5. STATISTICAL CONSIDERATIONS 1 Study Overview
5.2. Statistical Issues Related to Non-randomized Assignment
Comunidad de Madrid
En este estudio, el tamaño muestral se determinó con el fin de estimar la seroprevalencia individual de fiebre Q en el ganado bovino de la Comunidad de Madrid, para lo que se empleó la fórmula para estimación de prevalencias n = (Z2 x P(1 - P))/e2, asumiendo una
seroprevalencia individual esperada del 12% (Muskens et al., 2011a) con un error admitido del ± 2% y un nivel de confianza del 95%. Así, se determinó que el número total de bovinos a muestrear era 1015, número que se incrementó hasta 1100 animales en previsión de posibles pérdidas durante el muestreo. Asimismo, teniendo en cuenta una seroprevalencia mínima de rebaño en rebaños infectados del 25% y una sensibilidad y especificidad diagnósticas aproximadas del test ELISA del 100%, se decidió dividir el número de muestras total en 10 por explotación, de modo que se alcanzara una sensibilidad de rebaño del 95% de acuerdo al método de Cameron y Baldock (Cameron y Baldock, 1998).
Por tanto, el número total de explotaciones que se muestrearon fueron 110 (10 animales por granja, 1100 animales testados en total).
Los rebaños a incluir en el estudio se seleccionaron mediante un muestreo aleatorio simple de entre las explotaciones muestreadas durante los meses de octubre y noviembre de 2009 dentro de la Campaña de erradicación de Brucelosis Bovina de dicho año. Asimismo, las muestras de suero de cada rebaño de cada una de las explotaciones
incluidas en el estudio fueron aleatoriamente seleccionadas de entre los todos los sueros bovinos de animales de más de 12 meses de edad recogidos dentro el marco del Programa Nacional de Erradicación de Brucelosis Bovina en 2009.
La toma de muestras de sangre, recogida de suero y conservación del mismo hasta su análisis se realizó de la misma forma descrita en el estudio 1 con la diferencia de que la extracción de sangre se realizó mediante punción en la vena coccígea, como es habitual en el bovino.
También de forma similar a lo descrito en el estudio 1, a partir del acceso al Registro General de Explotaciones Ganaderas (REGA) se recogió información epidemiológica referente a cada uno de los rebaños incluidos en estudio con el fin de poder evaluar la distribución espacial de los resultados serológicos y los factores de riesgo asociados a estos. Así, se recogió información sobre el censo, el tipo de producción (láctea, cárnica o de lidia), la delegación de origen y las coordenadas geográficas de cada rebaño. También se recogió información referente a las características individuales de los animales muestreados, incluyendo la edad, el género, la raza, el origen (nacido en la explotación o comprado) y el número de movimientos entre granjas que había realizado en individuo hasta el momento de la toma de muestras.
4.2.3. Estudio 3. Seroprevalencias, distribución y factores de riesgo
asociados a la exposición a C. burnetii en pequeños rumiantes de la
Comunidad de Madrid
En este estudio realizado sobre los pequeños rumiantes de la Comunidad de Madrid el tamaño muestral se estableció con el fin de determinar la prevalencia de rebaño de fiebre Q mediante la misma fórmula empleada en el segundo estudio para estimación de prevalencia, asumiendo una prevalencia de rebaño esperada del 25%, un error admitido del ± 6% (Guatteo et al., 2010) y un nivel de confianza del 95%. Así, se determinó que el número de explotaciones necesarias eran 150, número que se aumentó hasta 152 para compensar posibles pérdidas durante el estudio. El muestreo se estratificó por especie (ovino/caprino/rebaño mixto) de manera proporcional a la distribución de especies presentes en la Comunidad de Madrid, por lo que se escogieron 94 rebaños de ovejas, 18 de cabras y 40 mixtos, que se seleccionaron aleatoriamente a partir del listado total de explotaciones usando el generador de números aleatorios de Excel. Siete de las explotaciones (4,6%) tuvieron que excluirse del estudio por no poder localizarse muestras
de las mismas, por lo que la muestra final a analizar fue de 145 rebaños (90 rebaños de ovejas, 16 de cabras y 39 mixtos).
