3 A Generic Computational Model of a Patch of Corte
4.6 Noise Reduction
La mayoría de las técnicas de conservación de los alimentos disponibles actualmente en la industria alimentaria se basan en complejos procesos tecnológicos y en el empleo de aditivos químicos. Sin embargo, cada vez es mayor el número de consumidores que demandan productos “más naturales”, menos procesados e, incluso, libres de aditivos químicos. En este contexto, la bioconservación es una alternativa que permite asegurar la seguridad de estos alimentos y, por lo tanto, satisfacer la demanda de los consumidores actuales. En este sentido, la bioconservación se define como “la prolongación de la vida útil y el incremento de la seguridad higiénico-sanitaria de los alimentos mediante la utilización de compuestos naturales de origen animal, vegetal o microbiano que no ejercen efectos perjudiciales sobre la salud de los consumidores” (Stiles, 1996; Cintas y Casaus, 1998) o incluso como “la prolongación de la vida útil y el incremento de la seguridad higiénico-sanitaria de los alimentos mediante la utilización de la microflora natural o sus metabolitos” (Schillinger et al., 1996; Aymerich y Hugas, 1998). Hasta la fecha, se han realizado numerosos estudios que demuestran la eficacia de las bacterias lácticas bacteriocinogénicas y/o sus metabolitos como bioconservantes para inhibir el desarrollo y/o eliminar la presencia de un gran número de microorganismos patógenos y alterantes presentes en diversos alimentos (por ej.: leche, quesos, productos lácteos, productos cárnicos, vegetales, pescados, mariscos, ensaladas, alimentos enlatados, ovoproductos, vino, cerveza, bebidas analcohólicas y productos de panadería) (Daeschel, 1993; Delves-Broughton et al., 1996; Cintas y Casaus, 1998; O’Sullivan et al., 2002a; Työppönen et al., 2003; Vaughan et al., 2004, 2005; Cotter et
al., 2005b; Foulquié-Moreno et al., 2006). Por consiguiente, el empleo de bacterias lácticas y/o sus
metabolitos como bioconservantes alimentarios, formando parte de un sistema de barreras múltiples, constituye una alternativa, fácilmente aceptable por los consumidores, las agencias sanitarias y empresas alimentarias, que permitiría obtener productos más naturales, más saludables y con menos aditivos químicos (Stiles, 1996; Cintas y Casaus, 1998; O’Sullivan et al., 2002a; Ross et al., 2002; Devlieghere et al., 2004; Deegan et al., 2006).
Conviene destacar que de los compuestos antimicrobianos producidos por las bacterias lácticas (sección II.3.2), las bacteriocinas producidas por microorganismos de los géneros Carnobacterium,
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc y Pediococcus poseen un gran potencial como
bioconservantes en la industria alimentaria (Abee et al., 1995; Holzapfel et al., 1995; McMullen y Stiles, 1996; Schillinger et al., 1996; Cintas y Casaus, 1998; Cotter et al., 2005b; Gálvez et al., 2007), lo que es debido a algunas de sus características, entre las que se incluyen:
1. Su producción por bacterias que, debido a la larga tradición de su empleo en alimentos fermentados sin problemas higiénico-sanitarios asociados, son consideradas microorganismos GRAS y/o QPS (Schillinger et al., 1996; Martínez et al., 2000d) (sección II.3.3).
2. Naturaleza proteica (sección II.3.4.2), por lo que las bacteriocinas se inactivarían presumiblemente por las enzimas proteolíticas del tracto digestivo (principalmente gástricas) (Piard y Desmazeaud, 1991; Cintas et al., 2001; Cotter et al., 2005b; Bernbom et al., 2006) y, por lo tanto, no originarían disbiosis intestinales.
3. Ausencia de capacidad inmunógena (sección II.3.4.9.3), por lo que no ocasionarían fenómenos alérgicos.
4. Amplio espectro de acción antimicrobiana y potente actividad frente a microorganismos patógenos y/o alterantes presentes en diversos alimentos, como L. monocytogenes, S. aureus y Cl. botulinum (sección II.3.4.3). Además, pueden actuar sinérgicamente con otros sistemas de conservación de los alimentos (Gould, 1996).
