Semantic Layer

2.3.1. Secuenciación de ADN

La secuenciación del ADN es la determinación del orden de los diferentes nucle- ótidos en un fragmento dado. Pongamos por caso que en Estados Unidos se encuen- tren unas mutaciones determinadas en un gen, las cuales provocan autismo. Podemos analizar esas mutaciones en concreto en nuestra población (para el diagnóstico por ejemplo), pero podría ocurrir que en nuestra población existieran unas mutaciones dife- rentes en el mismo gen que también fueran patogénicas. Para estar seguros de anali- zar de forma sistemática este gen, lo mejor es olvidarnos de buscar unas mutaciones en concreto y analizar el gen entero para detectar todas las posibles mutaciones. El méto- do más informativo y fiable para conocer un determinado gen o secuencia es realizar la secuenciación directa del mismo. Tradicionalmente se ha utilizado el método de ter- minación de la cadena (o método de Sanger). En este método, se produce la extensión del fragmento de ADN en su estado de cadena sencilla a partir de un oligonucleótido complementario a una zona del gen. Esta extensión de la cadena se produce gracias a la acción de una enzima (Taq polimerasa) en presencia de los cuatro trideoxinucle- ótidos (dNTPs). Recordemos; como en el caso de la PCR, salvo que en este caso no será un proceso cíclico. Además, mezclados entre ellos en una baja proporción existirán dideoxinucleotidos (ddNTPs) normalmente marcados radiactivamente, los cuales al añadirse a la cadena naciente terminaran la síntesis de las moléculas en las cuales se inserten, ya que bloquean la incorporación de nuevos nucleótidos. Por el contrario, cuando en una cadena de ADN se insertan únicamente dNTPs continuará alargándo- se sin problemas. Con este proceso obtendremos toda una serie de fragmentos de ADN de diferentes tamaños, dado que los ddNTPS se habrán incorporado en diferen- tes lugares. Esto ha de hacerse en cuatro tubos diferentes, uno por cada nucleótido, lo que nos dará información sobre en las posiciones en las cuales estaba presente ese

nucleótido determinado en la secuencia original. Para terminar de obtener esta infor- mación es necesario separar los fragmentos de ADN de los cuatro grupos en un gel de poliacrilamida en formato capilar (electroforesis capilar) y después visualizarlo. Explicamos este sistema por razones históricas ya que apenas se utiliza actualmente. Existe una variación de esta técnica, que es la que actualmente esta extendida ya que es más barata y sencilla, y de la cual exponemos un ejemplo de los resultados en la Figura 11. En este segundo método no es necesario utilizar cuatro reacciones por muestra, sino solamente una. Esto se consigue marcando los cuatro dideoxinucleó- tidos con un marcador fluorescente diferente, los cuales emiten fluorescencia a dife- rente longitud de onda. Sin embargo, en este caso la amplificación del ADN (PCR) se produce simultáneamente a la incorporación de los dideoxinucleótidos en cada ciclo de la reacción de PCR. De forma parecida al caso anterior es necesario separar los fragmentos mediante una electroforesis capilar. La visualización de los fragmentos se produce de forma automática mediante un láser que activa los fluoróforos y un sis- tema de recogida de los datos de fluorescencia. Con este sistema se puede analizar en una misma reacción alrededor de hasta unos 1000 pares de bases.

En el caso de que se pretenda secuenciar fragmentos de ARN, y debido a que la estabilidad de esta molécula es mucho menor que la del ADN, es preciso primero fabricar una hebra de ADN complementaria, Esto se consigue mediante una reacción en la que interviene la enzima transcriptasa inversa, la cual forma una secuencia monohebra de ADN complementaria a la de ARN (ADNc). Después de este paso se puede secuenciar tal y como se describe anteriormente.

Existen otros métodos para secuenciar el ADN, por ejemplo el de la pirosecuencia- ción. Esencialmente, e igual que en los casos anteriores, un oligonucleótido hace de ini- ciador para la fabricación de una nueva cadena de ADN. Los diferentes nucleótidos se van añadiendo secuencialmente de uno en uno, junto con una mezcla enzimática.

