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Conocer el mecanismo de acción de proteínas antifúngicas como PgChP y PgAFP puede ser de gran utilidad para el desarrollo de nuevas estrategias antimicrobianas y para determinar su posible aplicación en determinados productos.

Los mecanismos de acción de estas proteínas son tan variados como los organismos que las producen, e incluyen degradación de polímeros de las paredes celulares fúngicas, formación de canales o poros en la membrana, inactivación de ribosomas, alteración de la síntesis de ADN o inhibición del ciclo celular (Selitrennikoff, 2001). No obstante, aún se desconoce el modelo de acción de muchos de estos compuestos.

En cualquier caso, las proteínas antifúngicas de mayor utilidad son las que presentan mecanismos de acción específicos para las membranas de los hongos (Groll y col., 1998), ya que suelen ser poco tóxicas para las células de mamíferos. Los factores que desempeñan un papel más destacado en la interacción del péptido con la membrana son la carga (Hoover y col., 2003) y la hidrofobicidad del compuesto (Friedrich y col., 1999; Hancock y Chapple, 1999). De hecho, el carácter catiónico se ha relacionado de manera directa con la actividad antifúngica (Broekaert y col., 1992; Nielsen y col., 1997b; Koo y col., 1998; Hong y col., 2001). La base de la especificidad de este tipo de proteínas catiónicas es la composición lipídica de la membrana, ya que al estar cargadas positivamente pueden interaccionar con los fosfolípidos aniónicos (Sitaram y Nagaraj, 1999) presentes en las membranas de bacterias y hongos. Por el contrario, en el caso de los eucariotas superiores, esta unión es muy débil, ya que sus membranas están compuestas principalmente por fosfolípidos sin cargas negativas (Theis y Stahl, 2004). El hecho de que tanto PgChP como PgAFP muestren actividad antifúngica pero no produzcan hemólisis de glóbulos rojos de mamíferos, puede apuntar a un mecanismo de acción específico para las membranas de mohos.

Aunque la composición de la pared celular fúngica varía en función del género y la especie, los polímeros más frecuentes son quitina, 1,3-glucano y 1,6-glucano. Otros polímeros como el quitosán sólo se han descrito en un limitado número de hongos de los géneros Rhizopus, Absidia, Fusarium o Mucor (Price y Storck, 1975; Alfonso y col., 1995; Gao y col., 1995). Se ha atribuido un papel de defensa a las quitosanasas por su capacidad de hidrolizar quitosán desestabilizando la pared celular (Somashekar y Joseph, 1996), y en algunos casos se ha relacionado directamente la actividad antifúngica con la actividad

quitosanasa (Saito y col., 2009). Sin embargo, distintos compuestos y tratamientos térmicos provocaron efectos diferentes sobre la actividad quitosanasa y antifúngica de la proteína PgChP, lo que podría significar que la actividad antifúngica no se debe a la degradación del quitosán. Además, PgChP mostró actividad frente a P. commune, especie en la que hasta el momento no se ha descrito la presencia de quitosán.

Por otra parte, tanto PgChP como PgAFP poseen carga neta positiva al pH de 4,5 empleado para evaluar la actividad antifúngica. Esta característica, junto a la capacidad de formar estructuras anfipáticas, es común a todas las proteínas que actúan sobre las membranas microbianas, aun presentando éstas estructuras primarias muy diversas y secundarias tanto en hoja- como en α-hélice (Tossi y col., 2000). Se ha descrito un

