Langerhans, tanto en procesos necesarios en condiciones normales como en situaciones patológicas, tales como la diabetes [168]. Éstas pueden desarrollar múltiples funciones en un mismo tipo celular haciendo que en muchas ocasiones presenten actividades opuestas según las condiciones y el modelo de estudio [156]. Las citoquinas que actúan sobre los islotes son producidas tanto por las propias células beta y alfa del islote, como por células del ducto, del tejido endotelial y células del sistema inmunitario presentes en el tejido. En situaciones normales, su presencia resulta beneficiosa para el mantenimiento de la homeostasis del tejido pancreático, ya que participan en procesos de reparación, renovación o adaptación a cambios fisiológicos del entorno, mediando efectos protectores, proliferativos o de mejora de la secreción de insulina [168]; sin embargo, cuando éstas se producen en el contexto de procesos que generan una inflamación crónica, tiene lugar una excesiva exposición a dichas citoquinas que puede dar lugar a efectos deletéreos que se traducen en alteraciones en la secreción de insulina y que finalmente conducen al desarrollo de diabetes [168, 169]. Este es el caso descrito para citoquinas como IL-1β e ΙL−6. Diversos estudios in vitro han descrito el papel dual de la IL-1β en los islotes. Cuando éstos son tratados con esta citoquina en distintas condiciones de dosis y tiempos, la IL-1β puede inducir efectos beneficiosos en la función de la célula beta o efectos deletéreos que llevan a la alteración en la regulación de la secreción de insulina y la inducción de la apoptosis [170-172]. En relación con este último fenómeno, se ha descrito que la glucolipotoxicidad promueve la producción de IL-1β que, a su vez, genera un efecto tóxico más pronunciado [160].
Respecto a la IL-6, ésta forma parte de un grupo de citoquinas, entre las que se encuentra el LIF, el CNTF, la OSM y la CT-1, que comparten componentes del receptor de membrana, compuesto por homodímeros de GP130 o heterodímeros en combinación con LIFR. La IL-6 ejerce múltiples funciones en diversos tipos celulares [115]. Sus propiedades pleiotrópicas le confieren tanto efectos beneficiosos como perjudiciales, y en el caso de las células beta pancreáticas no son una excepción. Su presencia en sangre en concentraciones elevadas es un marcador predictivo del desarrollo de DM2 y obesidad [121]. En cuanto a su efecto en la célula beta pancreática, existen estudios que demuestran su actividad protectora frente a la apoptosis inducida por citoquinas
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proinflamatorias. Este efecto ha sido comprobado tanto en estudios in vitro como en un modelo in vivo de trasplante de islotes en ratones diabéticos [124, 173]. Paradójicamente, también se han descrito efectos perjudiciales en la secreción de insulina como consecuencia del tratamiento con IL-6, e incluso un posible papel en el desarrollo de diabetes [120].
En este contexto, estudiamos el papel de una nueva citoquina, la CT-1, y sus posibles efectos protectores, teniendo en cuenta que se trata de una proteína de la misma familia que IL-6. En los estudios realizados en células beta pancreáticas utilizamos las mismas concentraciones y condiciones que las descritas para IL-6, así como las mismas fuentes celulares: islotes pancreáticos murinos y un subclon de la línea de insulinoma MIN6, MIN6B1 [143]. Nuestros resultados in vitro indican que el tratamiento con CT-1 ejerce un claro efecto antiapoptótico a largo plazo, cuando ambas fuentes celulares son sometidas a deprivación de suero como estímulo proapoptótico. Los resultados fueron consistentes y corroborados mediante dos técnicas de medición de apoptosis (determinación de actividad Caspasa 3 y la técnica de TUNEL). Además, quisimos comparar la eficiencia de este tratamiento con el efecto ya descrito para IL-6 [124]. Nuestros resultados demuestran que la CT-1 ejerce un efecto protector mayor que la IL- 6. Por otra parte, para el análisis del efecto antiapoptótico de la CT-1 utilizamos un segundo tratamiento proapoptótico: la incubación de células MIN6B1 o islotes murinos con citoquinas proinflamatorias. Se ha descrito que la inflamación producida por estas citoquinas está claramente implicada en el desarrollo de diabetes [174]. En este caso, encontramos resultados discordantes, que pueden ser reflejo de la naturaleza pleiotrópica de la CT-1 y de la activación de diferentes vías en los diferentes tipos celulares utilizados. En concreto, observamos una notable protección frente a la apoptosis en los islotes murinos; sin embargo, en la línea de insulinoma MIN6B1, el pretratamiento con CT-1, sensibiliza a estas células frente al daño producido por la exposición a las citoquinas proinflamatorias induciendo niveles mayores de apoptosis. El estudio de las posibles rutas implicadas y mecanismos activados tras el tratamiento con CT-1 podría esclarecer el origen de su efecto dual. En este sentido, se ha descrito que la combinación de IL-6 e IL-1β produce alteraciones en la secreción de insulina [123]. Sin embargo, el tratamiento con la CT-1 en nuestros experimentos se realizaba de forma preventiva, previo a la administración de Citomix, la combinación de las citoquinas proinflamatorias IL-1β, TNFα e IFNγ. Futuros experimentos donde se combine el tratamiento de CT-1 con las citoquinas proinflamatorias, podrían dilucidar si
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la CT-1 en combinación con otras moléculas deletéreas para la célula beta ejercería un efecto protector o, por el contrario, induciría un efecto nocivo sinérgico, teniendo en cuenta su ya mencionada naturaleza pleiotrópica.
