6.4.1 Enriquecimiento en cultivo en suspensión de las células
derivadas del PC
Una vez determinado que los trazados de linaje escogidos a través de la expresión de los genes Myf5, Pax3 y Pax7 definían el tejido y las células de interés, se analizaron los cultivos en suspensión con la idea de localizar en las esferas células derivadas de estos linajes.
Tal y como se ha descrito anteriormente, se detectaron células miogénicas durante la primera fase de cultivo en condiciones de suspensión (Figura 6.3, 6.4 y 6.5), pero en este caso, además de determinar la presencia de células miogénicas, se analizó si estas se mantenían durante el cultivo hasta el último día e incluso si proliferaban. Antes de valerse de los trazados para responder a estas preguntas se volvieron a analizar los datos de expresión génica obtenidos por RT- qPCR relativos a la Figura 6.4, pero esta vez normalizando los datos de cada muestra en base a la expresión de su respectivo día 1 (Figura 6.30). La expresión de los genes Miogenina (Figura 6.30 C) y MyH3 (Figura 6.30 D) en la muestra 1 aumentaban considerablemente tras 7 días en cultivo aunque no tanto en las otras dos muestras, no observándose un incremento en la expresión de los otros genes Pax7, MyoD1 y MyH2 (Figura 6.30 A, B, E, respectivamente).
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Figura 6.30. Expresión de determinados genes miogénicos a día 7 de cultivo en suspensión respecto a su expresión
inicial. Se analizó la expresión de los genes Pax7 (A), MyoD1 (B), Miogenina (C), MyH3 (D) y MyH2 (E), mostrando los datos en fold-change normalizados respecto a su correspondiente día 1 de los valores obtenidos de muestras provenientes de tres ratones distintos. En los paneles C y D los datos se exponen en gráficas dobles donde se representan en la parte superior todos los datos en referencia al eje izquierdo y en la parte inferior los mismos datos pero en referencia al eje derecho que dispone de una escala menor para poder ver los valores de los datos de forma adecuada.
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Seguidamente se verificó la presencia de células positivas para EYFP o EGFP a través de un análisis del cultivo en suspensión a los 7 días por citometría de flujo (Figura 6.31 A-D). Se detectó un porcentaje variable de células derivadas de los precursores que habían expresado los genes escogidos para los trazados; 72,2 ± 9,9 % en el caso de las muestras de Myf5CreSOR; R26YFP(Figura
6.31 A), 17,6 ± 18,4 % en las muestras de B195APCre; R26YFP (Figura 6.31 B), 56,3 ± 8,3 % en el
trazado de Pax3Cre/+; ROSAmTmG (Figura 6.31 C) y en el del Pax7CreER2/+; ROSAmTmG un 17,4 ± 15,9
% (Figura 6.31 D). Por lo tanto, estas células se mantenían en estas condiciones de cultivo y más aún, proliferaban a lo largo de los días del cultivo, tal y como se vio al analizar cultivos del trazado de Pax7CreER2/+; ROSAmTmG a día 1, 3 y 7, donde se detectó un creciente número de células
positivas para EGFP (Figura 6.31 E). Estos resultados indicaban que las células derivadas de los precursores miogénicos proliferaban en estas condiciones de cultivo y exhibían una ventaja relativa sobre otras células presentes en la esfera en cuanto a la supervivencia y/o a la tasa de proliferación.
A través de estos experimentos se confirmó que las células trazadas hasta el cultivo en suspensión provenían de células precursoras miogénicas, pero no necesariamente del PC o de la muestra de tejido disociada original, estas células podrían generarse durante el cultivo in vitro al formarse las esferas. Se realizó un estudio del transcriptoma de estas células al inicio y al final del cultivo en suspensión con el fin de determinar si se trataba de poblaciones celulares diferentes o relacionadas entre sí. Para ello se aisló la población positiva para el linaje de Myf5 trazado por
B195APCre mediante una separación por citometría de flujo a día 0 y 7 del cultivo, y una vez obtenida la población de interés se analizó su patrón de expresión génica (Figura 6.31 F-G). Entre los 4.735 genes diferencialmente expresados entre las dos muestras, 52 sondas (15 genes) estaban asociadas por ontología génica (Gene Ontology (GO)) con la categoría de “Células satélite” y 154 sondas (63 genes) se clasificaron bajo la de “Diferenciación de células musculares estriadas” (Figura 6.31 F). A través del análisis de estas sondas o genes miogénicos se estableció que los marcadores asociados a las células satélite activadas y/o a mioblastos inmaduros como Musk, MyoD1, Shh,
Igfbp5 y Bmp4 se expresaban preferentemente a día 0 y en cambio, aquellos asociados con la
determinación y/o diferenciación de los mioblastos como Cdh2, Rara/Rarb, MyH3, Kcnh1 y Myf6 se encontraban sobreexpresados a día 7 (Figura 6.31 G). Así pues se observaron diferencias mínimas entre las poblaciones celulares analizadas, más relacionadas con la aparición de genes miogénicos propios de la maduración y definición de esta población celular que con que se trataran de dos
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poblaciones diferentes y no vinculadas. De esta manera, se descartó el efecto in vitro como causa de la aparición de las células miogénicas en el cultivo en suspensión.
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Figura 6.31. Análisis de los trazados de linaje a nivel de cultivo celular en suspensión. (A-D) Cuantificación mediante
citometría de flujo del número de células positivas para EYFP y EGFP en muestras de cultivo en suspensión a los 7 días provenientes de los ratones Myf5CreSOR; R26YFP (A), B195APCre; R26YFP (B), Pax3Cre/+; ROSAmTmG (C) y Pax7CreER2/+; ROSAmTmG (D). Se muestran las medias ± desviación estándar de los datos obtenidos en experimentos replicados de
manera independiente según se especifica en cada caso siendo N = ratones y n = experimentos. (E) Representación gráfica del recuento por citometría de flujo del número de células positivas para EGFP a los días 1, 3 y 7 de un mismo cultivo proveniente del linaje de Pax7CreER2/+; ROSAmTmG, donde se representan las medias y la desviación estándar de
los valores obtenidos de N = 9 ratones y n = 5 experimentos. (F-G) Análisis comparativo de todo el ARN mensajero transcrito en la población celular EYFP positiva del trazado de B195APCre; R26YFP separada por citometría de flujo a los
días 0 y 7 de cultivo. (F) Heat map-s donde se muestran los niveles de expresión de 154 sondas (63 genes)