Post-reflection behaviour

En la sección anterior se mostró que el modelo PARAFAC ajustó muy bien las MEE en la zona espectral en la que se encuentran la mayoría de los fluoróforos de interés biológico. Sin embargo, el procedimiento presentado en este Capítulo no logró discriminar las muestras de orina que correspondían a personas sanas de aquellas asociadas a personas afectadas con alguna patología oncológica. Por otro, lado en el Capítulo 5, a partir de los espectros emisión de fluorescencia registrados mediante excitación con luz de 405 nm, se obtuvieron índices sumamente eficientes en dicha discriminación. Entonces, para estudiar la relación entre ambos enfoques se realizó un análisis de la información contenida en las MEE del presente Capítulo en la zona espectral que se corresponde con la de los espectros estudiados en el Capítulo 5. Es decir, se extrajeron los espectros de emisión de fluorescencia a partir de las MEE. Para este análisis se empleó un subconjunto de MEE medido en un rango extendido, que abarcaba longitudes de onda de excitación de hasta 450 nm. Dicho subconjunto estaba formado por 63 MEE, 36 de las cuales correspondían a muestras de orina de personas sanas y 27 a personas con patologías oncológicas. Se extrajeron entonces las “rodajas” de las MEE correspondientes a excitaciones de 395, 400, 405, 410 y 415 nm. De esta manera se generaron 5 conjuntos de datos de 63 muestras cada uno. De ellos, el que corresponde a la excitación con 405 nm se muestra en la figura 6.20.

Figura 6.20 Espectros correspondientes a la excitación con 405 nm extraídos de las MEE

Tal como puede observarse, en general los espectros correspondientes a las personas con patologías oncológicas (en color rojo) se encuentran ligeramente desplazados a la izquierda respecto de los correspondientes a muestras de personas sanas (en color verde). Esto es consistente con lo observado a partir de los espectros presentados en el Capítulo 5. Sin embargo, si bien aquí se llega a apreciar la existencia de las dos poblaciones, las señales de fluorescencia registradas son relativamente bajas y en consecuencia la relación S/N no es buena. Esto es consecuencia de los altos factores de

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dilución empleados en el pre tratamiento de las muestras que se estudiaron en este Capítulo. Cabe recordar que dicha dilución fue necesaria para poder registrar apropiadamente la fluorescencia en la región UV, teniendo que diluir entre 150 y 700 veces las muestras para evitar pérdidas de linealidad en las señales. Sin embargo, resulta evidente que en el rango espectral visible esta dilución repercute negativamente en la capacidad para discriminar entre pacientes sanos y enfermos ya que disminuye sustancialmente la relación señal/ruido.

Asimismo, con fines comparativos, a cada conjunto de datos extraído de las MEE correspondiente a una longitud de onda de excitación se analizó por PCA de manera similar al Capítulo 5. En la tabla 6.4 se resumen los resultados obtenidos de dicho análisis y en la figura 6.21 se muestra una imagen representativa del análisis por PCA.

λEx Outliers FN FP Precisión 395 nm 7 5 11 0,7143 400 nm 7 5 10 0,7321 405 nm 7 5 10 0,7321 410 nm 7 6 13 0,6607 415 nm 5 5 12 0,7069

Tabla 6.4 Resultados del análisis por PCA de los espectros extraídos de las MEE

Figura 6.21 Puntos en el espacio PC1/PC2, con elipses de confianza (1-α=99%.), calculadas a partir de los EEm (λex=405 nm) de las muestras de orina de personas sanas (en verde) y de las

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Del análisis expuesto se concluye que si bien la información correspondiente al rango λex 395-415 nm contenida en las MEE medidas es de baja calidad, presenta evidencia de la existencia de dos poblaciones. La baja calidad de la información se atribuye entonces la gran dilución realizada en el pre-procesamiento de las muestras, y se manifiesta en los espectros con valores de intensidad de fluorescencia muy bajos.

La región espectral UV es donde se registra la mayor intensidad de fluorescencia de la orina, ya que la gran mayoría de los componentes biológicos presentes en la misma fluorescen en ese rango (ver figura 6.22).

Figura 6.22 Localización de los fluoróforos presentes en la orina. El grupo A de fluoróforos representa la mayor contribución a la fluorescencia total de la orina. El grupo B es

característico con 4 a 6 veces menor concentración que el A. Adaptado de [82].

A medida que el rango espectral considerado se corre hacia mayores longitudes de onda, la cantidad de analitos capaces de presentar fluorescencia es mucho menor (ver figuras 6.17, 6.18 y 6.22). En consecuencia, para poder registrar correctamente la fluorescencia en la zona visible se requiere una mayor concentración de la muestra (o menor dilución) que en el rango UV. Se puede interpretar entonces que las MEE analizadas en la sección 6.3 contienen gran cantidad de información, pero en una zona espectral en la que esa información no es útil a los fines de discriminar entre las poblaciones de pacientes sanos y enfermos.

Del análisis realizado se desprende que la zona espectral en la que se ven alteradas las señales de fluorescencia de la orina de pacientes afectados por patologías oncológicas es aquella que corresponde a los metabolitos de la región superior derecha del grupo B en la figura 6.22. Por otra parte, también se puede afirmar que la región espectral asociada a la fluorescencia de los metabolitos del grupo A no se ve significativamente comprometida en personas que cursan procesos oncológicos respecto de las que no.

Por lo tanto, a partir de los resultados obtenidos en los Capítulos 5 y 6, resulta evidente que la información de mejor calidad a los fines de desarrollar un test diagnóstico se encuentra en la zona visible, y no en la región UV del espectro.

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