PROBLEM FORMULATION AND RATIONALE FOR THE STUDY

3.4.1. Cristalización y determinación de la estructura del dominio N-

terminal de mTIM-4.

Tras la purificación del dominio N-terminal de mTIM-4, éste se concentró hasta aproximadamente 20 mg/ml con un concentrador Microsep (PALL, Life Sciences) de un tamaño de poro de 3 kDa. Durante la concentración se ajustó la concentración de NaCl hasta aproximadamente 100 mM.

La cristalización del dominio N-terminal de mTIM-4 se consiguió por el método de gota colgante en la misma condición de cristalización que se usó para mTIM-1 (30% PEG-2000 metil-éter, 5% PEG-400, 0,1M sulfato amónico y 0,1 M acetato sódico pH 5,6) (129), pero con la adición del detergente O-n-octilfosforil colina a una concentración de 100 mM (Tabla 3.3). Usamos placas de 24 pocillos (Costar® Corning Incorporated) donde se añadieron 500 µl de solución de cristalización en el reservorio. Se realizaron gotas de 2,1 µl (1 µl de proteína, 0,1 µl de detergente y 1 µl de solución de cristalización) manualmente sobre un portaobjetos siliconizado, el cual se colocó sobre los pocillos de la placa y se selló con vaselina. Los cristales, que presentaban una forma hexagonal, fueron incubados en una solución de la misma composición que la solución de cristalización a la que se le añadió un 5% de glicerol como crioprotectante. A continuación, los cristales se montaron en criolazos y se congelaron en nitrógeno líquido para proceder a su traslado a las líneas de radiación sincrotrón del ESRF (European Synchrotron Radiation Facility), donde se colectaron los datos de difracción. Estos cristales difractaron a una resolución de

aproximadamente 3,0 Å, pertenecían al grupo espacial P321, contenía una sola molécula

de mTIM-4 en la unidad asimétrica y un 54 % de solvente (Tabla 3.3). A esta primera forma cristalina obtenida para el dominio N-terminal de mTIM-4 la denominamos X1.

Posteriormente, se realizaron pruebas de cristalización de la proteína usando kits comerciales ( Crystal ScreenTM, Hampton Research) con objeto de obtener cristales que difractaran a una mejor resolución. De esta manera, se obtuvo una nueva forma cristalográfica para mTIM-4 a la que denominaremos X2. Estas pruebas de cristalización se realizaron por el método de gota sentada en placas CrystalQuick™ de 96 pocillos (Greiner), con 200 µl de solución de cristalización en el reservorio y gotas de 0,3 µl (0,15 µl de proteína a 10 mg/ml y 0,15 µl de solución de cristalización). Las gotas fueron

dispensadas automáticamente usando un robot nanodispensador Tecan Genesis RSP 150 suplementado con el correspondiente software Gemini versión 4.2. Los nuevos cristales obtenidos para mTIM-4 se obtuvieron en una solución de cristalización compuesta por 0,8 M de tartrato de sodio y potasio y 0,1 M Hepes pH 7,5. Para la congelación de estos cristales previa al transporte a las líneas de radiación sincrotrón del ESRF, se usó solución de cristalización con 30% de etilenglicol como crioprotectante. Estos nuevos cristales con forma de prismas hexagonales, difractaron a una resolución de 2,2 Å, contenían una molécula en la unidad asimétrica y un 62,5 % de solvente. Los cristales pertenecían al grupo espacial P6322, distinto al de los cristales de la forma cristalográfica X1 (Tabla 3.3).

Con los cristales de las formas cristalográficas X1 y X2 de TIM-4 se colectaron conjuntos de datos completos. Las imágenes de difracción tomadas se procesaron con el programa XDS (29) y se escalaron utilizando el programa Scala (18). Las estructuras de mTIM-4 para las dos formas cristalinas se resolvieron mediante el método de reemplazo molecular utilizando el programa PHASER (89) y la estructura de mTIM-2 (PDB ID 2OR7) previamente resuelta en el laboratorio, como modelo. El modelo carecía de los lazos BC, CC’ y FG del dominio IgV de mTIM-2. La forma cristalina X1 fue refinada utilizando CNS (9), mientras que la forma cristalina X2 fue refinada con Refmac (101). Las estructuras fueron ajustadas manualmente y posteriormente refinadas con los

mTIM-4 X1 mTIM-4 X2 mTIM-3

[Proteína] 15 mg/ml 10 mg/ml 12 mg/ml

Método Gota colgante Gota sentada Gota colgante

Condición De Cristalización 30% PEG-2000 metil- éter 5% PEG-400 0,1 M sulfato amónico 0,1 M Acetato sódico pH 5,6 + O- octilfosforil Colina 0,5-0,8 M Na K tartrato 0,1 M Hepes pH 7,5 30% PEG-2000 métil-eter 5%PEG-400 0,1 M Tris-HCl pH 8 0,2 M sulfato amónico Forma Placas hexagonales Prismas hexagonales Barras en clúster Grupo espacial P321 P6322 P21 Mol / U.A. 1 1 1

Tabla 3.3 Condiciones de cristalización y características de los cristales de los dominios N-terminales de las proteínas mTIM-4 y mTIM-3.

programas mencionados hasta que todos los residuos se ajustaron a los mapas de densidad electrónica y presentaban una geometría correcta, dentro de las regiones permitidas del diagrama de Ramachandran.

3.4.2. Cristalización y determinación de la estructura del dominio N-

terminal de mTIM-3.

Tras el replegamiento y purificación del dominio N-terminal de mTIM-3, la proteína se concentró hasta aproximadamente 20 mg/ml y se ajustó la concentración de NaCl hasta 100 mM durante su concentración, tal y como se describió para mTIM-4.

Para la cristalización de mTIM-3 se ensayaron condiciones de cristalización similares a las usadas previamente para la cristalización de mTIM-1 y mTIM-4 X1. La cristalización de mTIM-3 se consiguió mediante el método de gota colgante usando una muestra de proteína a una concentración de 12 mg/ml y una condición de cristalización compuesta por 30% PEG-2000 metil-éter, 5% PEG-400, 0,2 M de sulfato amónico y 0,1 M Tris-HCl pH 8,0. Se realizaron gotas de 2 µl (1 µl de proteína y 1 µl de solución de cristalización) y se añadieron 500 µl de solución de cristalización en el reservorio. Los cristales obtenidos presentaron forma de barras que crecían pegadas formando agrupaciones. Para la congelación de estos cristales se usó solución de cristalización con un 5% de glicerol como crioprotectante. Estos cristales, difractaron a una resolución máxima de 2,6 Å, usando radiación de sincrotrón (ESRF). Pertenecían al grupo espacial P21 y presentaban una molécula en la unidad asimétrica (Tabla 3.3).

La determinación de la estructura cristalográfica de mTIM-3 se llevó a cabo mediante el método del reemplazo molecular usando el programa PHASER (89) y la estructura de mTIM-3 previamente determinada como modelo (PDB ID 2OYP) (10). Durante el proceso de refinamiento los modelos estructurales fueron procesados mediante sucesivos ciclos de ajuste manual a los mapas de densidad electrónica y fueron refinados con el programa Phenix.refine 1.4. (147).

3.5. Cristalización y determinación de la estructura del dominio N-