Al hacer las primeras tomas a través de los filtros pasabanda, se hizo evidente que las imágenes de las distintas bandas presentaban un registro incorrecto (Figura 4-22 izda.). Este defecto resulta especialmente problemático en los bordes de los granos, donde se producen efectos de halo que pueden dar lugar a identificaciones erróneas, con la consiguiente aparición de fases inexistentes.
DISEÑO Y DESARROLLO DEL SISTEMA AUTOMATIZADO
Estudiando el comportamiento de los objetivos de las dos principales marcas de microscopios (Leica y Zeiss), se pudo comprobar que tanto la posición del centro óptico de la imagen (Figura 4-23) como la escala efectiva de ésta (Figura 4-24) varían con la longitud de onda de la luz.
Figura 4-23. Curvas que recogen el desplazamiento del centro óptico entre las distintas bandas
Figura 4-24. Curva que recoge la variación de la escala de la imagen entre las distintas bandas (realización propia)
Por este motivo, se ha desarrollado un novedoso procedimiento de calibración geométrica del instrumento que determina automáticamente las correcciones que hay que aplicar a cada banda para conseguir un registro perfecto (Figura 4-22 dcha.).
El procedimiento está basado en el uso de un “blanco” como el de la Figura 4-25, con una disposición reticular de puntos reflectantes de tamaño y separación conocidos, que debe ser colocado, enfocado y centrado en el campo visual del instrumento por el operador del sistema.
-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 D if er en ci a en tr e p o si ci o n es e n X /Y (p íx el es )
Longitud de onda nominal del filtro (nm)
Posición relativa de la imagen de cada banda
Microscopio Zeiss Axioskop 2 MOT con objetivo Epiplan-Neofluar 20x
Posición del centro óptico de la imagen en X Posición del centro óptico de la imagen en Y
-4,0 -3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 D if er en ci a en tr e lo n gi tu d es (p íx el es )
Longitud de onda nominal del filtro (nm)
Escala relativa de la imagen de cada banda
Microscopio Zeiss Axioskop 2 MOT con objetivo Epiplan-Neofluar 20x
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Figura 4-25. Blanco de vidrio para corrección de distorsión de 25 x 25mm (Edmund Optics, 2018)
Una vez hecho esto, el operador arranca el proceso de calibración propiamente dicho, que realiza las siguientes operaciones en cada una de las bandas: captura de la imagen del blanco, binarización de la imagen para aislar las zonas que destaquen del fondo (los puntos de la red y pequeños defectos del blanco), eliminación de las zonas que no cumplan ciertos límites de tamaño y distancia al borde de la imagen (para descartar los puntos situados en el borde y los defectos del blanco), selección de las cuatro zonas más próximas a las esquinas de la imagen, y extracción de las coordenadas de imagen de sus respectivos centros de gravedad (XCGi, YCGi).
Figura 4-26. Calibración geométrica del sistema de adquisición mediante un blanco de puntos (realización propia)
A partir de ellas se determinan los parámetros finales de la calibración geométrica, que serán utilizados en el procedimiento desarrollado para la adquisición de una imagen multiespectral: el promedio (XGC, YCG) de los cuatro centros de gravedad será considerado como el centro de
gravedad global de la imagen, que es asimilable al centro óptico, y el promedio de las distancias euclídeas entre los centros de gravedad 1 y 2 y entre los centros de gravedad 3 y 4, junto con el conocimiento de la distancia de separación real entre dichos puntos, permitirán calcular la escala efectiva de la imagen. La Figura 4-26 muestra gráficamente el concepto de este proceso de
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calibración geométrica. Esta operación debe realizarse una sola vez con cada uno de los objetivos, por lo que el momento ideal para llevarla a cabo es durante la instalación del sistema, o tras el montaje de un objetivo nuevo.
Otro problema de tipo geométrico, aunque completamente diferente, es la existencia de un pequeño error de orientación entre los ejes del sensor de la cámara y los ejes de la platina motorizada, prácticamente inevitable debido a que el ajuste de la orientación de la cámara debe hacerse a mano. Aunque el ángulo suele ser inferior a dos grados y no tiene trascendencia en la adquisición de imágenes aisladas, sus consecuencias se hacen patentes al componer un mosaico con imágenes adquiridas en el barrido automático de una preparación (Figura 4-28 izda.), por lo que resulta aconsejable medirlo para poder corregirlo posteriormente (Figura 4-28 dcha.). El procedimiento de calibración geométrica descrito anteriormente ha sido ampliado para incorporar una segunda etapa de proceso específicamente concebida para medir este ángulo de forma automática. En esta segunda etapa se ordena a la platina realizar un desplazamiento en el eje X de una magnitud similar a la distancia entre los puntos de las esquinas, para llevar un punto de un lado al lado contrario de la imagen, tras lo cual se determina su nuevo centro de gravedad sobre la imagen de una sola banda. El ángulo α entre los ejes de la platina y los de la cámara puede ser calculado como el arco tangente de los desplazamientos ΔX y ΔY producidos. La Figura 4-27 muestra gráficamente el efecto producido al desplazar el blanco una cierta distancia hacia la derecha respecto a la situación de la Figura 4-26, así como el ángulo α determinado por los desplazamientos ΔX y ΔY del centro de gravedad del punto inferior derecho (correspondiente al anterior centro de gravedad 3). Esta operación debe realizarse cada vez que se monte o se altere la posición de la cámara, pero sólo es necesario hacerla con uno de los objetivos.
Figura 4-27. Calibración del ángulo de la cámara mediante el desplazamiento de los puntos del blanco (realización propia)
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Figura 4-28. Mosaico de imágenes antes (izda.) y después (centro) de la corrección del error de orientación cámara-platina. A la derecha, tras el redimensionamiento de las imágenes rotadas.
(realización propia)