5. Resistencia a diversos tratamientos tecnológicos de conservación aplicados a los alimentos (por ej.: pasteurización, liofilización y acidificación).
6. Ausencia de actividad biológica frente a células eucariotas.
Como se mencionó anteriormente (sección II.2.2.4.1), entre las aplicaciones de las bacterias lácticas bacteriocinogénicas y/o sus bacteriocinas como bioconservantes de los alimentos se incluye su empleo para: (i) la mejora de su calidad higiénico-sanitaria y seguridad y la extensión de su vida útil, por su actividad inhibidora del desarrollo de microorganismos patógenos y/o alterantes potencialmente presentes en los alimentos y (ii) la mejora de la calidad y características organolépticas de los alimentos, por su actividad inhibidora del desarrollo de la flora NSLAB (Hugas, 1998; O’Sullivan et
al., 2002a; Ryan et al., 2002; Chen y Hoover, 2003; Cotter et al., 2005b; Guinane et al., 2005; Deegan et al., 2006; Drider et al., 2006).
De forma general, existen tres estrategias para la aplicación de las bacteriocinas como bioconservantes alimentarios: (i) inoculación del alimento con la bacteria láctica bacteriocinogénica, para que ésta produzca la bacteriocina in situ (cultivo protector y/o cultivo iniciador); (ii) adición como ingrediente alimentario de un medio fermentado por una cepa bacteriocinogénica y (iii) adición como aditivo alimentario de la bacteriocina purificada o parcialmente purificada (Abee et al., 1995; Holzapfel et al., 1995; Schillinger et al., 1996; Aymerich y Hugas, 1998; Ross et al., 1999; Chikindas y Montville, 2002; Cotter et al., 2005b; Deegan et al., 2006; de Vuyst y Leroy, 2007; Gálvez et al., 2007). Prácticamente cualquier bacteria láctica bacteriocinogénica y/o bacteriocina puede emplearse en la industria alimentaria bajo las dos primeras formas de aplicación. De hecho, las bacterias lácticas bacteriocinogénicas se han utilizado de forma empírica o inadvertidamente durante siglos en las
fermentaciones alimentarias (Stiles, 1996). En lo que se refiere a la tercera estrategia, el empleo de bacteriocinas como aditivos alimentarios está sujeto a la regulación de la lista positiva de estas sustancias y, en la actualidad, la única bacteriocina autorizada para tal fin es NisA (conservante alimentario E-234), en determinados tipos de productos. A este respecto, en la U.E. está permitida la utilización de NisA como conservante (E-234) en determinados tipos de quesos, productos lácteos y postres. Asimismo, en Australia y Nueva Zelanda también está permitida su adición como conservante de la cerveza (Delves-Broughton et al., 1996; Riley y Wertz, 2002; Twomey et al., 2002; Delves-
Broughton, 2005). En este contexto, para que se acepte legalmente el empleo de una bacteriocina como aditivo alimentario se requieren numerosos estudios bioquímicos, genéticos y toxicológicos, que suponen un coste económico muy importante (Schoeman et al., 1999; Deegan et al., 2006), lo que provoca que su empleo como bioconservante se realice mediante cualquiera de las otras dos estrategias. Así pues, actualmente, se comercializan diversos medios fermentados por cepas bacteriocinogénicas como ingredientes alimentarios, tal es el caso del medio ALTA 2341TM(fermentado por P. acidilactici) (Daeschel, 1989; Cotter et al., 2005b). Asimismo, la producción in situ de bacteriocinas representa una alternativa muy interesante desde el punto de vista económico, ya que no lleva asociado el coste adicional necesario para su empleo como aditivo alimentario y, además, proporciona una fuente de bacteriocina más duradera (McMullen y Stiles, 1996; Benkerroum et al., 2002).
