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El gen Retinoblastoma, RB1, codifica para la proteína pRB, primer supresor tumoral identificado a partir de un tipo de un tumor ocular infantil hederitario denominado Retinoblastoma (Friend, Bernards et al. 1986, Fung, Murphree et al. 1987). pRB es una fosfoproteína nuclear de 105kDa que presenta 16 sitios de fosforilación (Chen, Scully et al.

1989) siendo, junto con p107 (producto del gen

miembro principal de la familia Retinoblastoma. Estas proteínas comparten homología estructural y funcional (Ewen, Xing et al. 1991, Hannon, Demetrick et al. 1993)

relevante es el control de la progresión del ciclo celular a través de la modulación transcripcional (Weinberg 1995, Classon and Harlow 2002)

Los miembros de la familia Retinoblastoma presentan un dominio amino terminal, dos dominios conservados A y B, denominados región

espaciadora, y una región carboxilo terminal (Fig.6). El dominio

funcionalidad de estas proteínas ya que sirve como sitio de unión de diversas proteínas celulares como ciclinas, quinasas dependientes d

incluyendo miembros de la familia de factores de transcripción E2F

Mayol, Grana et al. 1993). Esta región conservada también puede unirse a oncoproteínas virales, como el antígeno T de SV40, la proteína E1A de adenovirus y la proteína E7 del virus del papiloma humano (VPH), lo que cond

Buchkovich et al. 1988, Dyson, Howley et al. 1989, Ewen, Ludlow et al et al. 1989, Munger, Werness et al. 1989)

Estos factores poseen dominios

unen a los miembros de la familia Retinoblastoma median la represión transcripcional, mientras que cuando se liberan pueden actuar como transactivadores

diferencias entre pRb, p107 y p130 radican en sus patrones de expresión diferencial durante el ciclo celular, y en su diferente capacidad de unión a los distintos miembros de la familia de E2F. Los factores activadores E2F1, 2 y 3a se asocian preferentemente a pRb, mientras que l represores E2F3b-5 lo hacen principalmente con p107 y p130

Fig. 6. Esquema estructural de los dominios compartidos por los miembros de la familia Retinoblastoma.

líneas negras representan las áreas de interacción con proteínas específicas (modificado de

107 (producto del gen RBL1) y p130 (producto del gen

miembro principal de la familia Retinoblastoma. Estas proteínas comparten homología (Ewen, Xing et al. 1991, Hannon, Demetrick et al. 1993)

el control de la progresión del ciclo celular a través de la modulación (Weinberg 1995, Classon and Harlow 2002).

Los miembros de la familia Retinoblastoma presentan un dominio amino terminal, dos dominios conservados A y B, denominados región pocket, separados por una región espaciadora, y una región carboxilo terminal (Fig.6). El dominio pocket es primordial para la funcionalidad de estas proteínas ya que sirve como sitio de unión de diversas proteínas celulares como ciclinas, quinasas dependientes de ciclina (CDKs) y factores de transcripción, incluyendo miembros de la familia de factores de transcripción E2F (Lee, Shew et al. 1987, . Esta región conservada también puede unirse a oncoproteínas virales, como el antígeno T de SV40, la proteína E1A de adenovirus y la proteína E7 del virus del papiloma humano (VPH), lo que conduce a la liberación de los factores E2F

Buchkovich et al. 1988, Dyson, Howley et al. 1989, Ewen, Ludlow et al. 1989, Horowitz, Yandell et al. 1989, Munger, Werness et al. 1989). Se han identificado 8 miembros de la familia de E2F. Estos factores poseen dominios de transactivación y de represión transcripcional. Cuando se unen a los miembros de la familia Retinoblastoma median la represión transcripcional, mientras que cuando se liberan pueden actuar como transactivadores

107 y p130 radican en sus patrones de expresión diferencial durante el ciclo celular, y en su diferente capacidad de unión a los distintos miembros de la familia de

Los factores activadores E2F1, 2 y 3a se asocian preferentemente a pRb, mientras que l 5 lo hacen principalmente con p107 y p130 (Classon and Dyson 2001)

Fig. 6. Esquema estructural de los dominios compartidos por los miembros de la familia Retinoblastoma.

líneas negras representan las áreas de interacción con proteínas específicas (modificado de Wirt y Sage, 2010).

