Una vez comprobada el aumento en la eficacia in vitro del tratamiento combinado, se procedió al diseño del ensayo in vivo em modelo de ratones xenoinjertados con tumores formados por células SW1222, GPA33+/CEA+. En este caso, las inmunotoxinas se administraron por vía intravenosa, en las mismas condiciones que las utilizadas para el ensayo con IMTXA33αS: 7 dosis cada 48 horas, 8 ratones por grupos, de los cuales la mitad se sacrificaron una vez finalizado el tratamiento (1º parada) y el resto se mantuvieron hasta 15 días más (2º parada), salvo que tuvieran que ser sacrificados previamente por excesivo crecimiento tumoral o aparición de lesiones que indicasen sufirmiento en los animales.
Al igual que se procedió en el ensayo in vitro, en las concentraciones que se utilizaron en este ensayo, la mitad de cada dosis correspondió a IMTXA33αS y la otra mitad a la IMTXCEAαS, de forma que la cantidad total de proteína inoculada fuera equivalente a la administrada en ensayos anteriores: 50 μg y 100 μg por dosis, respectivamente.
Tabla A1. Datos de IC50 de las inmunotoxinas basadas en α-Sarcina solas o combinadas frente a células
Una vez aclimatados los ratones a las jaulas, se siguió el protocolo descrito anteriormente, de la misma forma que en el ensayo anterior, tanto para la administración de las dosis como para el sacrificio de los animales. Tras la extracción de los tumores y su posterior análisis, se obtuvieron los resultados mostrados en la Figura A12. Estos resultados, si bien reflejan que la combinación de ambas inmunotoxinas provocó una inhibición significativa del crecimiento tumoral, no lo hizo de la forma esperada de acuerdo a los resultados observados en el ensayo de citotoxicidad in vitro. Los tumores extraídos al finalizar el tratamiento para el grupo combinado de 50 μg/ dosis son de mayor tamaño y peso que los tratados con 25 μg/dosis de IMTXA33αS sola. Para el grupo combinado de 100 μg/ dosis, sus valores sí fueron similares a los obtenidos con la cantidad equivalente de IMTXA33αS, pero sin que se observase un efecto sinérgico. Por otro lado, en los ratones que se mantuvieron en estudio una vez finalizado el tratamiento, se observó una recuperación del crecimiento de los tumores ligeramente más acusado que en los tratados con la inmunotoxina dirigida frente a GPA33.
Para continuar con el análisis de los efectos del tratamiento combinado, se llevaron a cabo los estudios de caracterización de los tumores mediante microscopía de fluorescencia, con el fin de estudiar si había cambios significativos que estuvieran relacionados con los datos obtenidos del crecimiento y peso de los tumores. Se siguió el protocolo utilizado en los
Figura A12. Gráfica de la evolución del crecimiento tumoral de células SW1222 en ratones xenoinjertados
del ensayo con IMTXA33αS intravenoso y el ensayo combinado de IMTXCEAαS e IMTXA33αS. A) Curvas del volumen del tumor a lo largo del tratamiento. Los círculos negros corresponden a los tratados con PBS (control), mientras que los círculos verdes (25 μg/dosis), azul (50 μg/ dosis) y rojos (100 μg/dosis) corresponden a los tratados con la inmunotoxina. Para el ensayo combinado, se marcan con línea discontinua azul los valores del grupo de 50 μg/ dosis y en línea discontinua roja para los de 100 μg/ dosis. B) Gráfico de barras que representa la media del volumen de los tumores de cada grupo tras el final del tratamiento (día 11). Las barras corresponden al grupo control (PBS, color negro), y en escala de grises, los tratados con la dosis de inmunotoxina correspondiente, de la IMTXA33αS sola (IMTX 25, 50 y 100) o la combinada con IMTXCEAαS (COMBI 50 y COMBI 100).
B)
A)
anteriores ensayos de tejido tumoral, para posteriormente comparar ambos tratamientos. En primer lugar, se estudió el efecto del tratamiento sobre los antígenos diana. El marcaje de GPA33 del tratamiento combinado se muestra en la Figura A13. Al igual que en el ensayo anterior, este se vio más disminuido cuanto mayor era la dosis administrada. Sin embargo, comparando los valores de la expresión del GPA33 de cada grupo con el de IMTXA33αS sola, estos fueron similares a los del de grupo inmediatamente inferior. Siendo coherente con la cantidad de IMTXA33αS presente en el grupo de 50 μg/ml del tratamiento combinado, que es la misma que la administrada en el grupo de 25 μg/ml de inmunotoxina sola. Observándose el mismo comportamiento para el grupo de 100 μg/ml del tratamiento combinado y el de 50 μg/ml con la inmunotoxina sola. Además, del mismo modo que en el ensayo anterior, la expresión antigénica no se recuperó tras la pausa posterior al tratamiento, frente al porcentaje de cercano al 100% del grupo control.
