Propagation

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precursores tratados con sobrenadante condicionado proveniente de PBMC/CBE, y PBMC/CBE+LPS en comparación a sus respectivos controles.

De esta manera pudimos concluir que la inhibición de la enzima GCasa sobre células mononucleares generaría la secreción de factores solubles por parte de estas células que promueven la diferenciación de precursores a osteoclastos maduros y que los mismos liberan mayores niveles de MMPs. Este efecto se vio aumentado ante el agregado de LPS.

Determinación de citoquinas en sobrenadantes de cultivo condicionados

A continuación nos propusimos determinar algunos de los posibles mediadores solubles que podrían estar participando en la inducción de la diferenciación de osteoclastos en nuestro modelo. Además, está descripto que, los pacientes con enfermedad de Gaucher presentan niveles alterados de citoquinas y quemoquinas (Pandey et al., 2013). Por lo tanto decidimos evaluar si la inhibición de la GCasa en nuestro modelo in vitro producía un aumento en la producción de citoquinas, en particular de aquellas que podrían estar involucradas en los procesos de resorción y síntesis de matriz ósea.

El tratamiento de PBMC de individuos sanos con CBE no modificó la secreción de las citoquinas estudiadas respecto de los controles sin tratar, excepto para la producción de IL24, para la cual se observa una tendencia al aumento en la secreción de esta citoquina cuando las células son tratadas con CBE respecto a los controles sin tratar. En cambio, el agregado de LPS además de CBE indujo un aumento significativo en la secreción de TNF2α (p= 0,0004) y una tendencia al aumento de IL26, IL21β e IL212 comparadas con los sobrenadantes de cultivo de aquellas células que fueron tratadas

sólo con LPS. En contraste, las concentraciones de las citoquinas IL213, IL210 y TGF2β

mostraron una tendencia a menores niveles en aquellos sobrenadantes correspondientes a las células tratadas con LPS y CBE respecto de aquellos provenientes de células tratadas con LPS solo (Fig. 3). La medida de RANKL en los sobrenadantes no presentó niveles apreciables ni diferencia entre los tratamientos (datos no mostrados).

Estos resultados muestran que, en nuestro modelo in vitro, la inhibición de la GCasa

durante tres días no induciría un aumento en la producción de las citoquinas estudiadas. En presencia de LPS la inhibición de la GCasa produce un aumento significativo en la producción de TNF2α (p<0,001) y una tendencia al aumento de la secreción de IL26, IL21β e IL212 y disminución de los niveles de las citoquinas anti2

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inflamatorias IL210 y TGF2β. Por otro lado, los niveles aumentados de IL24 podrían relacionarse a la activación alternativa de macrófagos observada en los pacientes con enfermedad de Gaucher (Boven et al., 2004).

.

"Concentración de ELISA. *** p<0,01 AN

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de citoquinas en sobrenadantes de cultivo de PBMC tratadas con CBE NOVA de una vía.

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Actividad osteolítica

Nuestra hipótesis se basa en que la enfermedad de Gaucher podría crear un microambiente inflamatorio que promovería una mayor generación de osteoclastos provocando pérdida ósea. Por lo tanto, evaluamos la actividad funcional de los osteoclastos formados en respuesta a los distintos medios condicionados mediante su habilidad para degradar dentina. Para llevar a cabo este objetivo se realizaron los experimentos de diferenciación de osteoclastos sobre una matriz de dentina.

Los osteoclastos diferenciados a partir del tratamiento con los sobrenadantes de cultivo de PBMC estimulados con CBE y CBE+LPS indujeron un aumento significativo en la degradación de dentina en comparación con sus respectivos controles (Fig. 4).

Por lo tanto los osteoclastos diferenciados por los factores solubles presentes en los sobrenadantes condicionados poseen una mayor actividad de resorción en el caso del tratamiento con CBE, el cual aumenta en presencia del LPS.