10 ) y p130 (producto del gen RBL2), el miembro principal de la familia Retinoblastoma. Estas proteínas comparten homología (Ewen, Xing et al. 1991, Hannon, Demetrick et al. 1993). Su función más el control de la progresión del ciclo celular a través de la modulación

Los miembros de la familia Retinoblastoma presentan un dominio amino terminal, dos separados por una región es primordial para la funcionalidad de estas proteínas ya que sirve como sitio de unión de diversas proteínas e ciclina (CDKs) y factores de transcripción, (Lee, Shew et al. 1987, . Esta región conservada también puede unirse a oncoproteínas virales, como el antígeno T de SV40, la proteína E1A de adenovirus y la proteína E7 del virus uce a la liberación de los factores E2F (Whyte, . 1989, Horowitz, Yandell . Se han identificado 8 miembros de la familia de E2F. de transactivación y de represión transcripcional. Cuando se unen a los miembros de la familia Retinoblastoma median la represión transcripcional, mientras que cuando se liberan pueden actuar como transactivadores. Las principales 107 y p130 radican en sus patrones de expresión diferencial durante el ciclo celular, y en su diferente capacidad de unión a los distintos miembros de la familia de Los factores activadores E2F1, 2 y 3a se asocian preferentemente a pRb, mientras que los

(Classon and Dyson 2001).

Fig. 6. Esquema estructural de los dominios compartidos por los miembros de la familia Retinoblastoma. Las

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2.1.1. Implicación de pRb en el control del ciclo celular.

pRb en su estado activo (hipofosforilado) inhibe la proliferación celular controlando negativamente la transición de la fase G1 a la fase S del ciclo celular (Weinberg 1995, Sherr and McCormick 2002, Burkhart and Sage 2008) mediante la inhibición de la familia de factores de transcripción E2F, lo que impide la transcripción de genes esenciales para la replicación del ADN en la fase S (Dyson 1998, Chen, Tsai et al. 2009)(Fig.7). Durante la progresión normal del ciclo celular, la proteína pRB es funcionalmente inactivada por fosforilaciones llevadas a cabo por complejos de ciclinas/quinasas dependientes de ciclinas (CDKs) (Lee, Shew et al. 1987, Mayol, Grana et al. 1993, Sherr and Roberts 1999, Malumbres and Barbacid 2001, Malumbres and Barbacid 2009). Como consecuencia de la fosforilación de pRB, se produce la liberación de los factores E2F promoviendo la transcripción de genes implicados en el avance de ciclo celular. A su vez, todo este sistema está regulado negativamente por los inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CKIs), que impiden la formación o inhiben los complejos ciclina/CDKs (Harper and Elledge 1996).

Múltiples factores pueden ocasionar una incorrecta regulación del ciclo celular permitiendo su progresión incontrolada. Así, el aumento en la expresión o mutación en ciclinas o en CDKs, la inactivación de CKIs, la unión de oncoproteínas virales a pRB, o la inactivación génica del gen RB1, conllevan a la liberación de los factores E2F iniciando la transcripción de genes implicados en la replicación del ADN y en el control de varias actividades del ciclo celular, pudiendo ocasionar en último término alteraciones patológicas como el cáncer (Johnson and Schneider-Broussard 1998).

Aparte de sus funciones reguladoras sobre el ciclo celular, las proteínas de la familia de Retinoblastoma están involucradas en otros procesos celulares como diferenciación, apoptosis, angiogénesis o en la transcripción génica que regula la senescencia (Condorelli, Testa et al. 1995, Gabellini, Del Bufalo et al. 2006, Khidr and Chen 2006, Chicas, Wang et al. 2010, Hilgendorf, Leshchiner et al. 2013). Algunas de estas funciones están mediadas por su interacción directa con los miembros de la familia de E2F, o de forma indirecta reclutando co- represores o activadores para factores de transcripción específicos, o modificadores que regulan la estructura de la cromatina (Claudio, Stiegler et al. 2001, Trimarchi and Lees 2002, Costa, Paramio et al. 2013).