El número de animales a muestrear por explotación (n = 10) se calculó utilizando la aproximación descrita anteriormente (Cameron y Baldock, 1998) para garantizar una sensibilidad de rebaño no inferior al 75% (que llegaba al 85% en explotaciones de tamaño medio, 113 animales), asumiendo una sensibilidad y especificidad individual del test del 95% y 99% respectivamente (Kittelberger et al., 2009; Ruiz-Fons et al., 2010; Scolamacchia et al., 2010) La estimación fue realizada utilizando la misma calculadora
on-line citada para el estudio 1 (Cameron, 1999).
Las muestras de suero de cada rebaño incluido en el estudio fueron aleatoriamente seleccionadas mediante un muestreo sistemático de entre los todos los sueros de pequeños rumiantes recogidos en 2011 en cada una de las explotaciones seleccionadas, que fueron tomados dentro el marco del Programa Nacional de Erradicación de Brucelosis de los Pequeños Rumiantes de ese año.
De igual modo a lo descrito para el estudio anterior, con el fin de poder realizar posteriormente el análisis espacial y de factores de riesgo de los resultados serológicos obtenidos, se recogió información tanto de explotación [delegación de origen, coordenadas geográficas, tipo de explotación (carne, leche, mixta) y especies de animales presentes (ovejas, cabras o ambas)] como individual (raza, aptitud, y edad de los animales) a partir de la base de datos del REGA (Registro General de Explotaciones Ganaderas).
4.3.
ANÁLISIS DE LABORATORIO
Las muestras de suero de los tres estudios se analizaron mediante el empleo del mismo kit comercial de ELISA, el ID Screen® Q fever Indirect Multi-species, de la casa comercial
IDvet (Grabels, Francia), válido para el análisis de sueros bovinos, ovinos y caprinos y cuyos pocillos están tapizados con antígenos de fase I y II de una cepa de C. burnetii aislada a partir de un aborto ovino. El protocolo de trabajo empleado se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante como se describe a continuación:
Para llevar a cabo la prueba, tanto las muestras de suero como los reactivos del kit y las tiras con los pocillos tapizados se dejaban atemperar hasta alcanzar la temperatura ambiente del laboratorio y se homogeneizaban convenientemente antes de su empleo. Para dispensar los distintos reactivos, así como las muestras de suero se emplearon
micropipetas que cubrieran el rango de volúmenes necesario en cada caso, así como puntas desechables adaptadas a estas.
En primer lugar se dispensaban 90 microlitros del diluyente 2 del kit listo para su empleo en todos los pocillos a utilizar en la prueba.
A continuación, por cada placa ELISA se añadían diez microlitros del control negativo del kit a los dos pocillos elegidos para tal fin, y del mismo modo, diez microlitros del control positivo del kit a sus dos pocillos correspondientes. En el resto de pocillos de la placa se dispensaban diez microlitros de cada muestra de suero problema a analizar.
Las placas ELISA se incubaban durante 45 minutos (± cinco minutos) a la temperatura ambiente del laboratorio cubriendo las mismas con un papel adhesivo protector. El tiempo de incubación se controlaba mediante el empleo de un cronómetro. Durante esta incubación se produce la fijación de los anticuerpos específicos frente a C. burnetii presentes en la muestra problema (si esta es positiva) al antígeno que tapiza los pocillos. Durante el periodo de incubación se preparaba la solución de lavado necesaria para los siguientes pasos a su concentración de uso (1X) a partir de la solución de lavado concentrada (20X) que proporciona el kit, realizando la dilución correspondiente con agua destilada.