En cuanto a la detección de CEA en los tumores, en los resultados que se muestran en la Figura A14 se observó que la expresión de CEA disminuía de forma dosis dependiente, alcanzando un mínimo en torno al 20% de expresión, ligeramente inferior al observado para GPA33. Cuando se estudiaron las diferencias entre la expresión del CEA en los tumores sacrificados al final del tratamiento o tras los 15 días posteriores, se observó que la expresión del CEA se recuperaba con valores 2 veces más altos tras el parón del tratamiento. Estos datos sugieren que la expresión del CEA es mucho más variable que la
Figura A13. Imágenes de Inmunofluorescencia de células SW1222 procedente de los ratones
xenoinjertados del ensayo combinado para la expresión de GPA33. A) De izquierda a derecha, imágenes de la superposición del marcaje (núcleos, teñidos con DAPI, azul, con antiGPA33 y GAR 488, verde) de cada uno de los grupos ensayados: PBS (control), 50 μg/ dosis y 100 μg/dosis de inmunotoxinas. La fila superior corresponde a los tumores procedentes de la 1º parada y la fila inferior a los de la 2º parada. Se indica la escala de las fotos en la última imagen de cada fila. B) Análisis estadístico de cada marcaje con el programa IMAGE J, analizando tres imágenes de cada grupo ensayado. La gráfica corresponde a la cuantificación del área positiva para GPA33 de cada grupo, mostrando los de la 1º parada (círculos negros) y la 2º parada (cuadrados blancos).
del GPA33, además de ser más susceptible a la dosis de inmunotoxina recibida. Este hecho, junto con de la posibilidad de ser secretada en su forma libre al torrente sanguíneo podría explicar la disminución de la eficacia de los tratamientos dirigidos contra este antígeno.
De forma paralela a los ensayos anteriores, el efecto sobre la angiogénesis se estudió cuantificando el marcador CD 31. Los resultados mostrados en la Figura A15 fueron similares a los obtenidos para las mismas concentraciones de la inmunotoxina sola, sin encontrarse diferencias significativas. Del mismo modo, en los tumores de los ratones sacrificados en la segunda parada, al final del ensayo, se observó una recuperación en el número de vasos sanguíneos, doblando en número a los contabilizados en el grupo sacrificado al finalizar el tratamiento, para ambas concentraciones de proteína. Estos datos sugieren que el tratamiento combinado no potenciaría un mayor efecto antiangiongénico, al observado con las inmunotoxinas solas.
Figura A14. Imágenes de Inmunofluorescencia de células SW1222 procedente de los ratones xenoinjertados
del ensayo combinado para la expresión de CD31. A) De izquierda a derecha, imágenes de la superposición del marcaje (núcleos, teñidos con DAPI, azul, con anti-CD31 y DAM 647, rojo) de cada uno de los grupos ensayados: PBS (control), 50 μg/ dosis y 100 μg/dosis de inmunotoxina La fila superior corresponde a los tumores procedentes de la 1º parada y la fila inferior a los de la 2º parada. Se indica la escala de las fotos en la última imagen de cada fila. B) Análisis estadístico de cada marcaje con el programa IMAGE J, analizando tres imágenes de cada grupo ensayado. La gráfica corresponde al contaje de los vasos CD31 positivos de cada grupo, mostrando los de la 1º parada (círculos negros) y la 2º parada (cuadrados blancos).
Figura A15. Imágenes de Inmunofluorescencia de células SW1222 procedente de los ratones xenoinjertados
del ensayo combinado para la expresión de CD31. A) De izquierda a derecha, imágenes de la superposición del marcaje (núcleos, teñidos con DAPI, azul, con anti-CD31 y DAM 647, rojo) de cada uno de los grupos ensayados: PBS (control), 50 μg/ dosis y 100 μg/dosis de inmunotoxina La fila superior corresponde a los tumores procedentes de la 1º parada y la fila inferior a los de la 2º parada. Se indica la escala de las fotos en la última imagen de cada fila. B) Análisis estadístico de cada marcaje con el programa IMAGE J, analizando tres imágenes de cada grupo ensayado. La gráfica corresponde al contaje de los vasos CD31 positivos de cada grupo, mostrando los de la 1º parada (círculos negros) y la 2º parada (cuadrados blancos).
Figura A16. Imágenes de Inmunofluorescencia de células SW1222 procedente de los ratones xenoinjertados
del ensayo con IMTXA33αS intravenoso para la expresión de Ki67. A) De izquierda a derecha, imágenes de la superposición del marcaje (núcleos, teñidos con DAPI, azul, con anti-Ki67 y GAR 488, verde) de cada uno de los grupos ensayados: PBS (control), 50 μg/ dosis y 100 μg/dosis de inmunotoxina La fila superior corresponde a los tumores procedentes de la 1º parada y la fila inferior a los de la 2º parada. Se indica la escala de las fotos en la última imagen de cada fila. B) Análisis estadístico de cada marcaje con el programa IMAGE J, analizando tres imágenes de cada grupo ensayado. La gráfica corresponde al contaje de las células KI67 positivas de cada grupo, mostrando los de la 1º parada (círculos negros) y la 2º parada (cuadrados blancos).
Finalmente, se analizó la capacidad proliferativa del tumor estudiando la expresión de Ki67 tras el tratamiento combinado. En las imágenes de la Figura A16 se observa que la capacidad proliferativa de las células SW1222 se vio siginificativamente disminuida, en modo similar a lo observado con la IMTXA33αS sola. Al igual que en ese caso, los tumores de los ratones que se mantuvieron una vez finalizado el tratamiento mostraron un incremento en su capacidad proliferativa, entre un 50 y 100%, respecto al valor observado con el primer grupo. Nuevamente, no se observó una mejoría en este aspecto respecto a los resultados obtenidos con el tratamiento únicamente con IMTXA33αS.
A la vista de los resultados obtenidos tras el estudio de la evolución tumoral y la expresión antigénica, los datos no mostraron una diferencia significativa entre la aplicación combinada de IMTXA33αS e IMTXCEAαS con respecto al tratamiento con las inmunotoxinas solas, a diferencia de lo observado en el ensayo in vitro. Si bien se confirmó el potente efecto antitumoral de estas inmunotoxinas, no se observó el efecto sinérgico esperado, posiblemente debido a aspectos relacionados con la secreción de CEA al torrente sanguíneo o con la biodistribución y vida media de las inmunotoxinas una vez inoculadas en el organismo del animal. Por tanto, es necesario plantear nuevos ensayos en esta línea.