12 Fig. 7. Esquema del ciclo celular. Representación de las distintas etapas del ciclo celular: G1, S, G2 y M. Los

complejos ciclina D/CDK4 y 6, ciclina E/CDK2 y ciclina A/CDK2, inician la fosforilación de pRB controlando la transición G1/S del ciclo. Los complejos ciclina B/CDK1 prosiguen con la fosforilación secuencial de pRB participando en la transición S/G2 del ciclo. Estas fosforilaciones permiten la liberación de los factores E2F que activan la transcripción génica necesaria para la replicación del ADN y la progresión del ciclo celular (modificada de Moghadam, Hanks et al., 2011).

2.1.2. Papel de pRb en la epidermis y en el desarrollo tumoral epitelial.

En tumores humanos, el gen RB1 se encuentra mutado con una frecuencia relativamente baja. Sin embargo, la proteína pRB se encuentra inactivada funcionalmente en la práctica totalidad de los tumores como consecuencia de alteraciones en el eje (pRB/ciclina/CDK/INK4) que controla su actividad (Goodrich 2006, Hanahan and Weinberg 2011). La implicación de la vía de Retinoblastoma en el desarrollo tumoral epidérmico se ha demostrado en múltiples estudios (Rodriguez-Puebla, LaCava et al. 2000, Paramio, Segrelles et al. 2001, Sotillo, Dubus et al. 2001, Wang, Russell et al. 2001). En estos estudios ha sido fundamental la utilización de modelos animales modificados genéticamente. Los animales deficientes en Rb1 son letales embrionarios entre los días 13,5-15,5 de desarrollo. Estos animales presentan un aumento en la proliferación y en la apoptosis en retina, sistema nervioso central e hígado; además de presentar una hematopoyesis defectuosa (Clarke, Maandag et al. 1992, Jacks, Fazeli et al. 1992, Lee, Chang et al. 1992). La morfogénesis de la epidermis comienza en torno al día 14,5 de gestación, lo que imposibilita la utilización de este modelo para estudiar su papel en la epidermis. Para eludir este problema, se ha recurrido a la inactivación específica de Rb1 en la capa basal de los epitelios estratificados empleando la tecnología Cre/LoxP (Sauer and Henderson 1988). Para ello, se cruzaron ratones transgénicos portadores de la secuencia LoxP flanqueando el exón 19 de Rb1 (Vooijs, te Riele et al. 2002) con ratones que expresaban la recombinasa Cre bajo el promotor de la K14 (Meuwissen,

13 Jonkers et al. 2001). El fenotipo de estos animales, mostró que la deficiencia de pRb en epidermis de ratón (pRbΔEpi_{) promueve un incremento proliferativo y ocasiona alteraciones en}

la diferenciación que conducen a una hiperplasia e hiperqueratosis epidérmica moderada, pero no al desarrollo de tumores espontáneos (Ruiz, Santos et al. 2004), debido en parte a la compensación funcional mediada por p107 (Ruiz, Santos et al. 2004, Lara, Garcia-Escudero et al. 2008). De hecho, la pérdida de uno o ambos alelos de p107 agrava el fenotipo de los animales pRbΔEpi _{de forma dependiente del número de copias de p107 (Ruiz, Santos et al.}

2004). Por otro lado, los animales pRbΔEpi sometidos a protocolos de carcinogénesis química en piel (DMBA/TPA) muestran un número menor de tumores que los animales controles, pero con un mayor grado de malignidad (Ruiz, Santos et al. 2005). Esto es consecuencia de una mayor inducción de p53 en los tumores benignos (papilomas) de los animales pRbΔEpi_{. Dicha}

inducción genera una presión selectiva que conduce a la pérdida prematura de p53, lo que a su vez acarrea la malignización tumoral (Ruiz, Santos et al. 2005, Ruiz, Santos et al. 2006). De hecho, la pérdida de p53 en epidermis es suficiente para el desarrollo tumoral (Martinez-Cruz, Santos et al. 2008, Martinez-Cruz, Santos et al. 2009) y la metástasis a través de procesos de transición epitelio mesénquima (Bornachea, Santos et al. 2012). La doble deficiencia de pRb y p53 en la epidermis de ratón (pRbΔEpi;p53ΔEpi), no agrava el fenotipo epidérmico de los ratones pRbΔEpi, pero conduce a una aceleración en el desarrollo tumoral en comparación con los animales p53ΔEpi (Martinez-Cruz, Santos et al. 2008, Martinez-Cruz, Santos et al. 2009).