Figura 11. Secuencia de un fragmento del gen LRRK2, realizada mediante el método del termi- nador fluorescente. Los nucleótidos, marcados con cuatro posibles fluoróforos, hacen de termi- nador de la cadena de ADN que se va sintetizando, creando fragmentos de diferente tamaño que van siendo leído según avanzan el gel capilar, y son representados luego mediante cuatro colo- res diferentes. En el lugar donde indica la flecha hay una una guanina y una timina superpuestas en la misma posición (mutación G2019S del gen dardarin causante de la enfermedad de Parkinson).

Cada vez que un nucleótido es incorporado a la cadena naciente se originan una serie de reacciones enzimáticas que producen radiación luminosa. Una cámara recoge y cuantifica la cantidad de luz emitida, lo cual nos dirá si la incorporación de un nucleó- tido en esa posición del ADN ha tenido lugar o no. Después se degradan enzimática- mente los nucleótidos no incorporados o sobrantes y se hace un lavado para eluirlos (el ADN no se lava gracias a estar fijado previamente en una superficie). Ahora ya puede ser añadido el siguiente nucleótido junto con su mezcla enzimática y así sucesivamen- te. Todo este proceso es realizado de forma automática, llegando a poder ser secuencia- das en la misma reacción hasta unas 100 pares de bases. Sus aplicaciones también inclu- yen el genotipado de polimorfismos conocidos, cambios en la metilación del ADN y cuantificación alélica la cual permite detectar duplicaciones y deleciones génicas.

Existen otros métodos de análisis genético que son utilizados debido a su menor coste y facilidad de análisis que analizaremos en los siguientes apartados.

2.3.2. Análisis de conformación de cadena sencilla (SSCP)

La técnica de análisis de conformación de cadena sencilla (SSCP, o “single-strand conformation polymorphism”) se basa en los cambios de conformación tridimensional que presentan dos cadenas sencillas de ADN que difieren entre sí en un único nucle- ótido. Esos cambios de conformación se pueden poner de manifiesto en un gel de acri- lamida mediante la aparición de un patrón de bandas diferencial entre las muestras control y las muestras problema.

Figura 12. Los nucleótidos son añadidos secuencialmente uno por uno, y en orden G C T A, de forma que cuando aparece un pico de luz significa que se ha incorporado ese nucleótido a la cade- na naciente de ADN. En la tercera posición no aparece ninguna señal correspondiente a la timi- na debido a que en esa posición no hay una adenina en la cadena complementaria de ADN, sino una timina (ya que se ha incorporado una adenina que se ve en el tercer pico). El cuarto pico (des- pués de eluir la timina anterior) registra el doble de intensidad debido a que se han juntado las señales de dos guaninas sucesivas, y algo similar sucede con el quinto pico. Finalmente la secuen- cia será CCAGGCCT (Biotage).

Primero se amplifican mediante PCR los fragmentos del ADN a estudiar. Se ha de intentar que los fragmentos no sobrepasen los 200 bp, o en caso contrario se pierde sensibilidad para detectar las mutaciones. Los productos amplificados se desnatura- lizan mediante calor y en un medio con formamida, para analizarlo seguidamente en un gel de acrilamida junto con muestras de controles sanos y sin mutaciones. Al des- naturalizarse, el ADN monohebra adquiere una o varias conformaciones determina- das, que son la más estables termodinámicamente en las condiciones particulares en que se realiza el experimento. Una mutación puede alterar esta estructura, modifican- do la facilidad con la que se desplaza a lo largo del gel de electroforesis. La aparición de un patrón de bandas anómalo es indicativo de un posible cambio de nucleótido. Esto ha de ser confirmado posteriormente mediante secuenciación directa. El uso del SSCP proporciona una primera aproximación al análisis mutacional de forma rápida y barata.