Además, quisimos profundizar en los mecanismos que se activan en presencia de la CT-1 y conducen a la protección de las células. Diversos autores han demostrado que la proteína BCL-xL se encuentra localizada en la mitocondria y ejerce un efecto antiapoptótico en la célula, bloqueando la liberación de citocromo C al citosol, además de impedir la activación de PARP [175]. El incremento en su expresión en diversos tipos celulares es mediado a través de la vía de JAK/STAT3 por las citoquinas de la familia GP130 [117]. Se ha descrito que el efecto de la IL-6 en el aumento de la expresión de BCL-xL es un factor clave en la proliferación y supervivencia de células de mieloma y otras poblaciones celulares [117]. Esta proteína también se vio aumentada tras el tratamiento de islotes murinos con IL-6 [124]. De manera similar, la presencia de la proteína BCL-xL se ha detectado en cardiomiocitos incubados con otras citoquinas de la familia de GP130, tales como LIF [176], así como en el tratamiento con CNTF de células fotorreceptoras sometidas a estímulos apoptóticos [177].
A la vista de nuestros resultados en los ensayos in vitro y a pesar de las limitaciones encontradas en estos modelos, el claro efecto protector de la CT-1 sobre la supervivencia de los islotes indica que podría plantearse su uso en indicaciones específicas tales como el trasplante de islotes, donde éstos se ven privados de su entorno fisiológico, lo que induce una elevada muerte celular [178]. En estas situaciones, el tratamiento de los islotes con CT-1 previo a su trasplante, podría mejorar su supervivencia en el tejido hospedador.
De forma análoga al resto de citoquinas de la familia de GP130, la CT-1 activa numerosas vías de señalización en los diversos tejidos donde se han descrito sus efectos. Así por ejemplo, se han realizado numerosos estudios referentes al papel que juega la CT-1 en el tejido cardíaco [126, 129, 179]. Estos estudios demuestran que la vía de activación de las MAP Kinasas, en la que se produce la fosforilación de ERK, está implicada en procesos de supervivencia [179]; así mismo, la vía de JAK/STAT3 también es diana de la CT-1 en los cardiomiocitos, y está implicada en procesos de hipertrofia y de remodelado tisular [126, 179]. De igual manera, estas vías se encuentran activadas tras la inducción de daño en el tejido hepático, estando relacionadas con procesos antiapoptóticos [134]. Utilizando como tejido diana los islotes de Langerhans
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del páncreas, en nuestros estudios pudimos observar que la CT-1 es capaz de activar las vías de ERK y JAK/STAT en las células beta pancreáticas. Los resultados obtenidos muestran una rápida activación de los componentes de las vías de ERK y JAK/STAT, al igual que se había descrito con anterioridad en hepatocitos en cultivo [134]. Estos resultados indican que la CT-1 interviene en la activación de rutas que pueden dar lugar a muy diversos e importantes procesos como son la apoptosis, la proliferación, la adhesión, así como procesos específicos de cada tipo celular, como es el caso de la secreción de insulina en la célula beta pancreática.
