principio no serían funcionales. Un ejemplo de estoocurre en el caso de Mre11, de forma que en la especie Ae. tauschii se secuenció un clon de ADN copia en el que se estaba expresando el intrón 5 del gen, resultando en un cambio del marco de lectura que tras la traducción daría lugar a una proteína truncada de 210 aminoácidos, que contendría los tres primeros dominios fosfoesterasa de la proteína. Este tránscrito sería minoritario ya que se encontró un único clon de ADN copia con esta secuencia entre todos los clones secuenciados, y en cualquier caso daría lugar a una proteína no funcional al carecer de cualquier dominio activo completo, pudiendo tratarse incluso de un error transcripcional puntual. El resto de los clones secuenciados de ADN copia corresponden a tránscritos perfectamente normales que tras la traducción darían lugar a proteínas funcionales, sin haberse detectado formas alternativas de ARNm como ocurre en humanos.
Los ensayos de Southern Blot han demostrado la existencia de una sola copia de cada uno de los tres genes, Mre11, Rad50 y Nbs1, por genoma en el trigo. Sin embargo, en el hombre se han encontrado pseudogenes de Mre11 en los cromosomas 3 y 7 (Petrini y col., 1995), y en el caso de maíz se han aislado dos genes parálogos Mre11A y Mre11B, aunque uno de ellos daría lugar a una proteína truncada que no sería funcional (Waterworth y col., 2007). Aunque en trigo no se ha detectado la existencia de pseudogenes ni parálogos para Mre11, sí se encontró un ARN mensajero distinto que codificaría para una proteína no funcional, como se ha descrito anteriormente. Estos resultados junto con la obtención en todos los casos de las moléculas de ADN copia procedentes de la expresión de estos genes homeólogos, permite conocer que estos genes duplicados se han mantenido en las especies poliploides y además se expresan todos ellos dando lugar en principio a proteínas funcionales.
Una vez conocidas las secuencias de ADN copia de los tres sistemas de genes del complejo MRN se procedió a obtener las secuencias de proteínas deducidas a partir de las mismas. Con estas secuencias se realizaron alineamientos en los que también se incluyeron proteínas ortólogas de otros organismos. De este modo se pudo comprobar el alto grado de conservación de de los sistemas génicos homeólogos del trigo, en torno al 98%, tanto si se comparan las secuencias genómicas y de ADN copia, como si la comparación se lleva a cabo en las secuencias de aminoácidos deducidas de las proteínas. Este resultado indica la importancia de estos genes, que ejercen funciones vitales para las
Discusión
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células y por tanto tienden a variar poco y son mantenidos evolutivamente sin apenas cambios entre ellos (Ciaffi et al. 2006). El elevado grado de conservación de los genes del sistema MRN, contrasta con el grado de homología que presentan otros genes homeólogos, de función diferente y menor importancia para la supervivencia, como son los genes que codifican para las gluteninas de alto peso molecular (Gs-HMW) presentes en el endospermo de la semilla (De Bustos y col., 2000, 2001; De Bustos y Jouve, 2003, 2006). En el caso de las proteínas MRE11 y RAD50 se encontró una elevada homología con las proteínas maíz y arroz, superior al 80%, descendiendo hasta un 64% al compararlas con las proteínas de Arabidopsis thaliana. Se puede comprobar que en el caso de NBS1 esta conservación es mucho menor, siendo la homología tan sólo del 34% al comparar las proteínas de trigo y Arabidopsis thaliana. Estos datos concuerdan con lo descrito en otras especies, donde ya se había visto que el grado de conservación de Nbs1 es mucho menor que el de Mre11 y Rad50, limitándose a dominios muy concretos (Assenmacher y Hopfner, 2004). Estos resultados apoyarían la idea anteriormente mencionada de la existencia de genes Mre11 y Rad50 ancestrales que participarían en los primeros sistemas de reparación de roturas del ADN, a partir de los cuales se originaron los diferentes genes ortólogos presentes en la actualidad.
De acuerdo con Assenmacher y Hopfner (2004) el gen Nbs1 pudo entrar a formar parte del complejo MRN con posterioridad a los genes Mre11 y Rad50, al tiempo que los sistemas de reparación evolucionaban hacia una mayor complejidad. A pesar de todo, dada la baja homología existente entre los distintos genes caracterizados en eucariotas, no parece clara la existencia de un gen ancestral común para todos ellos.Una de las posibles explicaciones es que el origen del gen Nbs1 sea distinto, es decir, a partir de otro gen no relacionado que evolutivamente alcanzaría funciones similares. Alternativamente, otra explicación al origen de Nbs1 es que a partir de un gen ancestral se originaron evolutivamente los genes de los distintos organismos, genes que fueron paulatinamente soportando grandes variaciones en la mayor parte de su secuencia, a excepción de la mayor parte de los dominios característicos donde la variación fue menor. Esta explicación supondría una mayor tasa de variación en este gen respecto de Mre11 y
Rad50, algo en principio no esperado, tratándose todos ellos de genes cuyas funciones