Como hemos dicho, tiene algunas limitaciones de uso, ya que las condiciones de electroforesis (temperatura, composición del gel, concentración de tampón etc) deben ser determinadas empíricamente, y la sensibilidad nunca es del 100%. Cuanto mayor sea el fragmento a analizar menor será la sensibilidad (Ravnik-Glavac et al., 1994).

2.3.3. Análisis de heterodúplex

Este método es similar al anterior, salvo que en este caso después de desnaturali- zar las hebras de ADN dejaremos que se vaya enfriando poco a poco. De esta forma las monohebras de ADN volverán a renaturalizarse, con la particularidad de que algu- nas cadenas mutadas se habrán unido a otras no mutadas (heteroduplex), con lo que las dos cadenas serán homologas, excepto en un nucleótido. Esta discordancia de nucleótidos desapareados en este lugar puede crear una ligera alteración en la estruc- Figura 13. Determinación de un cambio nucleotídico de en un exon del gen tau mediante SSCP y posterior tinción argéntica. La primera muestra desde la izquierda presenta 2 bandas extra, com- paradas con las demás, debido a que un cambio nucleotídico altera el número de estados con- formacionales posibles de las monocadenas de ADN. La muestra en cuestión fue posteriormente secuenciada para determinar el cambio exacto de nucleótido y resultó ser la mutación patogéni- ca P301L del gen tau, la cual causa un tipo de demencia frontotemporal.

tura de la doble cadena de forma que tenga consecuencias en la movilidad electrofo- rética. (Ravnik-Glavac et al., 1994).

Hasta aquí se han descrito métodos para detectar mutaciones no conocidas. Cuando la mutación o polimorfismo ha sido ya caracterizado y se conoce su base mole- cular es posible diseñar estrategias diagnósticas basadas en la detección de esa secuen- cia mutada concreta, como las que se explican seguidamente.

El genotipado o especificación de un polimorfismo, se suele realizar utilizando méto- dos basados en diferentes principios: según el cambio en las propiedades físico-quí- micas del fragmento de ADN que origina ese cambio genético, mediante hibridación especifica de un fragmento e de ADN (u oligonucleótido) a cada alelo, o bien median- te reconocimiento enzimático de determinadas secuencias.

2.3.4. Determinación de polimorfismos mediante análisis de restricción (PCR-RFLP)

La técnica de la PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism) para la determinación de los genotipos de un polimorfismo se basa en la amplificación de un segmento de ADN y su exposición posterior a una enzima de restricción determinada. Una enzima de restricción (o endonucleasa de restricción) es una enzima que puede reconocer una secuencia determinada de nucleótidos den- tro de una molécula de ADN y cortarlo en un punto en concreto llamado sitio o diana de restricción, el cual depende de la enzima utilizada. Las enzimas de restric- Figura 14. Representación de las dos hebras de dos cadenas de un segmento de ADN donde esta presente un polimorfismo heterocigoto (marcado en gris). Inicialmente tendremos la situación de a), donde todas las bases están correctamente apareadas con su complementaria (homoduplex). Después de la desnaturalización de las dobles cadenas, y su posterior renaturalización al azar de las cadenas complementarias, la mitad de las moléculas estarán en estado de homoduplex (a) y la otra mitad en estado heteroduplex (b). En heteroduplex una de las bases no puede aparear correc- tamente con su complementaria creándose una ligera separación entre cadenas en este punto, la cual tendrá consecuencias en la movilidad electroforética que podremos observar.

ción reconocen secuencias entre 4 y 12 pares de bases. El corte del ADN se realiza rom- piendo 2 enlaces fosfato en la doble hebra, dando lugar a dos fragmentos, que pue- den ser romos o cohesivos. Estos últimos tienen tendencia a volver a hibridar de modo espontáneo ya que los extremos de un fragmento roto se pueden unir a los otros extremos coincidentes de otro fragmento roto mediante puentes de hidrógeno (como esta unión es muy débil se separarán al realizar una posterior electroforesis). Pero lo que de verdad nos interesa de sus propiedades es que mediante ellas se pueden dis- criminar mutaciones, ya que cambios de nucleótidos o pequeñas deleciones/insercio- nes pueden producir la pérdida de una diana o la aparición de una nueva diana donde antes de la mutación ésta no existía (Roberts 1981). Una vez realizada la digestión del ADN es necesario discriminar en que muestras se ha producido la rotura del frag- mento en cuestión, y en cuales no. Para ello se realiza una electroforesis y se visuali- za mediante posterior tinción (Figura 15).

