Pros and Cons for the Different BOP Stack Configurations

fueron inoculados con M. roreri a diferentes edades de desarrollo de los frutos (1, 2, 3, 4 y 5 meses de edad después de la polinización), determinando sobre ellos los días en que se presentaron los síntomas y signos de la enfermedad.

Se realizó la polinización manual de flores de cacao recién abiertas, con la finalidad de tener frutos de la misma edad. Inmediatamente después de la polinización, se protegieron las flores con frascos de plástico, para asegurar que los frutos fueran producto de la polinización manual y no de la natural. Permitiendo así asegurar la misma edad de todos los frutos y que no hubiera infección alguna por M. roreri, antes de la inoculación manual. A los ocho días

61 de la polinización se retiraron los frascos de plástico y se procedió a realizar el embolsado de cada uno de los frutos, con bolsas de polietileno, esto para evitar que los frutos se contaminaran con esporas del medio ambiente.

Se preparó el inoculo (conidias) de M. roreri a partir de mazorcas provenientes del campo en estado de mancha, éstas se lavaron, desinfectaron por 10 minutos en una solución de hipoclorito de calcio al 10% y se colocaron a esporular en una cámara húmeda ubicada en el laboratorio. Una vez que la mazorca esporuló y las conidias alcanzaron la madurez (coloración crema), éstas se colectaron por gravedad en cajas de Petri colocadas en la base de la cámara (Merchán, 1991).

Para determinar la concentración de inóculo presente en una aguja de disección, se realizaron 10 conteos, disolviendo las conidias adheridas a la punta de una aguja de disección en 200 ml de agua destilada con 2 gotas de Tween 80 al 0,1% esta solución se llevó a agitación por un tiempo aproximado de 10 minutos. En la cámara de Neubauer se determinó la concentración promedio de esta solución.

Se realizó la inoculación de M. roreri en frutos de uno, dos, tres, cuatro y cinco meses de edad; utilizando conidias secas adheridas a la punta de una aguja de disección (9 x 104 conidias/mL), las cuales se depositaron en una zona de dos centímetros cuadrados de la zona previamente marcada con esmalte y humedecida con agua estéril. Posterior a la inoculación los chilillos fueron protegidos en una cámara húmeda constituida por una bolsa de polietileno y una toalla de papel empapada con agua estéril, con el propósito de humedecer el ambiente interno y favorecer la germinación de las esporas; la toalla de papel se retiró dos días después cortando uno de los extremos de la bolsa y con ayuda de una pinza. El sitio de inoculación se marcó para facilitar el seguimiento del desarrollo de la enfermedad y la aparición de los síntomas iniciales y finales en el ensayo (Adaptado de la metodología de Merchán, 1981).

62 Variables cuantificadas:

Fueron síntomas, signos e índice de severidad interna, la toma de datos se realizó todos los días a partir del primer mes de inoculación, hasta que terminó el ensayo.

 Síntomas. Son manifestaciones visibles; éstas resultan de la interacción entre los mecanismos del ataque del patógeno y los mecanismos de defensa del hospedante y de los efectos fisiológicos de la enfermedad (Arauz, 1998). Para el caso de M. roreri se cuantificó la presencia y días en que aparecieron gibas, manchas mosaico, decoloración y mancha aceitosa.

 Signos. Manifestaciones del patógeno discernibles a simple vista; entre los signos comúnmente asociados a una enfermedad, están las estructuras reproductoras o vegetativas del hongo (Arauz, 1998). Se cuantificó la presencia y los días en que su manifestaron tanto el Inicio de la esporulación (esporas - polvo blanco) y las esporas maduras (polvo color crema).

 Índice de severidad interna. A los seis meses de edad todos los frutos fueron cosechados, se abrieron longitudinalmente, agrupado según cada mes de inoculación y se evaluó el daño ocasionado en el interior de los frutos, por M. roreri. Para determinar la severidad interna de los frutos se utilizó la escala propuesta por Sánchez et al., (1987), donde mide el porcentaje de área necrosada desarrollada por M. roreri, así: grado 0= 0%; 1=1-20%; 2= 21-40%; 3= 41-60%; 4= 61-80%; 5=100%. Esta variable muestra la capacidad de daño interno que puede causar el hongo en la mazorca afectando los granos.

 La unidad de muestreo fueron 10 frutos inoculados con M. roreri por cada mes de edad de los frutos, donde cada fruto fue una repetición, es un ensayo de tipo descriptivo.