Tras la incubación se vaciaba el contenido de los pocillos desechándolo enérgicamente en la pila y se llevaba a cabo el lavado de los mismos con 300 microlitros de solución de lavado con el fin de retirar la parte de muestra no fijada y los restos de diluyente. El paso de lavado se repetía tres veces, retirando el exceso de solución de lavado en cada paso invirtiendo la placa y golpeando suavemente la misma sobre papel de filtro.
A continuación, se añadían a cada pocillo 100 microlitros de la solución de conjugado, reactivo que contiene anti-anticuerpos dirigidos frente a las inmunoglobulinas de rumiantes domésticos marcados con la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP), que se unen a los anticuerpos frente a C. burnetii procedentes de la muestra de suero problema en caso de que estén presentes en el pocillo, formando así los complejos antígeno-anticuerpo-conjugado. Justo antes de su empleo, el conjugado se preparaba a la concentración de uso (1X) a partir del conjugado concentrado que proporciona el kit (10X), realizando la dilución con el diluyente 3 también incluido en el kit. Una vez añadido el conjugado las placas se incubaban a temperatura ambiente durante 30 minutos (± tres minutos).
Tras el periodo de incubación se repetía el proceso de lavado descrito anteriormente. A continuación, se añadían 100 microlitros de la solución de sustrato lista para su uso proporcionada por el kit (preparado que contiene el sustrato de la enzima del conjugado) a cada pocillo y la placa se incubaba durante 15 minutos (± tres minutos). Dicha incubación se realizaba en completa oscuridad dada la fotosensibilidad del sustrato. En aquellos pocillos correspondientes con muestras de suero que presentasen anticuerpos frente a C. burnetii y por tanto en los que se habría formado los complejos antígeno- anticuerpo-conjugado, el sustrato reacciona con la enzima del conjugado, lo que da lugar al desarrollo de una reacción colorimétrica.
Tras los 15 minutos de incubación se añadían 100 microlitros de la solución de parada de la reacción enzimática proporcionada por el kit y lista para su uso (H2SO4 a una
concentración 0,5 molar).
Inmediatamente tras añadir la solución de parada se realizaba la lectura de las placas mediante el empleo de un espectrofotómetro a una longitud de onda de 450 nanómetros. La lectura se transfería a un ordenador en un archivo de formato Excel.
Para determinar si el ensayo se había validado correctamente en cada placa ELISA analizada debían cumplirse dos condiciones: i) que la densidad óptica (DO) media de los dos controles positivos fuese superior a 0,350 y ii) que el cociente entre la densidad óptica media de los dos controles positivos y los dos controles negativos fuese mayor de tres. Este test ELISA expresa el resultado de cada muestra como el porcentaje del valor de densidad óptica obtenido en los controles positivos ajustando a las lecturas de fondo. Así, para interpretar los resultados obtenidos, se aplicaba la siguiente fórmula a cada muestra:
%DO x100
La interpretación de los resultados según las instrucciones del fabricante indicaba que: - Las muestras con un %DO igual o inferior al 40% se consideran negativas. - Las muestras con %DO superior a 40% y menor o igual al 50% se consideran
dudosas.
- Las muestras con %DO superior a 50% y menor o igual a 80% se consideran positivas.
- Las muestras con %DO superior a 80% se consideran positivas fuertes.
En ninguno de los estudios se tuvo en cuenta la diferenciación entre resultados positivos y positivos fuertes, considerándose ambos tipos como resultados positivos. Con el fin de aplicar el criterio de interpretación más sensible posible, los animales cuyas muestras de suero presentaban un %DO dudoso según la interpretación del kit se consideraron como animales reactores en los tres estudios y el análisis de datos se realizó de acuerdo a esta interpretación. Además, en los estudios 2 y 3 se evaluó el impacto que podría tener el empleo del criterio conservador de interpretación de resultados (según el cual aquellas muestras dudosas de acuerdo a la interpretación del kit se considerarían negativas) en los resultados finales.