mecanismo de acción para algunas de estas proteínas, el modelo Shai-Mat-suzaki-Huang (SMH), que propone la interacción de éstas con los fosfolípidos de carga neta negativa presentes en la membrana plasmática de bacterias y hongos provocando la formación de poros en la misma (Matsuaki, 1999; Shai, 1999; Yang y col., 2000). Entre estas proteínas se encuentran algunas defensinas, que son un grupo de proteínas y péptidos antimicrobianos producidos por mamíferos (Ganz y col., 1990), insectos (Lamberty y col., 1999) o plantas (Broekaert y col., 1995), muy similares a las proteínas antifúngicas producidas por mohos en cuanto a su pequeño tamaño, carácter catiónico y presencia de puentes disulfuro en su estructura. Sin embargo las defensinas producidas por mamíferos e insectos, de menor tamaño (3 a 5 kDa), forman canales iónicos en la membrana plasmática provocando la pérdida de minerales y metabolitos esenciales (Lehrer y col., 1989; White y col., 1995). Adicionalmente, algunas defensinas de plantas producen una desporalización de la membrana como consecuencia de su unión a los fosfolípidos aniónicos (Thevissen y col., 1999). No obstante, PgAFP no presenta actividad frente a bacterias y levaduras (Acosta y col., 2009b). Estos datos coinciden con lo descrito hasta ahora para las proteínas antifúngicas más similares a PgAFP, como PAF (Kaiserer y col., 2003), AFP (Lacadena y col., 1995; Theis y col., 2003) y AcAFP (Skouri-Gargouri y Gargouri, 2008). Anafp en cambio, es la única proteína de este grupo activa frente a levaduras (Lee y col., 1999), si bien hasta el momento se desconoce su mecanismo de acción. La mayoría de estas proteínas además de no mostrar actividad frente a levaduras y bacterias, manifiestan diferentes espectros de inhibición frente a mohos (Marx, 2004). Por ello, tal como se ha descrito para algunas defensinas de plantas (Thevissen y col., 1997; Thomma y col., 2002), se ha propuesto un mecanismo de acción basado en la existencia de receptores específicos

para cada proteína en las membranas plasmáticas de los mohos sensibles (Marx y col., 2007; Meyer, 2008). Esta idea se ve apoyada por el hecho de que la actividad de PAF y AFP es fuertemente inhibida en presencia de Mg2+ y K+ (Theis y col., 2003) y Ca2+, Na+ y K+ _{(Kaiserer y col., 2003), respectivamente, ya que estos cationes podrían saturar los}

receptores existentes en las membranas de los mohos sensibles impidiendo la unión de las proteínas antifúngicas y con ello su actuación (Theis y col., 2003).

Al igual que ha sido descrito para PAF y AFP, tanto PgChP como PgAFP han mostrado diferente sensibilidad a los cationes presentes en el medio. Así, aunque altas concentraciones de Mg2+ y Ca2+ inhiben la actividad antifúngica de ambas proteínas, los cationes monovalentes Na+ _{y K}+ _{únicamente afectan a la actividad de PgAFP (Manuscritos}

3 y 6). Concretamente, al combinar una pequeña cantidad de proteína (3µg/ml) con una

alta concentración de iones (100 mM) se aprecia una pérdida de actividad, aunque sólo frente a A. niger. Por lo tanto, el mecanismo de acción de PgChP y PgAFP podría basarse en la existencia de receptores específicos en las membranas de los mohos sensibles, ausentes en levaduras o bacterias. Estos receptores tendrían mayor afinidad por los cationes divalentes y además diferirían en función del moho sensible, siendo por ejemplo los receptores para PgAFP en A. niger más afines a Na+ y K+ que los presentes en P. restrictum.

Por otra parte, aunque el mecanismo de acción de PAF y AFP podría estar mediado por la presencia de receptores específicos en la membrana, ambas proteínas ejercen efectos diferentes sobre los mohos sensibles. Concretamente, la unión de PAF con el receptor específico incrementa la permeabilidad al K+, provocando una hiperpolarización de la membrana que conlleva la entrada de la proteína mediante endocitosis. A partir de ese momento se activan distintos mecanismos, como la producción de especies reactivas de oxígeno o mitoptosis (formación de poros en las membranas mitocondriales), que ocasionan la muerte celular programada del moho sensible (Marx y col., 2007). A pesar de las similitudes con PAF, el efecto de AFP es diferente, ya que sólo los mohos resistentes son capaces de introducirla por endocitosis posiblemente para una degradación con fines nutricionales. La unión de AFP a los receptores específicos en los mohos sensibles, provoca tanto alteraciones en la membrana como la inhibición de la enzima quitín sintasa que interviene en la biosíntesis de la pared celular fúngica (Hagen y col., 2007; Meyer, 2008). La proteína AFP posee además en su extremo amino terminal la secuencia de unión a la quitina CKYKAQ (Hagen y col., 2007), no descrita en PAF, Anafp, PgAFP, ni PgChP.

Por todo ello, aunque la información disponible sugiere que el mecanismo de acción de PgAFP y PgChP está basado en la interacción específica con receptores presentes en las membranas fúngicas, sería necesario confirmarlo, y en su caso estudiar tanto los receptores implicados, como el efecto que las proteínas ejercen tras la unión con los mismos.

V. 5. APLICACIONES DE LAS CEPAS DE P. chrysogenum Y LAS PROTEÍNAS PgAFP Y