Hasta la fecha, NisA y PedPA-1 son las bacteriocinas de las bacterias lácticas que han tenido mayor aceptación comercial para utilizarse como bioconservantes alimentarios, no obstante, otras bacteriocinas han mostrado resultados prometedores tanto a nivel industrial como en ensayos de laboratorio (Diep y Nes, 2002). En este sentido, el empleo de las bacterias lácticas en los productos lácteos ha tenido una larga y segura trayectoria, principalmente como cultivos iniciadores para la elaboración del queso (O’Sullivan et al., 2002a). En la industria láctea se utilizan frecuentemente los nitratos para prevenir la germinación de los esporos de microorganismos del género Clostridium, lo que constituye un problema frecuente durante la producción de quesos debido a la producción de toxina botulínica por Cl. botulinum o a la sobreproducción de ácido butírico por Clostridium
tyrobutyricum (Schillinger et al., 1996; Cleveland et al., 2001). No obstante, la problemática higiénico-
sanitaria de la utilización de estos conservantes químicos puede evitarse mediante el empleo de NisA como se ha descrito para la elaboración de queso “Gouda”, “Camembert”, “Cheddar” y “Cottage” (Benkerroum y Sandine, 1988; Hugenholtz y de Veer, 1991; Maisnier-Patin et al., 1992; Zottola et al., 1994; Delves-Broughton et al., 1996). Además, NisA posee un amplio y potente espectro antimicrobiano, en el que se incluyen microorganismos alterantes y patógenos de los alimentos como
L. monocytogenes y bacterias Gram-positivas formadoras de esporos como Cl. botulinum (Schillinger et al., 1996; Cleveland et al., 2001). Por ello, en la actualidad se utiliza como bioconservante de una
gran variedad de productos lácteos (por ej.: quesos procesados y para untar, quesos acidificados, postres lácteos pasteurizados, leche fresca pasteurizada y sus mezclas), así como de huevo líquido (Maisnier-Patin et al., 1992; Benech et al., 2002a, b; Twomey et al., 2002; Garneau et al., 2003). Por otra parte, un gran número de bacteriocinas distintas de NisA podrían emplearse como bioconservantes de los productos lácteos, entre las que destacan las siguientes: (i) Ltn3147 inhibe el desarrollo de L.
monocytogenes Scott A y B. cereus en quesos “Cottage”, quesos madurados con mohos, yogurt natural
y leche de bebes (McAuliffe et al., 1999; Papagianni, 2003; Deegan et al., 2006). Asimismo, Ltn3147 y lacticina 99 permiten mejorar la calidad y características organolépticas de los quesos mediante el control de la flora láctica que no forma parte del cultivo iniciador (flora NSLAB) (Uljas y Luchansky, 1995; Ryan et al., 1996; Fenelon et al., 1999; Ryan et al., 2001; Deegan et al., 2006); (ii) PedPA-1, producida heterólogamente por cepas de Lc. lactis y Lb. plantarum, se emplea como cultivo iniciador para la elaboración de queso “Cheddar” y como espray sobre la superficie de queso “Munster” debido a que inhibe el desarrollo de L. monocytogenes (Buyong et al., 1998; Ennahar et al., 1998); (iii) la pediocina 5 inhibe el desarrollo de L. monocytogenes en leche (Huang et al., 1994); (iv) la cepa E.
faecium F58, productora de la enterocina F58, reduce el crecimiento de L. monocytogenes CECT 4032
serovar 4b en 1−4 unidades logarítmicas cuando son cocultivadas en leche de cabra y, además, inhibe el desarrollo de esta cepa en los quesos “Jben” (Achemchem et al., 2006); (v) Psc126, producida por
Carnobacterium maltaromaticum JG126, inhibe el desarrollo de L. monocytogenes en quesos
“Camembert” (Wan et al., 1997); (vi) la linocina M-18, producida por Brevibacterium lines, inhibe el desarrollo de L. monocytogenes en quesos rojos (Eppert et al., 1997); (vii) la variacina, producida por
Kocuria varians, se ha empleado para producir un producto lácteo que inhibe a B. cereus en productos
lácteos refrigerados y postres de vainilla y chocolate (O´Mahony et al., 2001) y (viii) EntA, EntP y EntAS-48, producidas por cepas de E. faecium y E. faecalis, inhiben el desarrollo de L. monocytogenes durante la elaboración de los quesos “Cottage”, “Feta”, “Manchego”, “Taleggio” y “Cheddar” (Giraffa
et al., 1995; Núñez et al., 1997; Sarantinopoulos et al., 2002; Foulquié-Moreno et al., 2003a; Liu et al.,
2008). Asimismo, EntA, producida por E. faecium CCM 4231, inhibe el desarrollo de L.