En el presente estudio, quisimos determinar si la CT-1 tenía un efecto directo en la secreción de insulina in vitro, tanto en presencia como en ausencia de glucosa. Observamos que nuestra citoquina de estudio es capaz de estimular la secreción de insulina en células MIN6B1 en ausencia de glucosa, y que además ejerce un efecto sinérgico en combinación con ésta, de forma similar a como actúan las incretinas [180]. Este efecto resultó no ser dependiente de la dosis de CT-1. Estos datos aportan una nueva contribución de la CT-1, en comparación con la citoquina de referencia IL-6, la cual ha demostrado tener diferentes efectos en la secreción de insulina según condiciones experimentales. Algunos autores han descrito que su efecto sobre la secreción de insulina es inhibitorio [123] o dependiente de la presencia de otras citoquinas como IL-1β [181]. Sin embargo, otros autores postulan lo contrario y demuestran la inducción de la secreción de insulina y el aumento de la transcripción de su gen en la línea celular HIT-T15 [182]. El estudio más reciente indica un incremento de la secreción de insulina en la línea MIN6 y en islotes de ratón tratados con la proteína recombinante IL-6 mediada por la activación de la vía de Fosfolipasa C [183]. Además, este mismo estudio demuestra que la sobreexpresión de IL-6 en hepatocitos de ratones mediante el uso de un adenovirus que codifica para esta citoquina, mejora la respuesta a glucosa, e induce una reducción del tejido adiposo. Las discrepancias obtenidas por los diferentes estudios pueden ser debidas a las condiciones experimentales, tales como las concentraciones utilizadas de IL-6, el tiempo de exposición a la citoquina o la fuente celular empleada [184]. Nuestros experimentos en relación al efecto de la CT-1 en la secreción de insulina fueron realizados íntegramente en la línea celular MIN6B1, por tanto, un objetivo prioritario en futuros experimentos es el análisis de la secreción de insulina en islotes pancreáticos murinos. Por otra parte, la IL-6 es capaz de incrementar los niveles de producción de glucagón por parte de las células alfa del páncreas, además de inducir su proliferación [185]. Por tanto, un
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objetivo futuro de estudio sobre el efecto de la CT-1 sería dilucidar si ésta podría ejercer algún efecto en la producción de glucagón u otros efectos en el resto de células que conforman el islote de Langerhans.
La secreción de insulina es un proceso complejo que requiere de la participación de muchos factores. Una vez que la glucosa es interceptada por los transportadores GLUT-2 y es metabolizada, los siguientes pasos darán lugar a la liberación de los gránulos de secreción cargados de moléculas de insulina al torrente sanguíneo y a un aumento de la transcripción del gen que codifica para esta hormona. En nuestro estudio, evaluamos el efecto de la CT-1 en la secreción de insulina, haciendo uso de diferentes inhibidores que intervienen a distintos niveles de este proceso. Así mismo, está descrito que la vía de ERK, cuya activación tiene lugar por efecto de la CT-1, está implicada en múltiples funciones de la célula beta [157, 186] y, aunque no hay constancia de un papel directo en la secreción, sí participa en la vía de señalización que da lugar a la transcripción del gen de la insulina [157].
Otro de los inhibidores utilizados en el presente estudio, la Nifedipina, actúa a nivel del transportador de calcio tipo L [187]. Este transportador es clave para que tenga lugar la entrada de calcio exterior al citoplasma, proceso necesario para el movimiento de las vesículas de secreción al exterior. Cuando incubamos la línea MIN6B1 con altas concentraciones de glucosa en presencia de ciertas concentraciones del inhibidor Nifedipina, el tratamiento con CT-1 es capaz de revertir el efecto inhibitorio de la Nifedipina en la secreción de insulina. Puesto que la Nifedipina bloquea la entrada de calcio al interior de la célula, nuestros resultados sugieren que la CT-1, a través de la activación de vías alternativas, es capaz de revertir el efecto inhibidor de la Nifedipina. Este fenómeno sobre la estimulación de la secreción de insulina también ha sido descrito para otras moléculas como las incretinas (GLP-1) [180] y la acetilcolina [188]. En el caso de GLP-1, esta molécula actúa a través de su receptor acoplado a proteina G en la célula beta, incrementando los niveles de AMPc y la activación de la proteína quinasa A (PKA) [189], tratándose de un efecto dependiente de glucosa. Sin embargo, el efecto estimulador de la acetilcolina de la secreción de insulina resulta independiente de la presencia de glucosa, como es el caso del efecto observado para CT-1. La acetilcolina actúa a través de su receptor muscarínico, de forma que activa la vía de Fosfolipasa C [188, 190, 191]. Por esta razón, estudiamos si la secreción de insulina inducida por CT-1 también podría depender de la activación de una vía dependiente de
