The half-mode analysis of the squared transfer function

Las bacterias monitorean permanentemente las condiciones extracelulares y modifican su fisiología para adaptarse a cambios medioambientales. Esto es particularmente relevante en bacterias patógenas que han desarrollado evolutivamente la capacidad de colonizar, proliferar y diseminarse en diferentes nichos del organismo hospedador, ya que la regulación de la expresión génica en respuesta a condiciones ambientales o de estrés tiene un rol crítico en la habilidad del patógeno para causar enfermedad. En eubacterias, uno de los mecanismos adaptativos más eficientes y ubicuos está constituido por sistemas de transducción de señales, predominando los “sistemas regulatorios de dos componentes” (TCS, del inglés two-component system). Están presentes tanto en bacterias gram-positivas como gram-negativas, y se estima que las bacterias entéricas albergan alrededor de 50 TCS diferentes que median la respuesta a una variedad de señales (109, 110).

Los TCS clásicos están compuestos básicamente por una proteína histidina quinasa sensora de membrana (HQ) y un regulador de respuesta citosólico (RR), ensamblados de acuerdo a un diseño en módulos. Una proteína sensora típica consiste en un dominio sensor N- terminal variable conectado al dominio C-terminal conservado que cataliza la fosforilación. Por su parte, una proteína reguladora de respuesta típica consiste en un dominio receptor conservado N-terminal y un dominio regulador C-terminal variable. Ante la presencia de un estímulo ambiental detectado por el dominio sensor, se induce la autofosforilación de un residuo de histidina conservado en el dominio catalítico de la HQ. Posteriormente, este grupo fosfato es transferido al dominio receptor de RR, ocasionando un cambio conformacional que lleva a la activación del dominio regulador del mismo. El regulador de respuesta activado tiene mayor afinidad por el ADN y funciona como modulador transcripcional. La posterior hidrólisis del grupo fosfato reinicia el sistema y le permite responder a nuevos estímulos (109, 110).

Además de los TCS clásicos, existen también sistemas no ortodoxos, comúnmente denominados de fosfotransferencia o phosphorelay. En estos sistemas, el grupo fosfato es transferido alternando entre varios residuos de histidina y aspartato presentes en dominios que pueden estar en proteínas individuales o formando parte de proteínas multidominios. La mayoría de estos sistemas posee histidina quinasas híbridas, las cuales se autofosforilan y transfieren el fosfato a un residuo de aspartato en un dominio receptor interno, en lugar de transferirlo a una proteína separada. Luego, el fosfato es subsecuentemente transferido a una

Introducción general

26 proteína histidina fosfotransferasa (HPt), que posee el residuo de histidina fosforilable pero carece de actividad autocatalítica, por lo que sólo sirve como intermediario en estas vías. Finalmente, el fosfato es transferido al RR. Se desconoce por qué algunos sistemas de transducción de señales usan fosfotransferencias simples y otros, pasos múltiples. Una posibilidad es que los pasos intermediarios del phosphorelay proporcionen puntos adicionales para la regulación de la vía en función de diversos estímulos ambientales y, como consecuencia, diferentes señales podrían definir la respuesta regulatoria (109, 110).

La gran mayoría de los RR son activos cuando están fosforilados (111), por lo tanto cualquier condición que afecte su estado de fosforilación impactará en su habilidad de ejercer su función biológica. En consecuencia, la respuesta del TCS no solo depende de la presencia de señales específicas detectadas por la HQ, sino también de otras proteínas que estimulen o inhiban la fosforilación del RR. Tales proteínas pueden tener como blanco cualquiera de los pasos que llevan a la fosforilación del RR, tales como la autofosforilación de la HQ, la fosfotransferencia al RR, la defosforilación del RR fosforilado y la actividad del dominio regulador del mismo. A su vez, los RRs pueden poseer una actividad autofosfatasa que limita el tiempo de vida de su estado fosforilado. En algunos sistemas, existen fosfatasas auxiliares o proteínas que refuerzan la actividad fosfatasa del RR, acelerando su defosforilación. Muchas HQs, además de la actividad de fosfotransferencia, también poseen actividad fosfatasa (112). I.3.1. Sistema RcsCDB

