Recommendations and Future Research Needs

propio BZL, lo que podría ser responsable de la disminución en la Cmáx observada con el transcurso del tratamiento. En respuesta a esto, se podrían establecer esquemas de combinación de drogas destinados a mejorar la eficacia del BZL, como así también de drogas coadministradas.

El efecto de un fármaco depende de su concentración en su sitio de acción. La misma se encuentra definida por la absorción, la distribución y la depuración del mismo. En el organismo pueden definirse órganos de relevancia farmacológica que cumplen una función importante en los procesos mencionados anteriormente. El hígado y el riñón cumplen un rol clave en la depuración de fármacos. El intestino participa además en la absorción de compuestos administrados en forma oral. Tanto en la limitación de la absorción a nivel intestinal como en la excreción en todos los tejidos mencionados intervienen sistemas de biotransformación y transportadores de drogas, proteínas que modifican químicamente los fármacos llevando en la mayoría de los casos a su inactivación y facilitando su posterior transporte fuera de la célula. Los sistemas de biotransformación pueden dividirse en sistemas de fase I y sistemas de fase II. Los sistemas de fase I incluyen a las proteínas de la familia del citocromo P450 y catalizan diversas reacciones de oxidoreducción. El miembro más representativo es el CYP3A4, responsable del metabolismo de aproximadamente el 50% de las drogas de aplicación clínica. Los sistemas de fase II catalizan reacciones de conjugación de los fármacos o los productos de la reacciones de fase I con compuestos como glutation (reacciones catalizadas por las glutation-S-transferasas, GSTs) o ácido glucurónico (reacciones catalizadas por las UDP-glucuronosiltransferasas, UGTs) entre otros. Las proteínas transportadoras suelen ser de carácter multiespecífico. Entre los transportadores de eflujo pueden mencionarse a la P-glicoproteína (P-gp), la proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (MRP2) y la proteína de resistencia de cáncer de mama (BCRP) de localización apical en hepatocitos, enterocitos y células de los túbulos renales. La proteína asociada a resistencia a multidrogas 3 (MRP3), por su parte, se localiza en las membranas basolaterales de los mencionados tipos celulares.

La expresión y función de los sistemas anteriores no es constante sino que existe una regulación, por los mismos sustratos y por otras drogas, representando la base molecular de las interacciones droga-droga. La regulación puede cursar a nivel transcripcional (cambios en la síntesis de ARNm), nivel post-transcripcional (cambios en la estabilidad del ARNm o en su procesamiento), nivel traduccional (cambios en la síntesis de proteína) o a nivel post-traduccional (cambios en la actividad de la proteína sin cambios en su expresión). En el caso de la regulación por fármacos, la regulación transcripcional mediada por receptores nucleares suele ser uno de los mecanismos más importantes. El receptor de pregnanos X (PXR) es un receptor nuclear de elevada promiscuidad. El mismo es activado por un gran número de fármacos y otros xenobióticos

y regula la expresión de diversos genes que codifican sistemas de biotransformación y transportadores de drogas.

El Benznidazol (BZL) es el fármaco de elección para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Actualmente se dispone de escasa información acerca de los efectos del BZL sobre los sistemas de biotransformación y transportadores de drogas. Su coadministración con otros compuestos y, por ende, la aparición de interacciones droga-droga no puede ser descartada.

Los objetivos del presente trabajo de tesis fueron: 1) establecer el efecto del tratamiento con BZL sobre la expresión y actividad de sistemas de biotransformación de fase I (CYP3A4), sistemas de biotransformación de fase II (GST y UGT) y proteínas transportadoras de drogas (P-gp, MRP2, BCRP y MRP3); 2) establecer el/los mediadores moleculares de tal efecto, en especial la participación de PXR y determinar el rol del BZL como activador de PXR y 3) estudiar el/los transportadores responsables del eflujo de BZL al exterior celular y cómo el pretratamiento con BZL afecta tal proceso. Los estudios se realizaron en la línea celular HepG2. La misma deriva de un hepatocarcinoma celular humano y conserva diversas propiedades bioquímicas, morfológicas y fisiológicas de los hepatocitos lo que la convierte en un modelo adecuado para estudiar la regulación de proteínas hepáticas humanas.

