3.7 Parallel Architecture Backends
3.7.1 Parallel Architecture Potential
La evaluación del efecto de la concentración celular y el tiempo de crecimiento es importante para lograr emplear biocatalizadores muy activos para la biotransformación del sustrato en producto; de esta manera la determinación del tiempo de crecimiento adecuado del cultivo contribuye a alcanzar la máxima producción de enzimas que realicen una biotransformación. El sustrato se adicionó a diferentes tiempos de crecimiento (Ti) y se determinó la concentración de biomasa, por la absorción a 660 nm al inicio y final de la biotransformación empleando la ecuación de calibrado (figura 14). En la siguiente tabla se muestra la influencia del tiempo de crecimiento en la conversión del sustrato a producto.
Tabla 10: Biotransformación del 1-feniletanol adicionado a diferentes tiempos de crecimiento celular
T1 T2 T3
Adición de 1-feniletanol (h) 8,5 24 48
Concentración inicial de células (millón cel / ml) 400 1035 1043
Concentración final de células (millón cel / ml) 1040 1042 1045
Rendimiento (%) a 96 h de reacción 75 80 85
Tiempo de inducción 14 6 0
En la tabla 10 se puede observar que después de la adición del 1-feniletanol, la levadura es capaz de crecer hasta el valor máximo de biomasa alcanzado en condiciones normales de crecimiento (figura 14); razón por la cual podemos afirmar que la concentración usada de sustrato en el experimento no es tóxica para el crecimiento de Williopsis califórnica; esto está de acuerdo con los datos de toxicidad de ciclohexanol descritos previamente por Carballeira 2004. Asimismo, podemos observar que el rendimiento (%) alcanzado a las 96 h aumenta con el incremento del tiempo de crecimiento del microorganismo al cual se añadió el sustrato, por lo que podemos afirmar que la producción enzimática se incrementa con el crecimiento celular. Los rendimientos obtenidos en este trabajo son mayores a los obtenidos
Biblioteca
de Ing.
mediante otras tecnologías novedosas como el uso de microesferas de poliestireno revestidas con N-hidroxiptalamida y sales metálicas (Baojiao y Bi, 2018) o a la oxidación con nanopartículas de oro y N-hidroxiptalamida en líquido iónico (Hosseini- Monfared et al, 2013).
En la figura 17 se puede observar que cuando se adiciona el sustrato en los tiempos de crecimiento T1 y T2 las células esperan pequeños tiempos para dar inicio a la reacción (tiempo de inducción), que según la tabla 10 en el caso de T1 fue 14 horas y en T2 fue 6 horas, lo cual podría deberse probablemente a que mientras haya nutrientes en el medio, el microorganismo los aprovecha para crecer, hasta alcanzar la cantidad de células correspondiente a la fase estacionaria de crecimiento (figura 14), sólo entonces se inicia la biotransformación; un comportamiento similar fue descrito por Cappaert y Larroche (2004) para el S. cerevisiae en la oxidación del (R,S) 2-octanol; sin embargo cuando se adiciona el sustrato en el tiempo T3 (48 horas de crecimiento) la célula no necesita de tiempo de inducción para realizar la biotransformación .
Figura N°17: Efecto del tiempo de inducción en el rendimiento de la reacción (elaboración propia)
De los resultados obtenidos deducimos que la enzima o enzimas responsables de esta biotransformación solo inician su acción catalítica cuando se ha detenido la producción de biomasa, o lo que es lo mismo cuando sus substratos naturales están a
Biblioteca
de Ing.
muy bajas concentraciones por agotamiento del medio de cultivo, afirmación que coincide con lo expuesto por Quezada, 2006. El uso de células en estado estacionario puede mostrar altos rendimientos de producto ya que no se usa el sustrato para la producción de biomasa ni energía, lo cual es una característica ventajosa de utilizar estas células como biocatalizadores (De Carvalho, 2017).