monocytogenes y S. aureus en leche de soja (Lauková y Czikková, 1999). Por otra parte, LciA, LciB,
LciM, Ltn 3147, Ltn481 y EntAS-48 presentan un efecto lítico sobre las bacterias lácticas empleadas como cultivos iniciadores del queso “Cheddar”, produciéndose una disminución del tiempo de maduración y afectando positivamente a su calidad y a sus características organolépticas (Chapot- Chartier et al., 1994; Crow et al., 1995; Ross et al., 1999; Martínez-Cuesta et al., 2001; Oumer et al., 2001; O´Sullivan et al., 2002b; Peláez y Requena, 2005).
En lo que respecta a la bioconservación de la carne fresca y los productos cárnicos fermentados, la utilización de NisA ha sido ampliamente estudiada, si bien se ha observado su ineficacia debido a su unión a grupos sulfhidrilos de las proteínas o a partículas de carne (Chung et al., 1989; Deegan et al., 2006) y a su fuerte interacción con los fosfolípidos, lo que principalmente limita su actividad en carnes con un alto contenido de grasas (Henning et al., 1986). No obstante, el empleo de NisA ha resultado ser efectiva en: (i) salchichas del tipo “Bolonia” que contenían una menor cantidad de grasa (Davies et al., 1999), (ii) en carne de ternera para inhibir el desarrollo de Brochothrix thermosphacta (Cutter y Siragusa, 1998) y (iii) jamón para inhibir el desarrollo de L. monocytogenes (Jofré et al., 2007). Además, en la industria cárnica se utilizan frecuentemente los nitritos para estabilizar el color rojo de las carnes y para prevenir la germinación de los esporos de microorganismos del género Clostridium. Sin embargo, estos nitritos pueden reaccionar con aminas secundarias en las carnes formándose nitrosaminas carcinogénicas (Chen y Hoover, 2003). Esta problemática higiénico-sanitaria de la
utilización de estos conservantes químicos puede evitarse mediante el empleo combinado de NisA y nitritos ya que inhiben la formación de esporas de Clostridium sporogenes y retrasan la producción de toxina botulínica por Cl. botulinum (Rayman et al., 1981; Taylor et al., 1985). Por otra parte, diversos estudios han puesto de manifiesto que las bacteriocinas producidas por microorganismos de los géneros
Pediococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Carnobacterium y Lactobacillus, entre otros, poseen un
mayor potencial como bioconservantes de los productos cárnicos que NisA (Stiles y Hastings, 1991; O´Sullivan et al., 2002a). A este respecto, la incorporación de cepas de P. acidilactici productoras de PedPA-1 en salchichas tipo “Frankfurter”, de pavo, pollo y en embutidos fermentados permite inhibir el desarrollo de L. monocytogenes (Berry et al., 1991; Foegeding et al., 1992; Luchansky et al., 1992; Baccus-Taylor et al., 1993). Asimismo, el empleo combinado de PedPA-1 junto con el envasado de carnes en atmósferas modificadas permite reducir la incidencia de alteraciones producidas por bacterias Gram-negativas (Stiles y Hastings, 1991). Por otra parte, la incorporación de LeuA, producida por
Leuconostoc gelidum UAL 187, en carne de ternera picada y envasada al vacío permite retrasar la
alteración producida por Lb. sakei durante 6−8 semanas (Leisner et al., 1996). Asimismo, se ha demostrado la eficacia de la utilización de EntA, EntB, EntAS-48, EntCRL35 y enterocina 416K1 (Ent416K1), SakA, SakK, SakP y SakX, la lactocina 705, leucocina A-4010, Psc126 y plantaricina 423 (Plt423), entre otras bacteriocinas, para controlar el crecimiento de L. monocytogenes en pechugas de pollo, jamón, cerdo, pato, carne de ternera, avestruz, salchichas y embutidos fermentados (Schillinger,
et al., 1991; Holck, et al., 1994a, b; Tichaczek et al., 1994; Jack et al., 1996; Vignolo et al., 1996;
Hugas et al., 1998; Lauková et al., 1999b; Aymerich et al., 2000a, c; Callewaert et al., 2000; Vignolo
et al., 2000; Budde et al., 2003; Hugas et al., 2003; Sabia et al., 2003; Dicks et al., 2004; Ananou et al., 2005; Benkerroum et al., 2005; Héquet et al., 2007; Jofré et al., 2007). Finalmente, el empleo de
cepas productoras de bacteriocinas (por ej.: Ltn3147 y curvacina A [CurA]) como adjuntos del cultivo iniciador han permitido mejorar las características organolépticas de productos cárnicos como el salami y embutidos fermentados (Vogel et al., 1993; Coffey et al., 1998).
Por otra parte, el deterioro del pescado fresco es causado generalmente por microorganismos Gram-negativos que, de forma general, no son sensibles a la acción antimicrobiana de las bacteriocinas de las bacterias lácticas, por lo que muy pocos investigadores han evaluado su eficacia como bioconservantes de estos productos (O’Sullivan et al, 2002a). Sin embargo, en el pescado envasado al vacío, microorganismos Gram-positivos como, entre otros, Cl. botulinum y L. monocytogenes pueden causar graves problemas sanitarios, habiéndose descrito su inhibición por diversas bacteriocinas (Degnan et al., 1994; Einarsson y Lauzon, 1995; Nilsson et al., 1997; Gómez et al., 2004b, 2006). A este respecto, algunos investigadores han evaluado la eficacia de la adición de cultivos bacteriocinogénicos en estos productos. Así pues, se ha descrito el crecimiento y la producción de bacteriocinas por Carnobacterium divergens V41, C. piscicola VI, C. piscicola SF668, C. piscicola A9b y C. piscicola CS256 en pescado ahumado conservado a 4 y 5ºC, lo que permitió inhibir el desarrollo de L. monocytogenes en este producto (Duffes et al., 1999a, b; Nilsson et al., 1999; Yamazaki et al., 2003; Brillet et al., 2004; Nilsson et al., 2004). Más recientemente, Connil et al. (2002) demostraron el potencial de C. divergens V41, microorganismo productor de divercina V41,
como bioconservante del salmón ahumado refrigerado bajo diferentes condiciones de temperatura y diferentes concentraciones de glucosa y sal. Asimismo, Katla et al. (2001) y Aasen et al. (2003) han demostrado la eficacia de SakP para inhibir el desarrollo de L. monocytogenes en salmón ahumado conservado. Por otra parte, se ha comprobado la eficacia de NisA para la conservación de filetes de pescado ahumado y de NisZ y BavA, producida por Lactobacillus bavaricus MI 401, para la conservación de camarones (Einarsson y Lauzon, 1995).
