8+útiles en la protección frente a Brucella.

4. Algunas proteínas purificadas de Brucella ofrecen buenos niveles de

protección individualmente; posiblemente una vacuna compuesta por varias subunidades de proteínas antigénicas de Brucella proporcionaría una

protección superior.

5. La reciente generación de vacunas genéticas basadas en ácidos nucleicos ADN y ARN ofrecerían nuevas oportunidades de llegar a controlar las infecciones intracelulares.

Referencias

Abdoel TH, Smits HL. Rapid latex agglutination test for the serodiagnosis of human brucellosis. Diagn Microbiol Infect Dis 2007; 57:123-8.

Allardet-Servent A, Bourg G, Ramuz M, Pages M, Bellis M, Roizes G. DNA polymorphism in strains of the genus Brucella. J Bacteriol 1988;170: 4603-7. Al-Mofada SM, Al-Eissa YA, Saeed ES, Kambal AM. Isolation of Brucella

melitensis from human milk. J Infect 1993; 26:346-8.

Almuneef M, Memish ZA. Persistence of Brucella antibodies after successful treatment of acute brucellosis in an area of endemicity. J Clin Microbiol 2002; 40:2313.

Almuneef M, Memish ZA. Prevalence of Brucella antibodies after acute brucellosis. J Chemother 2003; 15:148-51.

Almuneef MA, Memish ZA, Balkhy HH, Alotaibi B, Algoda S, Abbas M, et al. Importance of screening household members of acute brucellosis cases in endemic areas. Epidemiol Infect 2004; 132:533-40.

Al-Shamahy HA, Wright SG. Enzyme-linked immunosorbent assay for Brucella antigen detection in human sera. J Med Microbiol 1998; 47 :169-72.

Amato Gauci AJ. The return of brucellosis. Maltese Med J 1995; 7:7-8.

Andres Morist A, Burzako Sanchez A, Montero Gato V, Franco Vicario R. Brucella endocarditis: Two cases with medical treatment and successful outcome. Med Clin (Barc) 2003; 120 :477 (Article in Spanish).

Araj GF. Enzyme-linked immunosorbent assay, not agglutination, is the test of choice for the diagnosis of neurobrucellosis. Clin Infect Dis 1997; 25 :942.

Ariza J, Gudiol F, Pallares R, Rufi G, Fernandez-Viladrich P. Comparative trial of rifampin-doxycycline versus tetracycline¬streptomycin in the therapy of human brucellosis. Antimicrob Agents Chemother 1985; 28: 548-51.

Arlett PR. A case of laboratory acquired brucellosis. BMJ 1996;313:1130-2. [Erratum in: BMJ 1997; 314:134].

Arroyo Carrera I, Lopez Rodriguez MJ, Sapina AM, Lopez Lafuente A, Sacristan AR. Probable transmission of brucellosis by breast milk. J Trop Pediatr 2006; 52:380-1.

Bachrach G, Banai M, Bardenstein S, Hoida G, Genizi A. Bercovier H. Brucella ribosomal protein L7/L12 is a major component in the antigenicity of brucellin INRA for delayed -type hypersensitivity in Brucella -sensitized guineapigs. Infect Immun 1994; 62:5361-6.

Baily GG, Krahn JB, Drasar BS, Stoker NG. Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification. J Trop Med Hyg 1992;95:271-5.

Bannatyne RM, Jackson MC, Memish Z. Rapid diagnosis of Brucella bacteremia by using the BACTEC 9240 system. J Clin Microbiol 1997; 35 : 2673-4.

Bandara AB, Poff-Reichow SA, Nikolich M, Hoover DL, Sriranganathan N,

Schurig GG, Dobrean V, Boyle SM.Clin Vaccine Immunol. 2009 Apr;16(4):535- 40.

Barbuddhe SB, Kumar P, Malika SV, Singh DK, Gupta LK. Seropositivity for intracellular bacterial infections among abattoir associated personnels. J Commun Dis 2000; 32:295-9.