En primer lugar se realizó un estudio concentración-respuesta (0-1000 μM) de la expresión de los transportadores en respuesta al tratamiento con BZL. Se observó una inducción significativa a nivel proteico (por inmunocuantificación) de P-gp por BZL 200 y 1000 μM (160 ± 27 y 282 ± 94% respectivamente vs 100 ± 7%). Un patrón similar se observó en la expresión de MRP2 (175 ± 15 y 491 ± 5% para 200 y 1000 μM de BZL respectivamente vs 100 ± 14%). BCRP y MRP3 no mostraron diferencias significativas a ninguna de las concentraciones estudiadas. La inducción de P-gp y MRP2 se verificó tanto en lisados celulares como en membrana plasmática. Para los estudios posteriores se escogió la concentración de BZL 200 μM por ser la mínima concentración a la que se observa un efecto. A nivel de ARNm (por PCR cuantitativa a tiempo real), se observó también una inducción de P-gp y MRP2 por BZL (200 μM). Concretamente la expresión fue de 332 ± 151 vs 100 ± 69% en el caso del mensajero de P-gp y 293 ± 137 vs 100 ± 57% en el caso de MRP2. La inducción observada en la expresión se correlacionó con un aumento en la actividad tanto para P-gp como para MRP2. En el primer caso la actividad

se determinó por acumulación del sustrato modelo Rhodamina 123. Las células tratadas con BZL mostraron una acumulación significativamente menor (85 ± 2 vs 100 ± 6%) que las células controles, lo que indica un mayor eflujo del mismo, y esto una mayor actividad de P-gp. En el caso de MRP2, la actividad se determinó midiendo el eflujo del sustrato dinitrofenil-S-glutation (DNP-SG) observándose un eflujo significativamente mayor (181 ± 1 vs 100 ± 7%) en las células tratadas que en las células controles.

A nivel de las enzimas de biotransformación, BZL (200 μM) indujo la expresión proteica de CYP3A4 y GSTπ (143 ± 1 vs 100 ± 22% y 175 ± 12 vs 100 ± 35%, respectivamente). La inducción se observó también a nivel del ARNm (150 ± 23 vs 100 ± 21% y 178 ± 94 vs 100 ± 11% para CYP3A4 y GSTπ respectivamente). También se observó una inducción en la actividad de GST, cuantificada a través de la formación de DNP-SG (204 ± 32 vs 100 ± 7%). La actividad de CYP3A4 se determinó por la formación de un derivado luminiscente a partir de un sustrato modelo de la enzima. Se observó una disminución en la actividad (58 ± 6 vs 100 ± 4%) que indica inhibición de la misma por BZL.

A fin de caracterizar el mecanismo de acción del BZL en el modelo celular empleado se verificó por inmunocuantificación la expresión de PXR, el receptor X de retinoides α (RXRα) con el cual heterodimeriza PXR y del coactivador p300, necesario para la función de los mismos. Mediante sobreexpresión de PXR se observó una inducción en la expresión de genes blanco de PXR como ser P-gp, MRP2, MRP3 y BCRP, lo que indicaría funcionalidad de PXR en el modelo y posibilidad de mediación del efecto de BZL por el mismo. Para confirmar tal hipótesis, se procedió al silenciamiento de PXR empleando un ARN de interferencia específico dirigido contra el ARNm del receptor nuclear lográndose un silenciamiento de PXR a nivel de proteína del 74% con respecto a las células transfectadas con un ARN de interferencia no silenciante. En estas condiciones se repitió el tratamiento con BZL y se cuantificó la expresión de las proteínas cuya expresión había resultado previamente inducida (CYP3A4, GSTπ, P-gp y MRP2). En todos los casos, el silenciamiento de PXR resultó en la ausencia de inducción por BZL confirmando la participación de PXR como mediador del efecto de BZL. A fin de determinar si el mecanismo por el cual PXR media el efecto de BZL consiste en una activación del mismo, se determinó la actividad del mismo en presencia de distintas concentraciones de BZL. Para ello se utilizaron células LS180-PXRRE, derivadas a partir de un adenocarcinoma de colon humano, que expresan en forma estable un gen

reportero sensible a la activación de PXR. Por regresión sigmoidea se obtuvo un valor de concentración efectiva 50 (EC50) de 259 ± 38 μM corroborándose así el rol de BZL como activador de PXR y sugiriendo su rol como ligando del mismo.