En lo que respecta a la bioconservación de productos vegetales y fruta, Plinio “El Viejo” describía en el siglo I d.C. la conservación de la col blanca en vasijas de barro especiales, empleadas sucesiva y únicamente para este fin; no existe duda de que bajo las condiciones descritas por Plinio, la col se fermentaba a “Sauerkraut” por la acción de los microorganismos que quedaban retenidos en los poros de las vasijas y que procedían de una fermentación anterior (Cintas y Casaus, 1998). Durante esta fermentación, producida por Leuconostoc mesenteroides, se produce dióxido de carbono y ácidos orgánicos que inhiben el desarrollo de la mayoría de los microorganismos indeseables debido a las condiciones anaeróbicas y el descenso de pH creados. A pesar de ello, se puede producir el desarrollo de cepas de Lb. plantarum que alteran este producto, no obstante, se ha demostrado que el empleo de NisA y cepas de Le. mesenteroides resistentes a ésta, permiten que se desarrolle esta fermentación y que se produzca la inhibición de estas cepas de Lb. plantarum (Steinkraus, 1982; Harris et al., 1992a, b; Settanni y Corsetti, 2008). En la actualidad, la manipulación y el sistema de envasado, que requieren los productos de origen vegetal, dificultan a veces el mantenimiento de temperaturas de refrigeración adecuadas, lo que proporciona un ambiente propicio para el crecimiento de microorganismos patógenos. Por ello, se ha evaluado el empleo de cultivos de cepas productoras de bacteriocinas como una barrera antimicrobiana adicional en este tipo de alimentos (O’Sullivan et al., 2002a). A este respecto, Cai et al. (1997) demostraron que el cocultivo de Lc. lactis HPB1688, productor de NisZ, con
L. monocytogenes en los envases de ensalada fresca cortada y lista para su consumo permitía reducir
aproximadamente 10 veces la población de este patógeno después del almacenamiento del producto entre 7−10ºC durante 10 días. Este mismo grupo demostró que una enterocina producida por una cepa de E. faecium era capaz de reducir la población de L. monocytogenes en ensalada “Caesar”. En otro estudio, Allende et al. (2007) demostraron que la aplicación de NisZ y coagulina, independiente y conjuntamente en una solución de lavado, permite inhibir el crecimiento de L. monocytogenes en ensalada fresca y cortada. Por otra parte, la munditicina AT06, producida por E. mundtii AT06, inhibe el desarrollo de L. monocytogenes en habichuelas (Bennik et al., 1998; Settanni y Corsetti, 2008). Otro problema asociado a los vegetales frescos es la posibilidad de que vehiculen una contaminación bacteriana con coliformes o enterococos como resultado de unas inadecuadas condiciones higiénicas durante su manipulación. A este respecto, Vescovo et al. (1995) demostraron que al tercer día de la inoculación de cepas de Lb. casei en vegetales refrigerados envasados y listos para su consumo se observó un marcado efecto inhibidor, lo que permitió reducir drásticamente o eliminar la presencia de coliformes o enterococos, respectivamente, en el producto. Por otra parte, Ruiz-Barba et al. (1994) y de Castro et al. (2002) demostraron que la utilización de Lb. plantarum LPCO10 (productor de PltS y PltT) y de Enterococcus casseliflavus cc45 (en combinación con Lactobacillus pentosus CECT 5138)
como cultivos iniciadores, permite controlar la fermentación de aceitunas verdes de estilo español. Asimismo, Komitopoulou et al. (1999) y Grande et al. (2005) demostraron que NisA y EntAS-48, respectivamente, son efectivas para controlar las alteraciones organolépticas producidas por
Alicyclobacillus acidoterrestris en zumos de frutas. Además, EntAS-48 inhibe el crecimiento de: (i) Bacillus licheniformis en zumo de manzana y sidra (Grande et al., 2006b); (ii) B. cereus en alimentos a
base de arroz y puré de verduras (Grande et al., 2006a, 2007b); (iii) Bacillus coagulans en frutas y productos vegetales enlatados (Lucas et al., 2006) y (iv) S. aureus en salsas vegetales (Grande et al., 2007a; Settanni y Corsetti, 2008). Finalmente, EntEJ97 producida por E. faecalis EJ97 inhibe el crecimiento de Bacillus macroides y Bacillus maroccanus en purés de verduras (Settanni y Corsetti, 2008).
Los estudios realizados sobre la posible utilidad de las bacteriocinas de las bacterias lácticas como bioconservantes de la cerveza son muy escasos y se han basado principalmente en el empleo de NisA. A este respecto, estudios recientes han demostrado la eficacia de NisA para inhibir las alteraciones microbianas producidas por las bacterias lácticas en la cerveza (sección II.1.7.1) (Ogden y Tubb, 1985; Ogden, 1986; Ogden y Waites, 1986; Delves-Broughton et al., 1996