3.5 Parámetros cinéticos de oxidación
Según la tesis de Falcon, 2012 cuando se llevan a cabo reacciones con microorganismos, no todas las moléculas del sustrato se encuentran disponibles para conversión inmediata; la reacción tiene lugar únicamente después que el sustrato ha sido transportado al lugar de reacción, por lo que los procesos de transferencia de materia pueden ejercer una gran influencia sobre la velocidad global de conversión. Cada célula responde a la concentración de sustrato según su posición con una velocidad de reacción determinada por los parámetros cinéticos del biocatalizador. La velocidad local de reacción se denomina velocidad verdadera o velocidad intrínseca; las cuales son difíciles de medir en microorganismos. Sin embargo, es posible, medir la velocidad global de reacción para el catalizador entero. En un sistema cerrado, la velocidad de desaparición de sustrato en el seno del líquido debe ser igual a la velocidad global de conversión por reacción, hecho que en los sistemas heterogéneos se denomina velocidad observada. Cuando los niveles de sustrato cambian lentamente durante la reacción, los datos de velocidad observada pueden obtenerse recogiendo muestras de la mezcla de reacción a diferentes tiempos y analizando la variación de la concentración de sustrato.
En la tabla 11 se muestran los resultados del análisis por HPLC para la determinación del consumo de sustrato (1-feniletanol) donde se puede observar que las áreas del sustrato en los cromatogramas presentan poca dispersión como lo demuestran los bajos valores de la desviación estándar y del coeficiente de variación, lo que da solidez al valor promedio de la concentración del 1-feniletanol en función del tiempo de reacción.
Biblioteca
de Ing.
f ( t ) = [ A. exp (- k . t) ] + C
Tabla 11: Resultados del análisis por HPLC del consumo de 1-feniletanol
Factor de dilución: 3
Para observar mejor los resultados obtenidos, en la figura 17 se muestra la cinética de consumo del sustrato 1-feniletanol, donde podemos observar que la tendencia de los datos experimentales es de decaimiento exponencial, razón por la cual fueron ajustados con el programa EXFIT del paquete estadístico SIMFIT Versión 5.7.2 Académica a un modelo de decaimiento exponencial de la forma:
Donde:
k = Constante aparente de velocidad de consumo de sustrato. (h-1) C = Valor asintótico cuando el tiempo decrece indefinidamente. (mM) A = Gradiente de concentración entre el estado inicial y el tiempo t. (mM)
La derivada de la función f(t) es la expresión de la velocidad observada de consumo de sustrato y quedará determinada cuando t tienda a cero; por lo que la expresión para calcular la velocidad inicial observada de consumo de sustrato queda establecida como:
Tiempo 1-FENILETANOL Área
Promedio
s %CV [mM] vial
[mM] matraz
h area1 area2 area3
0 3800.53400 3804.54300 3795.654 3800.24367 4.452 0.12% 3.33 9.99 2 3200.536 3214.982 3209.637 3208.38500 7.304 0.23% 2.77 8.32 6 2500.987 2519.387 2508.636 2509.67000 9.243 0.37% 2.12 6.35 9 2000.873 2005.384 2013.245 2006.50067 6.261 0.31% 1.65 4.94 18 1503.456 1500.746 1519.382 1507.86133 10.069 0.67% 1.18 3.53 32 1012.635 1017.235 1005.837 1011.90233 5.734 0.57% 0.71 2.13 48 924.45 923.847 931.762 926.68633 4.406 0.48% 0.63 1.89 72 851.358 852.352 851.627 851.77900 0.514 0.06% 0.56 1.68 96 850.837 851.726 853.827 852.13000 1.535 0.18% 0.56 1.68
Biblioteca
de Ing.
Química
d f(t) / dt = Vo = - A.k
Figura N°18: Cinética de consumo del 1-feniletanol (elaboración propia)
De igual manera, al cambiar lentamente los niveles del producto de reacción, los datos de velocidad observada pueden obtenerse recogiendo muestras de la mezcla de reacción a diferentes tiempos y analizando la variación de la concentración de producto. En la tabla 12 se muestran los resultados del análisis por HPLC para la determinación de obtención del producto (acetofenona) donde se puede observar que las áreas del producto en los cromatogramas presentan poca dispersión como lo demuestran los bajos valores de la desviación estándar y del coeficiente de variación, lo que da solidez al valor promedio de la concentración de acetofenona en función del tiempo de reacción.
Tabla 12: Resultados del análisis por HPLC de obtención de producto acetofenona.