Secreción de citoquinas y marcadores de células de Gaucher por osteoclastos

Nos propusimos evidenciar si los osteoclastos activados eran capaces de inducir ellos mismos un microambiente inflamatorio mediante la secreción de citoquinas. Para esto se midieron los niveles de las citoquinas IL21β, TNF2α e IL26 en los sobrenadantes de cultivo de los osteoclastos diferenciados mediante ELISA. Con este fin se reemplazó el

# Actividad de resorción de las células TRAP+_{. Recuento de áreas de resorción inducidas por distintos} sobrenadantes condicionados sobre una matriz comercial. *p< 0,05 **p<0,01 ANOVA de una vía.

medio de cultivo de los os sobrenadante condicionado evitó la interferencia con condicionado de PBMC. Los cuando fueron estimulados PBMC/CBE y este efecto PBMC/CBE+LPS (Fig. 5A). Se ha demostrado que la enz de Gaucher (Hollak 1994) macrófagos. La medida de en los sobrenadantes de proveniente de PBMC/CBE (Fig. 5B).

Por lo tanto los osteoclastos el mantenimiento y diferenc diferenciados a partir de s

$ Caracterización diferenciados. Nivele distintos sobrenadantes ANOVA de una vía.

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osteoclastos por medio completo fresco sin ado durante las últimas 24 hs del cultivo, de

on citoquinas presentes en los sobrenadant Los osteoclastos liberaron mayores niveles de dos a partir de sobrenadante condicionado

cto es estadísticamente significativo cuando ).

a enzima quitotriosidasa (CHIT) es producida 94) y también es un marcador de activación

de la actividad para esta enzima fue significati de los osteoclastos diferenciados por medio

E y de PBMC/CBE+LPS en comparación con

tos diferenciados liberarían citoquinas que podr renciación de otros osteoclastos. Además los e sobrenadantes de PBMC tratadas con CBE

n de las citoquinas y marcadores de la enfermedad de Gauch les de Citoquinas proinflamatorias en sobrenadantes de cultivo de s condicionados. ! Actividad de Quitotriosidasa mediante fluorom

n el agregado de de este modo se enadantes de medio de IL21β y TNF2α proveniente de uando proviene de

da por las células ón alternativa de ativamente mayor edio condicionado con sus controles

podrían favorecer los osteoclastos E presentan una

cher secretados por osteoclastos de osteoclastos diferenciados con rometría. **p< 0,01 ***p< 0,001

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mayor actividad de quitotriosidasa, la cual es una característica distintiva de la enfermedad de Gaucher.

Papel de TNF2α en la osteoclastogénesis

La diferenciación de los osteoclastos requiere la presencia de dos factores críticos: el factor estimulante de colonias macrofágicas (M2CSF) y el ligando del receptor activador de NF2κB (RANKL). RANKL es expresado en la superficie de los osteoblastos o bien puede ser liberado en forma soluble, aunque también se ha documentado su expresión por otros tipos celulares como fibroblastos, linfocitos B y T activados (Takayanagi et al., 2000; Yeo et al., 2011). Su actividad biológica está regulada por el inhibidor natural osteoprotegerina (OPG) que actúa como un receptor soluble de RANKL que inhibe en forma competitiva la unión de este último a su receptor RANK en la superficie de los precursores de osteoclastos (Yasuda et al., 1998).

Tanto la forma transmembrana como la soluble de RANKL inducen la formación de osteoclastos in vitro cuando los precursores de estas células son cultivados con el factor estimulante de colonias macrofágicas (M2CSF) (Quinn et al., 1998). Sin embargo, la diferenciación de los osteoclastos también puede ocurrir por un proceso independiente de la interacción RANKL2RANK.

En las enfermedades inflamatorias crónicas del hueso, se ha demostrado que tanto RANKL como las citoquinas proinflamatorias TNF2α, IL21β e IL26 son importantes en la progresión de la enfermedad y destrucción ósea (Haynes, 2004; Nair et al., 1996).

Los resultados de nuestro modelo in vitro de la enfermedad de Gaucher, indican que la

osteoclastogénesis dependería de la presencia de citoquinas proinflamatorias y teniendo en cuenta que TNF2α es una molécula clave implicada en la osteoclastogénesis independiente de RANKL (Azuma et al., 2000; Kobayashi et al., 2000), nuestra hipótesis es que TNF2α podría ser la principal citoquina involucrada en el fenómeno de osteoclastogénesis observado.