Figura 15. Electroforesis en un gel de acrilamida de un producto de PCR después de su digestión con el enzima de restricción HinfI y visualizado mediante tinción argéntica.

Esta foto corresponde al polimorfismo descrito en el gen saitohin, el cual esta incluido en el haplo- tipo del gen tau que incrementa el riesgo de sufrir parálisis progresiva supranuclear y enfermedad de Parkinson (Ezquerra et al., 2004).

El fragmento de PCR original se corresponde con un tamaño de algo más de 700 bp. Cuando el alelo A esta presente en ambas cadenas de ADN el enzima corta en otras dos zonas de la secuencia produciendo tres fragmentos diferentes de 309, 242 y 194 bp. Cuando el alelo G esta presente en una de las cadenas aparece una banda extra de 97 bp, debido a que el fragmento de 194 bp se corta por la mitad. Si el alelo G esta presente en las dos cadenas el fragmento de 194 bp no se observa.

2.3.5. Amplificación múltiple (PCR Multiplex)

En algunos casos ocurren deleciones de algunos exones o de fragmentos grandes dentro de un gen. Para su detección se amplifican mediante PCR y de forma simul- tánea distintos fragmentos de diferentes genes en un solo tubo, utilizando parejas de cebadores u oligonucleótidos previamente optimizados para cada uno de los frag- mentos de ADN. El resultado de cada PCR múltiplex se analiza mediante electrofo- resis obteniéndose un patrón de bandas a partir del cual es posible inferir las regio- nes delecionadas. Es un método muy rápido y barato, pero limitado, en el sentido de que solo pueden detectarse mutaciones homocigotas. Es apropiado por ejemplo para la búsqueda de deleciones en el cromosoma Y (ya que hay un solo cromosoma). Para la detección de deleciones heterocigotas es necesario la utilización de otros métodos cuantitativos o semicuantitativos.

2.3.6. Amplificación múltiple dependiente de ligación de la sonda

Esta técnica es aplicable tanto al análisis de mutaciones puntuales o SNPs como a delecciones o inserciones grandes de fragmentos de ADN, y permite la realización de varias decenas de análisis genéticos o ensayos de una muestra y a la vez en un mismo tubo (Scarciolla et al., 2007). En esta técnica no es la muestra de ADN genómico la que se amplifica mediante PCR, sino los dos pares de sondas que se hibridan en el ADN. La amplificación específica de los pares de sondas dependerá de la presencia de las secuencias complementarias en el ADN. Para cada uno de los ensayos se diseñan dos oligonucleótidos, de forma que al hibridar sobre la secuencia de ADN diana pueden ser ligados enzimáticamente entre sí (ver Figura 16). Todos los pares de sondas tienen secuencias idénticas en los extremos 5’ y 3’ respectivamente, de esta forma es posi- ble la amplificación simultánea de todos los ensayos con un solo par de oligonucle- ótidos maestros. Uno de estos oligonucleotidos maestros estará marcado con un fluo- róforo.

Los fragmentos resultantes de las diferentes amplificaciones tendrán diferentes tama- ños (de 100 a 500 pares de bases aprox.), con lo cual se podrán distinguir separándo- los mediante una electroforesis, incluyendo un marcador de peso molecular y utili- zando los aparatos automáticos adecuados.

