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Una vez elegida la especie y el contaminante, se realizaron pruebas con plantas in vitro en condiciones controladas de luz y temperatura. Se eligió el cultivo in vitro para garantizar que no se producirían interferencias microbianas en los resultados. Las pruebas consistieron en la evaluación del crecimiento foliar y radicular de los chopos híbridos en presencia de distintas concentraciones de Aroclor 1221 diluido en DMSO estéril, desde 0 (control), hasta 200 mg/L y a dos tiempos, 5 y 15 días. Era difícil establecer las condiciones óptimas de tratamiento a priori, ya que la tolerancia varía mucho según la especie y el estado fisiológico de cada ejemplar, por no mencionar las condiciones del medio (Yang et al., 2013). En nuestros análisis utilizamos chopos enraizados durante 2 meses, para evitar expresiones génicas asociadas a estadios muy juveniles y también para minimizar los posibles efectos de los transplantes. El cultivo in vitro de leñosas, se considera generalmente muy difícil, si bien hay protocolos de regeneración más o menos eficaces para algunas especies. El hibrido elegido para esta Tesis es particularmente viable y, de hecho, lidera la literatura sobre biotecnología forestal (Harfouche et al., 2012; Isebrands y Richardson, 2014).

Las comparaciones entre plantas tratadas y plantas control revelaron diferencias significativas en algunas variables cuantitativas (ver apartado 4.1.1. de Resultados). El crecimiento de la planta en general y el sistema radical disminuyó conforme aumentaban la concentración de PCB y el tiempo de exposición. También aparecieron síntomas de clorosis y necrosis foliar (Figura 12). Estos efectos concuerdan con respuestas típicas de estrés celular (Proudfoot et al., 2002; Yang et al., 2013). En nuestro caso, los análisis de crecimiento y morfológicos han servido para valorar la respuesta del chopo a distintos niveles de PCBs y seleccionar las condiciones experimentales óptimas para los tratamientos.

Discusión

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5.2. Secuenciación por RNA seq

Desde el punto de vista científico, el reto principal de esta Tesis era identificar mecanismos relevantes que pudieran participan en el metabolismo de PCBs y comprender su regulación. No se conoce hasta la fecha ninguna ruta degradativa en plantas para este tipo de compuestos. Esta información es imprescindible, sin embargo, si aspiramos a mejorar las capacidades naturales de algunas especies vegetales para remediar suelos contaminados. En este sentido, las tecnologías de alto rendimiento, como la transcriptómica utilizada aquí, ofrecen una serie de ventajas a la hora de procesar y analizar datos biológicos complejos como los mecanismos moleculares que subyacen a la respuesta a PCBs. Se sábe que las modificaciones en la expresión génica desempeñan un rol importante en la respuesta al estrés ambiental y que estas modificaciones siguen patrones específicos de co- expresión y co-regulación (Ramel et al., 2007; Weisman et al., 2010).

Decidimos utilizar en concreto tecnología RNA-seq, porque proporciona una visión comprehensiva del transcriptoma y permite detectar un rango amplio dinámico de niveles de expresión (Mader et al., 2011). Esta estrategia presenta ventajas frente al uso de microarrays. En primer lugar, tiene mayor sensibilidad y reproductibilidad, además de requerir menor cantidad de RNA de partida (Wang et al., 2009; Oshlack et al., 2010, Chen et al., 2011). En segundo lugar, permite capturar un mayor nñumero de tránscritos expresados. De hecho, los mientras que los análisis basados en microarrays dependen de anotación genética a priori y no son capaces de detectar nuevos genes o transcritos. En tercer lugar, genera información no solo de la secuencia, sino también de la estructura de exones y posibles eventos de splicing alternativo (Lister et al., 2009; Gulledge et al., 2012). Por si fuera por los datos arrojados por RNA-seq tienen en general una precisión alta, comparable a los estudios de expresión génica que se obtienen a través de qRT-PCR (Nagalakshmi et al., 2008; Wang et al., 2009; Ward et al., 2012).

El procedimiento general en este tipo de análisis consiste en la fragmentación del RNA y la secuenciación de fragmentos cortos mediante alguna de las tecnologías disponibles en el mercado, como la de Solexa/Illumina, SOLiD o Roche, generando secuencias de entre 35 y 500 pb (Martin y Wang 2011). Para esta Tesis se seleccionó a Solexa/Illumina como plataforma de secuenciación, ya que en comparación con las otras es más económica, y fiable. Además, ya contábamos con un genoma de

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referencia (P. trichocarpa) por lo que era innecesaria la mayor capacidad de lecturas proporcionadas por Roche/454. Está demostrada la aplicabilidad de esta tecnología a la hora de caracterizar y cuantificar transcriptomas, así como de analizar variaciónes de la expresión génica. En cuanto estudios relacionados con contaminación podemos citar a Halimaa et al. (2014), quienes emplearón RNA-seq para analizar la expresión génica diferencial entre ecotipos de Noccaea carulescen e identificar genes candidatos para fitorremediar metales pesados. También a Uren et al. (2013) que utilizaron RNA-seq para analizar la respuesta global a metales en trucha. Sin embargo nunca se han estudiado ni identificado genes que participan en el mecanismo de respuesta a PCBs con RNA–seq u otras tecnologías de secuenciación similares.

El primer paso del proceso experimental hacia la secuenciación consistió en la extracción de RNA de alta calidad (ver Figura 13 de Resultados) para dos concentraciones de PCBs y en dos momentos distintos de exposición. Esto nos permitió tener información para un nivel bajo y otro alto de contaminante, además de un tiempo temprano y otro tardío. Obtuvimos así cinco librerías de cDNA conteniendo numerosos transcritos que fueron analizados en esta Tesis. Tras la purificación del RNA, procedimos a su fragmentación, transcripción reversa, sisntesis de cDNA y ligación de adaptadores para secuenciación en un sistema RNA- seq Illumina 2000.