Para la síntesis de nanopartículas de PVP, QN y PVP/QN se siguió el procedimiento de gelación iónica previamente reportado por el grupo de Calvo y colaboradores [60, 61, 111] con algunas variaciones [77]. Sin embargo, hasta donde es del conocimiento de nuestro grupo de trabajo es la primera vez que se emplea esta ruta para la síntesis de nanopartículas de PVP, así como el estudio de la influencia de la velocidad de adición del surfactante en la fabricación de micro y nanoestructuras de PVP/QN.
Protocolo de síntesis de nanopartículas de Quitosán de bajo peso molecular (50-190kDa)
La síntesis de todas las muestras fabricadas se fabricaron en condiciones estériles para un volumen final de 72 ml.
Material y equipo
Quitosán 50-190kDa (QN, DD85%, Sigma CAS 9012-76-4) Agua inyectable
Tripolifosfato como surfactante (TPP, Sigma CAS 7758-29-4) Ácido acético (AA, grado molecular)
Parafilm
Vasos de precipitados despirogenizados Tubos cónicos
Capítulo 3 59 | P á g i n a Jeringas Agitador magnético Bomba de infusión Vortex Revco Liofilizadora Campana Clase II A2
Centrífuga de temperatura controlada Procedimiento
1. Se prepara una solución de agua inyectable al 1.75 %v/v (pH 3) en un vaso de precipitado, empleando AA bajo agitación magnética vigorosa.
2. Se incorpora quitosán de bajo peso molecular (50-190kDa) en la solución previa en agitación lenta, hasta obtener una solución al 0.5 %p/v. Se prepara una solución de TPP en agua inyectable al 0.25 %w/v y se agita vigorosamente en vortex por 5 minutos.
3. Se adiciona la solución de TPP a la solución cristalina de QN bajo agitación vigorosa a una velocidad constante seleccionada (15, 35 y 70 ml/h) en relación 1:5 v/v.
4. La solución de Quitosán/TPP se centrifuga al menos a 5000 rpm por espacio de 1 hora (T = -10°C). Al volumen centrifugado se le retira el sobrenadante, dejando un volumen mínimo de 15 ml del fondo, el cual se trasvasa a viales despirogenizados para proceder a su congelación (T = - 70°C, t = 12 h) y liofilizado (T = -50°C, p = 0.035 mbar, t = 24 h). El polvo color blanco resultante es almacenado en viales estériles y guardado en atmósfera inerte. Se recomienda pesar las muestras antes y después del liofilizado para obtener una relación volumen/peso de nanopartículas obtenidas.
Protocolo de síntesis de nanopartículas de Quitosán de medio y alto pesos moleculares (190-310kDa) y (310-375kDa)
La síntesis de todas las muestras fabricadas se fabricaron en condiciones estériles para un volumen final de 72 ml.
Material y equipo
Quitosán 190-310kDa y 310-375kDa (QN, DD85%, Sigma CAS 9012-76-4) Agua inyectable
Tripolifosfato como surfactante (TPP, Sigma CAS 7758-29-4) Ácido acético (AA, grado molecular)
Capítulo 3
60 | P á g i n a Parafilm
Vasos de precipitado despirogenizados Tubos cónicos Jeringas Agitador magnético Bomba de infusión Vortex Revco Liofilizadora Campana Clase II A2
Centrífuga de temperatura controlada Procedimiento
1. Se prepara una solución de agua inyectable al 1.75 %v/v en un vaso de precipitado, empleando AA para obtener un pH = 3, bajo agitación magnética vigorosa.
2. Se incorpora QN de medio o alto peso molecular (190-310kDa o 310- 375kDa) en la solución previa en agitación lenta hasta obtener una solución cristalina al 0.5 %p/v. Se prepara una solución de TPP en agua inyectable al 0.25 % w/v y se agita vigorosamente en vortex por 5 minutos.
3. Se adiciona la solución de TPP a la solución cristalina de QN, previo filtrado a través de tamiz de 40 µm, bajo agitación vigorosa a una velocidad constante seleccionada (15, 35 y 70 ml/h) en relación 1:5 v/v.
4. La solución de QN/TPP se centrifuga al menos a 5000 rpm por espacio de 1 hora (T = -10 °C). Al volumen centrifugado se le retira el sobrenadante, dejando un volumen mínimo de 15 ml del fondo, el cual se trasvasa a viales despirogenizados para proceder a su congelación (T = -70 °C, t = 12 h) y liofilizado (T = -50 °C, p = 0.035 mbar, t = 24 h). El polvo color blanco resultante es almacenado en viales estériles y guardado en atmósfera inerte. Se recomienda pesar las muestras antes y después del liofilizado para obtener una relación volumen/peso de nanopartículas obtenidas.
Protocolo de síntesis de nanopartículas de PVP (10 y 40 kDa)
La síntesis de todas las muestras fabricadas se fabricaron en condiciones estériles para un volumen final de 72 ml.
Material y equipo
PVP 10 y 40 kDa (PVP10 o PVP40, Sigma CAS 9003-39-8) Agua inyectable
Capítulo 3
61 | P á g i n a Tritonx100 como surfactante (Sigma CAS 9002-93-1)
Parafilm
Vasos de precipitado despirogenizados Tubos cónicos Jeringas Agitador magnético Bomba de infusión Vortex Revco Liofilizadora Campana Clase II A2
Centrífuga de temperatura controlada Procedimiento
1. Se incorpora PVP (10 o 40 kDa) en agua inyectable para obtener una solución al 0.5 %p/v. Se prepara una solución de Tritónx100 en agua inyectable al 0.25 %w/v y se agita vigorosamente en vortex por 5 minutos. 2. Se adiciona la solución de Tritónx100 a la solución de PVP (10 o 40 kDa)
bajo agitación vigorosa a una velocidad constante seleccionada (15, 35 y 70 ml/h) en relación 1:5 v/v.