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Fosfolipasa C. Nuestros estudios demuestran que la secreción de insulina estimulada por CT-1, tanto en presencia como en ausencia de glucosa, puede ser bloqueada mediante el uso de Neomicina, un inhibidor de la actividad Fosfolipasa [192]. La Fosfolipasa C se encuentra anclada en la membrana celular y actúa metabolizando la hidrólisis de los fosfatidil inositol bifosfato (PIP2), dando lugar a dos segundos mensajeros importantes en el proceso de secreción de insulina: fosfatidil inositol trifosfato (PIP3) y diacilglicerol (DAG). El PIP3 estimula la liberación de calcio al citosol a través del retículo endoplasmático, mientras que el DAG activa la enzima Fosfoquinasa C (PKC) implicada en la exocitosis de las vesículas de insulina [162]. Nuestros resultados sugieren que la secreción de insulina estimulada por CT-1 podría estar relacionada con esta vía (Figura 36). Aunque hasta la fecha no hay ningún estudio que demuestre la activación de la vía de Fosfolipasa C/PIP2 por parte de la CT-1, existen ensayos realizados con citoquinas de la misma familia, como IL-6, que han demostrado ser capaces de inducir la activación de Fosfolipasa C en la línea celular de feocromocitoma de rata PC12 [193]. Así mismo, se ha demostrado la participación de otras citoquinas de la familia de GP130, tales como el CNTF, en la activación de Fosfolipasa Cγ en una línea de sarcoma de Ewing [194]. De manera similar a nuestros resultados, un estudio reciente ha demostrado la inducción de la secreción de insulina en las células MIN6 en presencia de IL-6, mediada a través de la vía de Fosfolipasa C. Mediante el uso de inhibidores específicos, Suzuki y colaboradores [183] han demostrado la implicación del PIP3 sobre su receptor en el retículo endoplasmático, aunque no de la activación de Fosfoquinasas por parte de la acción de DAG. Futuros experimentos utilizando inhibidores específicos de cada componente implicado en esta ruta nos permitirán determinar cual es el papel concreto de la CT-1 en la misma. Por otra parte, es probable que, de algún modo, la actividad de CT-1 converja en algún punto de la ruta de activación de la secreción de insulina, teniendo en cuenta que CT-1 es capaz de activar múltiples cascadas de señalización a través de su receptor LIFR/GP130. Los ensayos con el inhibidor de ERK (PD98059) indican que la activación de la ruta de las MAP Kinasas es necesaria para la estimulación de la secreción de insulina por parte de la CT-1 en ausencia de glucosa; sin embargo, no explica el efecto sinérgico de la CT-1 en presencia de glucosa. Probablemente la activación de otras vías esté implicada en la secreción de insulina tras el tratamiento con CT-1 en presencia de glucosa.
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Por otra parte, es interesante observar el efecto que tiene el inhibidor PD98059 sobre la secreción de insulina inducida por el tratamiento con glucosa, ya que al inhibir la fosforilación de ERK, observamos un aumento en la secreción de insulina, que es independiente del tratamiento con CT-1. Este resultado coincide con lo observado por otros autores cuando cultivan islotes de rata en presencia de PD98059 e IL-1β [195]. En cuanto a su efecto en combinación con CT-1, podemos observar que la secreción de insulina inducida por CT-1 en ausencia de glucosa es dependiente de la vía de ERK. Sin embargo, no podemos concluir si la vía de ERK está involucrada en el efecto sinérgico de la CT-1 en la secreción de insulina en presencia de glucosa, puesto que la propia inhibición de la vía de ERK es capaz de estimular la secreción de insulina a los mismos niveles que lo hace la CT-1 en presencia de glucosa.
Figura 36. Posible ruta de actuación de la CT-1 a través de la activación de Fosfolipasa C. El panel izquierdo representa la hipotética vía de inducción a la secreción de insulina en presencia de CT-1 y ausencia de glucosa. A través de la activación de la vía de Fosfolipasa C mediada por la activación del receptor de la CT-1 se induce la movilización de los gránulos de secreción (en rojo) que contienen insulina. El panel derecho indica la secreción de insulina mediada por la entrada de glucosa a la célula, principal efector de la secreción de insulina, junto con el efecto sinérgico de la CT-1, mostrando un mayor número de gránulos de secreción (en azul y rojo).
GLUT2 Glucosa PLC LI FR GP130 CT-1 PIP2 DAG IP3 RER PKC ? + + Nifedipina De spolar iz ac ió n memb rana Bomba de K+ ↑ATP/ ADP ↑Ca2+ ↑Ca2+ GL UT 2 PLC LI FR GP130 CT-1
Canal de calcio tipo L
PIP2 DAG IP3 RER PKC ↑Ca2+ ? + + Neomicina Bomba de K+
Secreción de insulina inducida por CT-1
- Glucosa + Glucosa
Neomicina
Canal de calcio tipo L
GLUT2 Glucosa PLC LI FR GP130 CT-1 PIP2 DAG IP3 RER PKC ? + + Nifedipina De spolar iz ac ió n memb rana Bomba de K+ ↑ATP/ ADP ↑Ca2+ ↑Ca2+ GL UT 2 PLC LI FR GP130 CT-1
Canal de calcio tipo L
PIP2 DAG IP3 RER PKC ↑Ca2+ ? + + Neomicina Bomba de K+
Secreción de insulina inducida por CT-1
- Glucosa + Glucosa
Neomicina
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A la luz de estos resultados, la capacidad de la CT-1 para inducir la secreción de insulina de forma sinérgica en presencia de glucosa la convierte en una candidata para su posible aplicación clínica permitiendo mejorar la secreción en los casos en que el remanente de masa de célula beta sea insuficiente para producir el aporte necesario de la misma.
2. Modelos experimentales de diabetes utilizando ratones C57 CT-1-/-