El sistema de fosfotransferencia Rcs (del inglés regulation of capsular synthesis), se descubrió como regulador positivo del operón cps, que codifica para las enzimas que intervienen en la síntesis de la cápsula de ácido colánico en E. coli. Los genes del sistema Rcs están codificados en una misma región del genoma y ocupan un mismo locus génico. Hasta el presente, homólogos a los genes rcs se han hallado exclusivamente en la familia Enterobacteriaceae (113, 114). Este sistema es una compleja ruta de señalización compuesta por tres proteínas separadas. La proteína sensora RcsC, es una quinasa híbrida que contiene el dominio transmisor H1 y el dominio receptor D1, RcsD, que contiene el dominio de fosfotransferencia HPt, y el regulador de respuesta RcsB, que presenta un dominio receptor conservado D2. RcsC y RcsD son proteínas transmembranas ancladas a la membrana interna bacteriana, mientras que RcsB es de localización citoplasmática (Figura I.3). Luego que RcsC detecta una determinada señal, se fosforila el residuo conservado de histidina presente en el dominio H1 por medio de un evento de autofosforilación. El grupo fosfato es transferido al residuo de aspartato del dominio D1, posteriormente, al residuo de histidina en el dominio HPt de RcsD, y finalmente al aspartato del dominio D2 de RcsB (Figura I.3). El regulador RcsB fosforilado, es capaz de regular la transcripción de sus genes blanco. Adicionalmente, el sistema Rcs interacciona con proteínas auxiliares: RcsA, una proteína de unión al ADN que actúa como co-regulador de RcsB para el control de un subconjunto de genes del regulón, y la

Introducción general

27 proteasa Lon, que regula la estabilidad de RcsA. Por otro lado, RcsF es una lipoproteína de membrana externa que canaliza ciertas señales a RcsC y la proteína IgaA (localizada en la membrana interna) actúa como inhibidor de RcsC (Figura I.3). (113–116). La proteína RcsB, puede ejercer su función reguladora uniéndose a las secuencias promotoras de los genes blanco en formando homodímeros o heterodímeros, con proteínas reguladoras auxiliares, como ser RcsA, GadE, BglJ, entre otras (113, 114). Esta complejidad permite que RcsB regule más de 600 genes en respuesta a diferentes señales de estrés.

Figura I.3. Esquema del sistema de fosfotransferencia Rcs. Las flechas curvas indican la transferencia del grupo fosfato desde el dominio H1 de la quinasa RcsC, involucrando el dominio HPt de la proteína RcsD, al dominio receptor D2 del regulador de respuesta RcsB. RcsB en su estado fosforilado modula la expresión de sus genes blanco ya sea en forma de homodímero o heterodimero. Adaptado de Cho y colaboradores, 2014 (117).

Las condiciones activadoras del sistema Rcs descriptas hasta el momento son muy heterogéneas. Por ejemplo, se observó que la sobreexpresión de DjlA, una proteína chaperona localizada en la membrana lleva a la activación del sistema Rcs, como así también las deleciones o mutaciones de los genes dsbA, mdoH y del locus rfa. DsbA está implicada en el correcto plegamiento de proteínas periplasmáticas, MdoH produce oligosacáridos derivados de membrana y el locus rfa es necesario para la biosíntesis del LPS (118–120). Además, se observó que numerosas condiciones de crecimiento también inducen el sistema Rcs: shock osmótico, shock ácido, contacto con superficie sólida, desecación, tratamiento con péptidos catiónicos antimicrobianos y β-lactámicos (121–124). Ya sea por mutaciones o condiciones fisiológicas, las condiciones activadoras identificadas pueden ser vinculadas con perturbaciones en la envoltura celular, sugiriendo que este sistema podría acoplar señales ambientales con el remodelamiento de la superficie celular (114). En nuestro laboratorio, se

Introducción general

28 reportó que mutaciones en la vía que codifica para las enzimas implicadas en la síntesis del ECA (del inglés enterobacterial common antigen) son señales inductoras del sistema Rcs en S. marcescens (38).

El sistema Rcs regula predominantemente genes involucrados en la producción de importantes estructuras asociadas a la superficie celular (flagelo, LPS, fimbrias), exopolisacáridos capsulares y proteínas involucradas en el mantenimiento y/o modificación de la superficie celular (114). Además de la síntesis de ácido colánico en E. coli, el sistema Rcs regula también la producción de cápsula en Salmonella y Erwinia amylovoran. En Salmonella regula la expresión del gen ugd, el cual es requerido para la modificación del lípido A del LPS, necesaria para promover resistencia a péptidos catiónicos antimicrobianos (125). El sistema Rcs es un regulador clave de la motilidad y se demostró que en E. coli, Proteus mirabilis y Salmonella enterica reprime la transcripción del operón flhDC que codifica para el regulador maestro del flagelo, bloqueando la biosíntesis flagelar (126–128). En nuestro laboratorio se determinó que, en S. marcescens, el sistema Rcs regula la motilidad y la secreción de fosfolipasa PhlA, ya que en su estado activo reprime transcripcionalmente la expresión del regulón flagelar (38). También se demostró que RcsB regula de forma negativa y directa la expresión del operón shlBA y, por lo tanto, la actividad hemolítica (21) y que está implicado en la regulación de la producción de OMVs (del inglés outer-membrane vesicles) (129).