Barroso Garcia P, Rodriguez-Contreras Pelayo R, Gil Extremera B, Maldonado Martin A, Guijarro Huertas G, Martin Salguero A, et al. Study of 1,595

brucellosis cases in the Almeria province (1972-1998) based on epidemiological data from disease reporting. Rev Clin Esp 2002; 202:577-82..

Bingol A, Togay-Isikay C. Neurobrucellosis as an exceptional cause of transient ischemic attacks. Eur J Neurol 2006; 13:544¬8.

Bodur H, Balaban N, Aksaray S, Yetener V, Akinci E, Colpan A, et al. Biotypes and antimicrobial susceptibilities of Brucella isolates. Scand J Infect Dis 2003; 35:337-8.

Boschiroli ML, Foulongne V, O'Callaghan D. Brucellosis: A worldwide zoonosis. Curr Opin Microbiol 2001;4 58-64.

Bosilkovski M, Krteva L, Caparoska S, Dimzova M. Hip arthritis in brucellosis: A study of 33 cases in the Republic of Macedonia (FYROM). Int J Clin Pract 2004; 58 :1023-7.

Buchanan TM, Faber LC, Feldman RA. Brucellosis in the United States, 1960- 1972. An abattoir-associated disease. Part I. Clinical features and therapy. Medicine (Baltimore) 1974; 53:403-13.

Buchanan TM, Faber LC. 2-mercaptoethanol Brucella agglutination test: Usefulness for predicting recovery from brucellosis. J Clin Microbiol 1980;11 :691-3.

Busch LA, Parker RL. Brucellosis in the United States. J Infect Dis 1972;125 :289-94.

Caksen H, Arslan S, Oner AF, Cesur Y, Ceylan A, Atas B, et al. Childhood brucellosis is still a severe problem in the eastern region of Turkey. Trop Doct 2002; 32:91-2.

Canning PC, Roth JA, Deyoe BL. Release of 5'-guanosine monophosphate and adenine by Brucella abortus and their role in the intracellular survival of the bacteria. J Infect Dis 1986; 154:464-70.

Caron E, Peyrard T, Kohler S, Cabane S, Liautard JP, Dornand J. Live Brucella spp. fail to induce tumor necrosis factor alpha excretion upon infection of U937- derived phagocytes . Infect Immun 1994; 62:5267-74.

Casao MA, Smits HL, Navarro E, Solera J. Clinical utility of a dipstick assay in patients with brucellosis: Correlation with the period of evolution of the disease. Clin Microbiol Infect 2003; 9:301-5.

Cellier MF, Teyssier J, Nicolas M, Liautard JP, Marti J, Sri Widada J. Cloning and characterization of the Brucella ovis heat shock protein DnaK functionally expressed in Escherichia coli. J Bacteriol 1992;174:8036-42.

Chadda VS, Soni PK, Gupta A, Gupta BK, Chadda S, Nayak KC. Incidence of brucellosis in arthritis and chronic low back pain in high risk group. J Assoc Physicians India 2004; 52:338.

Chauhan RS. Brucellosis in India and its impact on export of buffalo meat. Indian J Ani Prod 1999;31:316-7.

Ciftci E, Ince E, Dogru U. Pyrexia of unknown origin in children: A review of 102 patients from Turkey. Ann Trop Paediatr 2003; 23:259-63.

Cisneros JM, Pachon J, Cuello JA, Martinez A. Brucella endocarditis cured by medical treatment. J Infect Dis 1989; 160:907.

Cloeckaert A, Verger JM, Grayon M, Grepinet O. Restriction site polymorphism of the genes encoding the major 25 kDa and 36 kDa outer membrane proteins of Brucella. Microbiology 1995;141:2111-21.

Cloeckaert A, Vizcaino N, Paquet JY, Bowden RA, Elzer PH. Major outer