A fin de determinar el/los transportadores que mediarían el eflujo de BZL al exterior celular, se corroboró en primer lugar si el BZL sufre metabolización en las condiciones experimentales empleadas. Al no observarse metabolismo significativo, se procedió a realizar los estudios posteriores cuantificando la droga sin modificar (por HPLC). En primer lugar se determinó la acumulación intracelular de BZL luego de 2 h de incubación en presencia de verapamilo (como inhibidor de P-gp) o de probenecid (como inhibidor de las MRPs). Se observó una acumulación significativamente mayor en las células coincubadas con verapamilo respecto de las células controles no expuestas a ningún inhibidor (128 ± 16 vs 100 ± 3%) sugiriendo la dependencia del transporte de BZL, al menos en parte, de P-gp. No se observaron cambios significativos en la acumulación de BZL en las células coincubadas con probenecid (88 ± 8 vs 100 ± 3%) permitiendo descartar la participación de una MRP en el transporte de BZL, al menos en su forma sin modificar. A fin de confirmar la participación de P-gp en el transporte de BZL en células HepG2, se procedió a su silenciamiento mediante transfección con un ARN de interferencia. Se observó una acumulación significativamente mayor de BZL en las células P-gp-_{, transfectadas con un ARN de interferencia específico contra P-gp, que en células} P-gp+_{, transfectadas con un ARN de interferencia no silenciante (115 ± 2 vs 100 ± 3%)} confirmando la participación de P-gp en el transporte de BZL. Teniendo en cuenta que P-gp participa en el transporte de BZL y que el pretratamiento con BZL induce la expresión de P-gp, es esperable que el pretratamiento con BZL modifique su propia concentración intracelular. A fin de corroborarlo se repitió determinó la acumulación de BZL en condiciones de inducción de P-gp por el fármaco (200 μM, 48 h). Se observó una acumulación significativamente menor de BZL en las células que fueron pretratadas con respecto a las células controles expuestas al vehículo (73 ± 15 vs 100 ± 2%). El efecto desaparece ante el agregado de verapamilo (inhibidor de P-gp), donde la acumulación en células controles y pretratadas con BZL no difiere estadísticamente (120 ± 4 y 115 ± 5% respectivamente) confirmando así la participación de P-gp.

Los resultados del presente trabajo de tesis demuestran un efecto inductor del tratamiento con BZL sobre la expresión de CYP3A4, GSTπ, P-gp y MRP2. La inducción de la expresión en GSTπ, P-gp y MRP2 se refleja en un aumento en la actividad de las

proteínas empleando sustratos modelos de cada proteína. La inducción sugeriría un aumento en la depuración de fármacos sustratos de los mismos cuando estos son coadministrados con BZL. Además se confirmó el rol de P-gp en el transporte de BZL, lo que podría también representar la base de interacciones droga-droga en el caso de que el BZL sea administrado en condiciones de inducción de P-gp por otra droga. Simultáneamente, dado su carácter inductor de P-gp, BZL por si solo sería capaz de aumentar su propia depuración.

En el caso de CYP3A4 por el contrario se observa un efecto inhibitorio sobre la actividad. Teniendo en cuenta que el CYP3A4 es responsable del metabolismo de aproximadamente el 50% de los fármacos de empleo en la práctica clínica, de observarse un efecto similar in vivo, el tratamiento con BZL podría disminuir la depuración de sustratos coadministrados propiciando la aparición de interacciones droga-droga y efectos potencialmente tóxicos.

Además, se demostró la participación de PXR en la regulación del efecto y se confirmó la activación del receptor nuclear por BZL. Teniendo en cuenta que el mecanismo de activación descrito para PXR implica unión del sustrato al bolsillo hidrofóbico del dominio de unión a ligando, los resultados sugerirían un rol de BZL como ligando del mismo. No obstante, se requeriría la confirmación mediante ensayos de competición. Por otro lado, PXR cumple un rol regulador clave sobre un gran número de sistemas de biotransformación y transportadores de drogas como así también sobre genes que regulan otras vías metabólicas (ej. síntesis de ácidos biliares) e interacciona con otras vías de transducción de señales (ej. respuesta inflamatoria, ciclo celular). Por lo tanto, no pueden descartarse potenciales interacciones entre BZL y las mencionadas vías de señalización.

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