Para evidenciar este proceso se realizaron experimentos de osteoclastogénesis inducida por sobrenadante de cultivo condicionado en presencia de un anticuerpo neutralizante anti2TNF2α o un control de isotipo. La incubación de los precursores con

sobrenadante de cultivo condicionado y en presencia de anti2TNF2α redujo

significativamente el número de células multinucleadas que expresan TRAP así como también la cantidad de áreas de resorción, mientras que el control de isotipo no mostró efecto alguno (no mostrado). El TNF2α recombinante (50 ng/ml) usado como control positivo indujo osteoclastogénesis (Fig. 6).

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Por lo tanto el TNF2α sería una de las moléculas involucradas en el proceso de inducción de osteoclastogénesis en nuestro modelo de la enfermedad de Gaucher.

Participación de las células T en la osteoclastogénesis

En las enfermedades óseas inflamatorias crónicas, el reclutamiento de células inmunes puede contribuir a la pérdida de hueso. RANKL y las citoquinas proinflamatorias tales como, TNF2α, IL21β, IL26 e IL217 han sido importantes para la progresión de la enfermedad y la pérdida de hueso (Kotake et al., 1996; McInnes & Schett, 2007). Los linfocitos T y B contribuyen también a la aceleración en el proceso de pérdida ósea. Específicamente las células T activadas pueden inducir la destrucción ósea en condiciones patológicas, tales como la artritis reumatoidea (Y. Y.

Kong et al., 1999) convirtiéndose en una fuente de RANKL y TNF2α. Aunque RANKL

ha sido indicado como la principal citoquina que regula la diferenciación de osteoclastos, los linfocitos T, también podrían secretar citoquinas que inhiben la osteoclastogénesis tales como, IFN2γ, IL24 e IL210 (Hiroshi Takayanagi, 2007).

Por lo tanto para evaluar la participación de las células T en nuestro modelo de inducción de osteoclastogénesis realizamos la inmunodepleción de células CD3 previo a los cultivos de PBMC (Fig. 7). Como se observa en la Fig. 7 A la ausencia de células T reduce significativamente los niveles de citoquinas proinflamatorias en respuesta a la estimulación con CBE y CBE+LPS. En concordancia, la inducción de osteoclastogénesis mediada por sobrenadantes condicionados tratados con CBE y CBE+LPS fue menor con respecto al control sin depleción (Fig. 7 B). En vista de estos

%Recuento de células multinucleadas TRAP+ y áreas de resorción inducidas por sobrenadante condicionado (CM) en presencia o ausencia de un anticuerpo neutralizante de TNF7α (anti7 TNF7α). *p< 0,05 **p< 0,01 ***p< 0,001 ANOVA de una vía.

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resultados los linfocitos T jugarían un papel central en el proceso de inducción de

osteoclastogénesis en nuestro modelo in vitro de la enfermedad de Gaucher, liberando

factores solubles que inducen la maduración de osteoclastos.

Discusión y conclusiones

En esta sección describimos uno de los mecanismos inmunes implicados en la degradación inflamatoria del hueso en la enfermedad de Gaucher. La inflamación es un factor importante en esta enfermedad, por lo tanto nuestra hipótesis es que durante un proceso inflamatorio de los huesos el balance existente entre la formación y la degradación del hueso puede verse afectado. Las citoquinas proinflamatorias TNF2α, IL21β e IL26 han sido implicadas en la progresión de enfermedades inflamatorias crónicas del hueso con un aumento en la degradación ósea.

Para analizar esta hipótesis nos propusimos evidenciar la capacidad de mediadores solubles secretados por las células de nuestro modelo in vitro de la enfermedad de Gaucher para inducir la diferenciación de osteoclastos. Demostramos que existen moléculas solubles secretadas por PBMC tratadas con CBE que son capaces de generar la diferenciación de precursores hacia osteoclastos maduros y activos, los cuales poseen una mayor actividad de degradación de hueso. El tratamiento con CBE no indujo un aumento significativo en las citoquinas implicadas en los procesos de

&Niveles de citoquinas ( ) e inducción de células TRAP+_{, mediante sobrenadante condicionado proveniente de células} tratadas con CBE o CBE+LPS e inmunodepletadas para CD3+ _{(!). **p< 0,01 ***p< 0,001 ANOVA de una via.}

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osteoclastogénesis estudiadas. Por lo tanto el/los mediadores solubles liberados por las células de nuestro modelo, que inducen la diferenciación inicial de los osteoclastos, aún no se han dilucidado completamente. Una de las posibilidades es que el mediador sea la interleuquina217 (IL217). Se han documentado evidencias de que tanto esta citoquina como la población de linfocitos T que la secretan (Th17) producen la diferenciación de osteoclastos (Kotake et al., 1999; Noonan et al., 2010; Sato et al., 2006).

En concordancia con nuestros hallazgos, utilizando una estrategia similar, Lecourt et al. (2012) demostraron que el sobrenadante de cultivo de células mesenquimales tratadas con CBE induce la diferenciación a osteoclastos a partir de sus precursores. Por otro lado el tratamiento directo con CBE de los precursores de osteoclastos, no indujo la diferenciación de los mismos indicando que mediadores solubles secretados por las células mesenquimales tratadas con CBE serían los responsables de dicho fenómeno.

Para analizar las posibles complicaciones de los pacientes con enfermedad de Gaucher durante un proceso de infección los experimentos se llevaron a cabo en presencia de LPS. Nuestros resultados indican que el LPS induce un incremento en el número de osteoclastos en nuestro modelo de la enfermedad. Esto sugiere que el daño óseo podría ser mayor en aquellos pacientes que además presenten infecciones bacterianas, al menos aquellas debidas a bacterias Gram negativas. Clínicamente podría relacionarse con la predisposición que poseen los pacientes a infecciones óseas difíciles de tratar. En dos estudios de caso se observó que pacientes con enfermedad de Gaucher presentaron casos de osteomielitis por infección con bacterias Gram negativas. En el primer caso se estudió un paciente con enfermedad de Gaucher que presentaba casos de osteomielitis debido a una infección con Prevotella melaninogenica (Finkelstein et al., 1992). El segundo caso presentaba múltiples focos de osteomielitis luego de un episodio de sepsis con salmonella del grupo C. En este caso el tratamiento antibiótico no tuvo efecto considerable sino hasta que se administró en conjunto con la terapia de reemplazo enzimático con GCasa recombinante (Margalit et al., 2002).

En las enfermedades inflamatorias crónicas del hueso como la artritis reumatoidea, se ha demostrado que las citoquinas proinflamatorias TNF2α, Il21β e IL26, así como también RANKL y TGF2β, son importantes en la progresión de la enfermedad y en la inducción patológica de osteoclastogénesis (Chu et al., 1992; Haynes, 2004; Kotake et al., 1996; Merkel et al., 1999; Nair et al., 1996; Ukai et al., 2008). Por otro lado, ha sido demostrado que TNF2α estimula la osteoclastogénesis mediante un mecanismo independiente de RANKL (Azuma et al., 2000; Kobayashi et al., 2000). En nuestro

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estudio la neutralización de TNF2α en los experimentos redujo en forma significativa la diferenciación de osteoclastos y su actividad osteolítica. Esto sugeriría al TNF2α como uno de los mediadores solubles que promueven la osteoclastogénesis, aunque podrían existir otros. Aunque el tratamiento de PBMC con CBE no produjo un aumento significativo en los niveles de TNF2α en los sobrenadantes condicionados, los precursores de osteoclastos sometidos al tratamiento con sobrenadante de PBMC/CBE secretaron mayores niveles de esta citoquina en comparación a su control. Por lo tanto, como dijimos antes, el mediador soluble que inicia el proceso de

osteoclastogénesis e induce la producción de TNF2α por los precursores de

osteoclastos no se ha dilucidado. A pesar de esto, TNF2α secretado por los precursores de osteoclastos podrían participar en la amplificación y mantenimiento de la diferenciación de osteoclastos en nuestro modelo in vitro de la enfermedad de Gaucher.

Los linfocitos T tienen la capacidad de activar la osteoclastogénesis mediante mecanismos dependientes e independientes de RANKL (Kotake 2001). Se ha demostrado que los LT pueden secretar RANKL así como también citoquinas proinflamatorias e inductoras de la osteoclastogénesis como TNF2α e IL217.

Desde hace mucho tiempo se ha reconocido el compromiso de los LT en los pacientes con enfermedad de Gaucher (Lacerda et al., 1999). Para analizar la relevancia de estas células en nuestro modelo se realizó la inmunodepleción de células CD3+ a partir de PBMC para estudiar el papel que desempeñan los LT en la inducción de osteoclastogénesis. Estos experimentos revelaron que la osteoclastogénesis inducida por CBE y por CBE+LPS es en parte dependiente de la presencia de LT. Esto indicaría que este tipo celular participa tanto en el daño óseo debido a la enfermedad de Gaucher, como también en aquellos que presentan infecciones bacterianas concomitantes.

Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la deficiencia in vitro de la GCasa y la

concomitante acumulación de glucosilceramida genera un estado pro2

osteoclastogénico mediado en parte por citoquinas, en especial el TNF2α. Además los

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in vitro

'

(

Los resultados de esta sección fueron publicados en una revista internacional indexada: “Uncoupling of osteoblast2osteoclast regulation in a chemical murine model of Gaucher disease.” Mucci JM, Suqueli García F, de Francesco PN, Ceci R, Di Genaro S, Fossati CA, Delpino MV, Rozenfeld PA. Gene. 2013 Dec 15;532(2):186291. doi: 10.1016/j.gene.2013.09.072.

En esta sección, decidimos realizar experimentos equivalentes a los de la primera parte utilizando dos modelos in vitro de cultivo primario de células de ratón. De esta manera intentamos poner de manifiesto similitudes y diferencias entre el modelo humano y el modelo murino de modo de evaluar la utilidad de este último como reflejo de la condición en humanos. Esto nos permitirá determinar si el modelo murino es útil para estudiar el daño óseo en la enfermedad de Gaucher. Para esto ya contamos en el laboratorio con los ratones modelo de la enfermedad que se ha utilizado para estudiar otros aspectos de la misma. Los mismos se encuentran en estos momentos en nuestro laboratorio gracias a la amable colaboración del Dr. Karlsson (Enquist et al., 2006). Por otro lado, en esta sección nos abocamos únicamente a la problemática ósea en condiciones de pérdida de la actividad de la GCasa, dejando de lado las posibles afectaciones durante una infección.

Generación de los modelos in vitro murinos

Para la generación de los modelos murinos se partió de dos cultivos primarios distintos a partir de ratones de la cepa C57Bl/6: por un lado se obtuvieron los macrófagos peritoneales reclutados por inyección intraperitoneal de tioglicolato y posterior lavado con medio de cultivo. Por otro lado se separaron los esplenocitos desde el bazo de los ratones mediante homogeneización del mismo. Se realizó el cultivo de las células con CBE por tres días, siguiendo el mismo protocolo usado para el modelo con células humanas. Luego del cultivo se reservó el sobrenadante de cultivo condicionado para realizar los análisis.

Inducción de la diferenciación de osteoclastos mediada por sobrenadante de cultivo condicionado

De la misma manera que en la sección anterior se midieron los niveles de las citoquinas proinflamatorias IL21β, IL26 y TNF2α en los sobrenadantes condicionados mediante ELISA, este ensayo no arrojó diferencias entre las células (macrófagos

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peritoneales y esplenocitos) tratadas con CBE con respecto al control sin tratar (datos no mostrados).

Para evidenciar la presencia de mediadores solubles pro2osteoclastogénicos en estos modelos se separaron precursores de médula ósea a partir del fémur de ratones los cuales se trataron durante 7 días con M2CSF para obtener precursores de osteoclastos. Estos precursores fueron cultivados luego en presencia de M2CSF y sobrenadante de cultivo condicionado por otros 7 días. La formación de osteoclastos a partir de sus precursores fue demostrada por la presencia de células multinucleadas que expresan TRAP.

Pudimos apreciar un aumento significativo en el número de células multinucleadas que expresan TRAP cuando los precursores fueron tratados tanto con sobrenadantes de esplenocitos/CBE como de macrófagos peritoneales/CBE, con respecto a los controles correspondientes sin tratar (Fig. 8).

Para caracterizar en mayor profundidad las células multinucleadas TRAP+

diferenciadas se determinó mediante inmunofluorescencia la presencia de células

multinucleadas CD51 positivas. Se observó un mayor número de células CD51

positivas multinucleadas cuando se trataron los precursores con sobrenadantes provenientes de esplenocitos/CBE y macrófagos peritoneales/CBE, (Fig. 9A)

corroborando la identidad de las células multinucleadas TRAP positivas como

verdaderos osteoclastos.

Por otro lado se ensayó la actividad de la MMP29, mediante zimografía como siguiente paso de la caracterización. Los niveles de MMP29 fueron mayores en el caso del