4.5 Compressive Dimensionality Reduction
4.6.3 Natural datasets visualization
3.2.1 Instrumental
Las muestras se pesaron en una balanza analítica Voyager Ohaus modelo Explorer E01140 y se solubilizaron con la ayuda de un ultrasonicador Elma S 40 Elmasonic.
El pH se determinó utilizando un pH-metro Hanna instrument HI 255 combined meter.
Las cuantificaciones del fármaco se llevaron a cabo utilizando un espectrofotómetro Agilent Technologies Cary 60 UV-Vis, empleando celdas de cuarzo de 1cm de paso óptico Hëllma Analytics; y un equipo de cromatografía líquida de alta resolución, JASCO.
El procedimiento de extracción en fase sólida se realizó utilizando cartuchos de extracción Strata-X 30 mg, Phenomenex® y celda de vacío Phenomenex®. Las muestras se concentraron utilizando un concentrador Techne Sample Concentrator, Dri-Block® DB-3A.
En el centro de Microscopía de la UNC se realizaron los estudios histológicos utilizando un Microscopio Óptico Zeiss Axiostar Plus, equipado con una cámara digital Axiocam ERc 5s, y los estudios de ultra esctructura se llevaron a cabo con un microscopio electrónico Zeiss LEO 906E. Los cortes semifinos y finos de las muestras, se realizaron con un ultramicrótomo JEOL JUM-7 con cuchilla de diamante.
114
3.2.2 Métodos
3.2.2.1 Estudios de Mucoadhesión
Para evaluar las propiedades mucoadhesivas del sistema nanoparticulado obtenido, se emplearon dos técnicas, ambas consistieron en poner en contacto
las NPs cargadas con el complejo HCT/βCD, con una solución de mucina
gástrica porcina. Las técnicas se describen a continuación.
3.2.2.1.1 Determinación por Potencial Z
Este estudio de mucoadhesión es un método
in vitro
conocido como latécnica de la mucina (Sriamornsak y col., 2010), para lo cual se utiliza mucina
gástrica porcina (MUC).
Esta técnica consistió en preparar una suspensión de MUC, de concentración 0,4 mg/mL, en una solución tamponada de fosfatos de pH 7,4. Se colocaron 2 mL de la suspensión de MUC junto a 2 mL de una suspensión de
NPs cargadas con el complejo HCT/βCD, preparada en la misma solución
tamponada. Las muestras se mantuvieron con agitación magnética constante durante 24 h y a temperatura ambiente, para alcanzar el equilibrio entre ambos sistemas.
La mucoadhesión del sistema, se determinó midiendo el potencial Z de las NPs resuspendidas en la solución tamponada y del sistema MUC:NPs estabilizado.
El valor diferente de potencial Z de la superficie de las NPs, es un indicador de que ocurre una interacción electrostática entre las cargas positivas de las NPs y las cargas negativas de la mucina.
3.2.2.1.2 Determinación por SEM
Este estudio de mucoadhesión se basó en detectar cambios en la estructura de la mucina a nivel microscópico, cuando ésta es puesta en contacto con un
Capítulo 3: Nanopartículas Poliméricas
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sistema mucoadhesivo, como son las NPs de CHI. Para llevar a cabo este estudio, se tomó 1 mL de una suspensión de mucina de concentración 1 mg/mL en una solución tamponada de fosfatos de pH 7,4 y se la puso en contacto con
un
pellet
de NPs cargadas con el complejo HCT/βCD, resuspendido previamenteen 3 mL de la misma solución tamponada. Se dejó equilibrar esta mezcla (MUC:NPs) por 24 h, con agitación magnética constante y a temperatura ambiente.
Se analizaron muestras de la suspensión de MUC, utilizada como control y de la suspensión MUC:NPs. Las muestras se acondicionaron para analizarlas por SEM, como se describió previamente en la sección 3.1.2.5. Cambios estructurales en la microestructura de la MUC es indicio de que existen interacciones entre ambos componentes.
3.2.2.2 Estudios de Permeabilidad Intestinal
in vitro
Para determinar el comportamiento biofarmacéutico de las NPs cargadas con el complejo HCT/βCD, se realizaron estudios de permeabilidad
in vitro
,utilizando la técnica
ex vivo
, de saco intestinal evertido de ratas. Dichos experimentos se llevaron a cabo en colaboración con el grupo de investigación del Dr. Mario Alfredo Quevedo, investigador de UNITEFA-CONICET, en el departamento de Farmacia, de la Facultad de Ciencias Químicas, UNC.Los estudios se llevaron a cabo con ratas Wistar machos de 3 meses de edad (500 – 600 g). Los animales se anestesiaron mediante la administración intraperitoneal de una solución de uretano (1000 mg/Kg). Posteriormente, se les realizó una incisión de 2 cm en la línea de la cavidad abdominal, aislando un segmento de intestino de 10 cm del yeyuno proximal. Luego de la obtención del tejido, los animales se sacrificaron a través de la administración de dióxido de carbono, en una cámara previamente saturada con este gas. Cabe destacar que estos procedimientos fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Ciencias Químicas, UNC. (Res. Nº 138/07), para el uso de animales en protocolos experimentales.
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El segmento de intestino extraído se colocó en medio de cultivo TC199 previamente disuelto en bicarbonato de sodio, con un pH final de 7,4 y burbujeo de gas carbógeno, para mantener el tejido vivo.
El intestino se invirtió y se lavó exhaustivamente con medio de cultivo TC199 a 37 °C, ya que el mismo debe estar limpio para poder utilizarse en el ensayo. El segmento de intestino evertido se sumergió en 45 mL de medio de cultivo TC199
(
solución mucosal)
, con burbujeo de gas carbógeno y termostatizado a 37 °C. Lamuestra a permear se colocó en la solución mucosal y la fracción permeada que se tomó fue de 2 mL desde el interior del saco intestinal (
solución serosal
), conreposición de medio fresco (Quevedo y col., 2009). El esquema del dispositivo
de trabajo se muestra en la figura 3.13.