3. La solución de PVP/Tritónx100 se centrifuga al menos a 5000 rpm por espacio de 1 hora (T = -10°C). Al volumen centrifugado se le retira el sobrenadante, dejando un volumen mínimo de 15 ml del fondo, el cual se trasvasa a viales despirogenizados para proceder a su congelación (T = - 70°C, t = 12 h) y liofilizado (T = -50 °C, p = 0.035 mbar, t = 24 h). El polvo color blanco resultante es almacenado en viales estériles y guardado en atmósfera inerte. Se recomienda pesar las muestras antes y después del liofilizado para obtener una relación volumen/peso de nanopartículas obtenidas.
Protocolo de síntesis de nanopartículas copoliméricas QN/PVP
La síntesis de todas las muestras fabricadas fue en condiciones estériles para un volumen final de 288 ml. Se realizaron combinaciones de todos los pesos moleculares y velocidades de agregación, resumidos en la Tabla 7.
Material y equipo
Quitosán (QN; 50-190kDa, 190-310kDa y 310-375kDa; DD85%; Sigma CAS 9012-76-4)
PVP 10 y 40 kDa (PVP10 y PVP40, Sigma CAS 9003-39-8) Agua inyectable
Capítulo 3
62 | P á g i n a Tripolifosfato como surfactante (TPP, Sigma CAS 7758-29-4)
Ácido acético (AA, grado molecular) Filtros de separación celular 40µm Parafilm
Vasos de precipitados despirogenizados Tubos cónicos Jeringas Agitador magnético Bomba de infusión Vortex Revco Liofilizadora Campana Clase II A2
Centrífuga de temperatura controlada Procedimiento
1. Se prepara una solución de agua inyectable al 1.75 %v/v en un vaso de precipitado, empleando AA para obtener un pH = 3, bajo agitación magnética vigorosa.
2. Se incorpora QN de bajo (QNL, 50-190 kDa), medio (QNM, 190-310 kDa) o alto (QNH, 310-375 kDa) peso molecular en la solución previa en agitación lenta, hasta obtener una solución al 0.5 %p/v. Se prepara una solución de TPP en agua inyectable al 0.25 %w/v y se agita vigorosamente en vortex por 5 minutos.
3. Al QN disuelto al 0.5 %, y previamente filtrado, se le agrega una cantidad proporcional de PVP en peso molecular equivalente al peso molecular promedio del quitosán empleado.
4. Se adiciona la solución de TPP a la solución cristalina de QN, previamente filtrada a través de tamiz de 40 µm, bajo agitación vigorosa a una velocidad constante seleccionada (15, 35 y 70 ml/h) en relación 1:5 v/v.
5. La solución de QN/TPP se centrifuga al menos a 5000 rpm por espacio de 1 hora (T = -10°C). Al volumen centrifugado se le retira el sobrenadante, dejando un volumen mínimo de 15 ml del fondo, el cual se trasvasa a viales despirogenizados para proceder a su congelación (T = -70°C, t = 12 h) y liofilizado (T = -50 °C, p = 0.035 mbar, t = 24 h). El polvo color blanco resultante es almacenado en viales estériles y guardado en atmósfera inerte. Se recomienda pesar las muestras antes y después del liofilizado para obtener una relación volumen/peso de nanopartículas obtenidas.
Capítulo 3
63 | P á g i n a METODOLOGIA EXPERIMENTAL PARA
LA SINTESIS Y CARACTERIZACION DE BPNP´S
Síntesis de BPNP´s PVP, QN y PVP/QN
Caracterización óptica y estructural FTIR, FE-SEM, TEM, DLS)
NO
Funcionalización
Estudio de cinética molecular
proteína E sobre PNP´s (SPR, XPS) si ¿Monodispersas y composición química adecuada? FIN
La Tabla 7 condensa las condiciones de síntesis empleadas durante la fabricación de micro y nanopartículas de PVP10, PVP40, QNL, QNM, QNH y sus copolímeros, mientras que las Figuras 18 y 19 se presenta el diagrama de flujo de la metodología empleada durante el proceso de síntesis y caracterización de las estructuras.
Tabla 7. Resumen de los polímeros sintetizados mediante gelación iónica y las distintas especies que van desde la síntesis de nanopartículas de los polímeros y copolímeros así como las distintas velocidades de
agregación de surfactante que fueron empleadas. Tipo de Polímero o co-
polímero Peso molecular (kDa) Velocidad de agregación de surfactante (ml/h) Número de muestras PVP10 10 15,35,70 3 PVP40 40 15,35,70 3 QN L 50-190 15,35,70 3 QN M 190-310 15,35,70 3 QN H. 310-375 15,35,70 3 PVP10/QN L 10/120 15,35,70 3 PVP10/QN M 10/250 15,35,70 3 PVP10/QN H 10/342.5 15,35,70 3 PVP40/QN L 40/120 15,35,70 3 PVP40/QN M 40/250 15,35,70 3 PVP40/QN H 40/342.5 15,35,70 3
L = bajo peso molecular, M = medio peso molecular, H = Alto peso molecular
Figura 18. Diagrama de flujo del procedimiento experimental de síntesis de NP´s biopoliméricas y copoliméricas.
Capítulo 3
64 | P á g i n a Figura 19. Diagrama esquemático del proceso de fabricación y caracterización de nanopartículas
biopoliméricas de QN y PVP.