Tiempo ACETOFENONA Área
Promedio
s %CV [mM] vial
[mM] matraz
h area1 area2 area3
0 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 0.000 0.00% 0.00 0.00 2 323.576 327.43 325.987 325.66433 1.947 0.60% 0.48 1.43 6 624.874 631.763 628.762 628.46633 3.454 0.55% 0.96 2.88 9 758.834 762.725 761.923 761.16067 2.054 0.27% 1.17 3.51 18 1203.873 1213.872 1209.725 1209.15667 5.024 0.42% 1.88 5.65 32 1508.345 1510.624 1507.873 1508.94733 1.471 0.10% 2.36 7.08
Biblioteca
de Ing.
Química
y ( t ) = B . [ 1 - exp (- k . t) ]
d y(t) / dt = Vo = B.k
48 1602.872 1609.873 1602.982 1605.24233 4.011 0.25% 2.51 7.54 72 1609.834 1605.835 1603.834 1606.50100 3.055 0.19% 2.51 7.54 96 1606.874 1603.872 1607.834 1606.19333 2.067 0.13% 2.51 7.54 Factor de dilución: 3Para observar mejor los resultados obtenidos, en la figura 18 se muestra la cinética de obtención del producto acetofenona, donde podemos observar que la tendencia de los datos experimentales es de crecimiento exponencial, razón por la cual fueron ajustados con el programa EXFIT del paquete estadístico SIMFIT Versión 5.7.2 Académica a un modelo de crecimiento exponencial de la forma:
Donde:
K = Constante aparente de velocidad de aparición de producto. (h-1) B = Máxima concentración de producto alcanzada. (mM)
La derivada de la función y(t) es la expresión de la velocidad observada de aparición de producto y quedará determinada cuando t tienda a cero; por lo que la expresión para calcular la velocidad inicial observada de aparición de producto queda establecida como:
Biblioteca
de Ing.
Figura N°19: Cinética de producción de acetofenona (elaboración propia)
En las tablas 13 y 14 se muestran los principales parámetros cinéticos de la reacción de oxidación del 1-feniletanol empleando Williopsis califórnica como biocatalizador.
Tabla 13: Parámetros cinéticos del consumo de 1-feniletanol
Sustrato A K C Vo Células Kesp
Mm Mm h-1 mM mM / h millón
/ ml
h-1 / millón de células
10 8.10 0.0954 1.755 0.77 1045 9,1x10-5
Tabla 14: Parámetros cinéticos de la producción de acetofenona.
Sustrato B K Vo Células kesp
Mm Mm h-1 mM / h millón / ml h-1 / millón de células 10 7.628 0.0760 0.56 1045 7,2x10-5
Biblioteca
de Ing.
Química
De los resultados obtenidos en las tablas 13 y 14 podemos afirmar que la velocidad de consumo de sustrato es ligeramente superior a la velocidad de generación de producto; lo que puede deberse a que el producto de reacción (acetofenona) origine mayor toxicidad a la célula. La toxicidad de la acetofenona hacia los microorganismos ha sido reportada a concentraciones de 0.4-30 mM (Muhr et al. 2016). Esta toxicidad podría estar causando inhibición de la enzima que cataliza el proceso de oxidación, lo cual concuerda con lo manifestado con Carballeira et al, 2009. Sin embargo, las constantes específicas de velocidad prácticamente son iguales debido que ocupan el mismo orden en magnitud.
En la tabla 15 se muestran los resultados de la productividad de la reacción de oxidación del 1-feniletanol catalizada por Williopsis califórnica.
Tabla 15: Productividad dela reacción de oxidación biocatalitica.
Sustrato Conversión Rendimiento Células Tiempo Productividad
Mm % % millón / ml h mM / millón de cel. H 10 81 76,28 1045 48 3,0x10-6 Volumen de cultivo: 50 ml
Asimismo, en la tabla 15 podemos observar que la conversión del sustrato 1- feniletanol es superior al rendimiento de la reacción, lo cual puede deberse a que esta célula utilice parte del sustrato para incrementar su biomasa, lo cual coincide con las afirmaciones de Quezada, 2006; Carballeira 2009 y Falcon 2012.