El área de los picos de cada uno de los fragmentos se mide automáticamente a par- tir de los datos de fluorescencia captados por el aparato de electroforesis. La norma- lización de los datos se puede realizar calculando el ratio del área de cada fragmento con la suma de la señal de los demás fragmentos. De esta forma estamos haciendo una cuantificación relativa de cada ensayo, y podremos testar la posible presencia de dele- ciones o duplicaciones génicas (Figura 17).

Figura 17. Resultado de la amplificación múltiple dependiente de ligación de la sonda en una mues- tra de ADN de un enfermo de Parkinson A) y de un control sano B). En este caso analizamos exones de diferentes genes relevantes en la enfermedad de Parkinson utilizando el kit SALSA MLPA KIT P051 / P052B Parkinson (MRC Holland). Cada uno de los picos corresponde a un fragmento de ADN amplificado y que puede cuantificarse mediante la medida de su área relativa respecto a la media de los otros picos. Una pérdida de señal del 50% correspondería a una delecion de una de las cade- nas de ADN. La picos en los cuales se observa esta reducción relativa comparado con el control están señalados mediante flechas. Éstos, corresponden a los exones 3,4,5 y 6 del gen Parkin. Figura 16. Esquema del funcionamiento de la amplificación múltiple dependiente de ligación de la sonda para detectar un polimorfismo tipo SNP. A) Para cada SNP están presentes tres sondas diferentes de ADN que hibridan con la secuencia diana de ADN del paciente, con la salvedad que dos de ellas son especificas de alelo (A o C en la última posición) B) Una u otra sonda se hibridan sobre el ADN depen- diendo del polimorfismo presente en cada cadena y una ligasa une ambas sondas C) Cada una de las sondas de cada ensayo tiene una secuencia común X e Y respectivamente en los extremos 5’ y 3’, que es utilizada de molde para amplificación mediante PCR utilizando los oligonucleotidos F y R. Finalmente obtendremos dos diferentes tamaños (en este caso) que serían visualizados en un gel de acrilamida y que serán indicativos del polimorfismo presente en la muestra.

Además, también es posible identificar SNPs utilizando dos sondas que solo difieren entre sí en el último nucleótido de las mismas, en la posición donde supuestamente esta el polimorfismo. Como para que haya amplificación mediante PCR es necesario que haya una previa ligación de los extremos de las sondas es necesario que ambas son- das hibriden con el ADN muestra particularmente en esa posición. Así, para un hetero- cigoto, una sonda amplificará uno de los alelos del polimorfismo mientras que la otra sonda solo amplificará el otro alelo.

2.3.7. Determinación de polimorfismos microsatélites

Los polimorfismos microsatélites (o STRs, acrónimo de Short Tandem Repeats) están compuestos por secuencias básicas de 2-4 nucleótidos, cuya repetición en tándem ori- gina frecuentemente secuencias de menos de 150 nucleótidos. Se estima que el geno- ma humano contiene unos 200.000 microsatélites, que se distribuyen más o menos homogéneamente, lo que junto con la propiedad de que son multialélicos, los hace idóneos para realizar estudios de análisis de ligamiento genético en familias. Las muta- ciones inestables son un tipo específico de microsatélites, y consisten en la “expansión” o el aumento de unidades de repetición de nucleótidos (especialmente CA y CAG). Se han identificado este tipo de repeticiones en varios genes humanos asociados a un núme- ro importante de patologías neurológicas (Como ejemplo, la enfermedad de Hungtinton). Estas repeticiones de tri o di nucleótidos se encuentran en personas sanas pero en un número menor que en los enfermos y pueden variar de número de una generación a otra, de ahí el nombre de mutaciones dinámicas. El número de repeticiones puede ir creciendo de una generación a otra hasta que sus efectos patogénicos se manifiestan. Además, la edad de inicio de la enfermedad y gravedad de la presentación clínica se suele correlacionar positivamente con el número de repeticiones.

Para determinar el número de repeticiones de los microsatélites se suele amplificar mediante PCR un fragmento de ADN que incluya al polimorfismo en cuestión, y con uno de los oligonucleótidos utilizados marcados con un fluoróforo tal y como en el caso