63 3.4.4.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación. Para desarrollar este ensayo se realizó la polinización artificial de las flores del clon UNACH 130, con la finalidad de obtener frutos de la misma edad y sin incidencia de monilia, para lo cual se tomaron flores abiertas y se les quitaron los pétalos y se unieron sus anteras con el estigma de la flor también abierta que estaba en el árbol, luego se colocó un dispositivo plástico para aislar la flor y se esperó a su desarrollo; posteriormente se preparó el inoculo de M. roreri según la metodología descrita por Merchán, (1991).

Sobre frutos de una edad cercana a los 70 días se realizó la aspersión de cada uno de los extractos y del polisulfuro de calcio y se cubrieron con una bolsa de polietileno y se colocó una toalla húmeda por espacio de tres días, luego se destapó y se realizó la inoculación de M. roreri, utilizando conidias secas adheridas a punta de una aguja de disección (9 x 104 conidias/mL), las cuales se depositaron en una zona de dos centímetros cuadrados de la zona previamente marcada con esmalte y humedecida con agua estéril. Posterior a la inoculación los chilillos fueron protegidos en una cámara húmeda constituida por una bolsa de polietileno y una toalla de papel empapada con agua estéril, con el propósito de humedecer el ambiente interno y favorecer la germinación de las esporas; la toalla de papel se retiró dos días después cortando uno de los extremos de la bolsa y con ayuda de una pinza. El sitio de inoculación se marcó para facilitar el seguimiento del desarrollo de la enfermedad y la aparición de los síntomas iniciales y finales en el ensayo.

A otro grupo de frutos se realizó la inoculación de M. roreri con la metodología ya descrita y un día después se realizó la aspersión de los tratamientos manteniendo la cámara húmeda.

Tratamientos:

Se probaran los extractos de clavo, canela y pimienta en forma de hidrolatos, así como el polisulfuro de calcio, tanto antes como después de la inoculación del hongo, y se incluyó un testigo sin inocular y uno inoculado con M. roreri.

64 Descripción de Tratamientos

Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación

Tratamiento

Dosis

Aplicación antes inoculación

Clavo semilla hidrolato 20%

Canela corteza hidrolato 30%

Pimienta semilla hidrolato 30%

Polisulfuro de calcio 10%

Aplicación después inoculación

Clavo semilla hidrolato 20%

Canela corteza hidrolato 30%

Pimienta semilla hidrolato 30%

Polisulfuro de calcio 10%

Testigo sin inoculación (aplicación solo agua) Testigo inoculado

Evaluación: Para finalizar el ensayo, 80 días después de la inoculación, se realizó un muestreo destructivo de las mazorcas de cada tratamiento con el propósito de medir las variables incidencia, severidad externa (SE) y severidad interna (SI).

 Incidencia: porcentaje de frutos enfermos en relación al total de frutos inoculados.

 Severidad externa: esta basada en la apariencia externa del fruto y los signos del patógeno, utilizando la escala: grado 0=fruto sano, 1= jiba; 2=mosaico; 3= mancha (necrosis); 4= micelio hasta un 25% de la mancha; 5= micelio en más del 25% de la mancha (Adaptado de Brenes, 2003). Esta variable mide el nivel de daño externo causado por el hongo y su habilidad para producir propágalos.

 Severidad interna: basada en el porcentaje de necrosis interna observada en el fruto cuando este cortado longitudinalmente y medido con relación a la escala desarrollada por Sánchez, et al., 1982. Donde: grado 0= cero área necrosada; 1=1-20% del área necrosada; 2= 21-40% área necrosada; 3= 41-60% área necrosada; 4= 61-80% área necrosada; 5=100% área necrosada. Esta variable muestra la capacidad de daño interno que puede causar el hongo en la mazorca afectando los granos.

65 Diseño experimental:

Se utilizó un diseño completamente al azar con cuatro tratamientos y 10 repeticiones, siendo la unidad experimental un fruto para un total de 40 frutos para el ensayo.

Análisis estadístico:

Los datos de Índice de severidad interna (ISI) y de Índice de severidad externa (ISE) fueron transformados mediante la fórmula (valor+0,5)1/2. Para determinar si existieron diferencias significativas en cada uno de los tratamientos se realizó el análisis de varianza y se aplicó la prueba de comparación de medias de Tukey al nivel de significancia de 5%, cuando existió diferencia significativa. Los datos fueron procesados en el programa SAS para Windows 9.0.

3.4.4.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad en