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Las muestras clínicas utilizadas para realizar todos los análisis en este trabajo de Tesis Doctoral corresponden a aspirados nasofaríngeos (ANF) tomados a niños menores de cinco años de edad que fueron internados con IRAB en el Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez y en salas de neonatología y pediátricas de Hospitales Públicos de la ciudad de Buenos Aires y el gran Buenos Aires. El período analizado comprende seis años consecutivos (1999-2004) y algunas muestras provenientes del año 1997. Las muestras de ANF fueron obtenidas mediante la aspiración de secreciones respiratorias con sonda nasogástrica tipo K30 dentro de los primeros días de comenzados los síntomas respiratorios. Todas las muestras fueron remitidas en el día al Laboratorio de Virología del Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez de la ciudad de Buenos Aires junto con una historia clínica en la que se describía la edad, sexo, diagnóstico clínico, grado de la dificultad respiratoria y fecha de toma de muestra. Inmediatamente luego de que las muestras fueron recibidas, se les realizó una detección rápida de virus respiratorios mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el HRSV, FluA, FluB, HAdV y PIV 1, 2 y 3, (Light Diagnostics, Chemicon Int.Inc. USA). La técnica se desarrolló como fue descrito previamente y según instrucciones del fabricante (Gardner and McQuilin, 1968).

Las muestras que resultaron positivas por la técnica de IFI para HRSV fueron conservadas en freezer a -80 ºC hasta la realización del estudio molecular.

Se tomó la siguiente convención para nomenclar los virus. En el caso del análisis de los HRSV subtipo A: la sigla RSV (del inglés respiratory syncytial virus), el país de aislamiento

(Argentina, ARG), el número de aislamiento (número interno del laboratorio) y el año de aislamiento (dos últimos dígitos en la nomenclatura). En el caso de HRSV subtipo B: la sigla RSV, la ciudad de aislamiento (Buenos Aires, BA), el número de aislamiento (número interno del laboratorio) y el año de aislamiento. En este último caso se utilizó una nomenclatura diferente que para el subtipo A debido a que ya habían sido publicadas secuencias con similares características y de esta manera se facilitaba el análisis comparativo. En el caso del análisis de variantes virales encontradas intrapaciente la nomenclatura de los clones indica: la

sigla RSV, el país de aislamiento (Argentina, ARG), el número de aislamiento (número interno del laboratorio), el año de aislamiento y el número de clon correspondiente (CNº). 3.1.2. Cepas patrones utilizadas

La cepa de HRSV Long/56 (número de acceso a GenBank M17212) fue utilizada como

referencia de HRSV subtipo A y la cepa CH18537/63 para el subtipo B (número de acceso a

GenBank M17213). Para el caso del estudio de las cepas del subtipo B con inserción, se

utilizó además la cepa RSVBA3833/99. Estas tres cepas virales fueron cedidas gentilmente por las Dras. Alfonsina Trento, Mónica Galiano y Cristina Videla del Laboratorio de Virología Clínica, Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas (CEMIC) “Norberto Quirno”, Hospital Universitario.

3.2. Aislamiento por plaqueo de las cepas patrones Long/56 y CH18537/63 y determinación del título de las mimas.

3.2.1. Cultivo de los virus en línea celular

Se utilizó la línea celular continua Hep-2 derivada de carcinoma epidermoide de nasofaringe humana (Moore et al.,1952).

Los cultivos celulares se realizaron en botellas de 25 cm2 utilizando medio mínimo esencial (MEM) con sales de Hanks, adicionado con suero fetal bovino (SFB) al 5%, solución antimicoplasma (tilosina) al 1%, glutamina al 1% y aminoácidos no esenciales 1% (Gibco, Invitrogen). Luego de obtener una monocapa con una confluencia del 70%, las células Hep-2 se inocularon con 200 l de las muestras con los virus a cultivar a una alta multiplicidad de infección (previamente clarificadas y decontaminadas por centrifugación o filtración), más el agregado de 1 ml de medio de cultivo MEM Hanks al 2% en SFB (medio de mantenimiento). Se dejó adsorber el virus durante una hora a 37 ºC y se completó el volumen de 10 ml con medio de mantenimiento. Posteriormente se incubó en estufa gaseada al 5% en CO2 a 37 ºC

hasta observación de efecto citopático (ECP). Una vez obtenidos los característicos sincicios producidos por HRSV (como ECP) se levantaron las células infectadas con una espátula, se dividió el volumen total en sendos criotubos y se conservaron en N2 líquido hasta su posterior

3.2.2. Purificación de virus por plaqueo

Se inocularon por duplicado, diluciones seriadas en base diez de la muestra viral a ser titulada en medio de cultivo al 2% (10-1 hasta 10-7). Se utilizaron placas de cultivo celular de seis pocillos (preparadas 24 h antes con células Hep-2). Una vez adsorbidos los virus en las células se cubrieron los pocillos con medio de mantenimiento adicionado con agarosa al 0,8% en agua, de manera de inmovilizar las posiciones en las cuales cada célula había sido infectada. Se incubaron tres días a 37 ºC en estufa gaseada con CO2 al 5% y se le agregó una

capa nueva de agarosa al 0,8% más el agregado del colorante vital rojo neutro preparado en agua estéril (0,01 g/ml). Se incubaron nuevamente en estufa hasta la observación de placas de lisis celular producto de la infección viral inmovilizada. Con un capilar estéril se aislaron individualmente cada una de las placas de lisis y se reinocularon en nuevas botellas de células Hep-2 (cada una en forma individual). Una vez ampliados estos virus se procedió a repurificarlos en una segunda ronda de plaqueo. Luego de su amplificación fueron guardados en varias alícuotas en N2 líquido hasta su titulación y posterior utilización en los experimentos

de clonado (Martínez et al., 1997).

3.2.3. Titulación del HRSV por el método de dilución límite (determinando unidades formadoras de placa (UFP))

Para conocer exactamente qué título viral poseía cada stock de virus patrón se utilizó la técnica de titulación por UFP. Para ello se realizaron diluciones sucesivas desde 10-1 _hasta

10-7 de los virus que habían sido previamente purificados por plaqueo y preservados en criotubos. Se inocularon 125 l de cada dilución por triplicado en placas de cultivo de 24 pocillos preparadas con células Hep-2 en medio MEM Hanks de mantenimiento y se incubaron siete días a 37 ºC en estufa gaseada con CO2 al 5%. Luego de ese período de

incubación se eliminó el medio viejo y se fijaron las placas con formol al 20% en agua durante 4 horas. Se tiñeron con cristal violeta al 0,1% en 2% de etanol en agua durante un minuto, se lavaron y secaron (Martínez et al., 1997). Para realizar el cálculo se contaron las

UFP para cada dilución por triplicado con lupa, se calcularon los promedios y se utilizó la siguiente fórmula:

UFP/ml= (Nº de UFP totales promedio x 1000 l) x F/ 125 l

3.3. Análisis molecular