En general, las proteínas interactúan con las membranas de tres maneras distintas. Pueden estar asociadas a las membranas de forma integral (proteínas transmembrana), unidas covalentemente a un lípido, o de forma periférica a través de interacciones iónicas u otras no covalentes débiles. En general, las proteínas periféricas pueden ser removidas de la membrana con soluciones de gran fuerza iónica (soluciones salinas concentradas), que rompen los enlaces iónicos. A diferencia de las proteínas integrales, la mayoría de las proteínas periféricas son solubles en soluciones acuosas y no requieren disolución con detergentes, como sí lo requieren las proteínas integrales.
Con el objeto de estudiar la naturaleza de la asociación de vinculina a la membrana, se realizaron ensayos bioquímicos de extracción de proteínas con soluciones de fuerza iónica creciente, y de pH alcalino, y ensayos de partición con Tritón X-114. Se utilizó como material de estudio la fracción microsomal aislada de cortes de papila renal según se detalla en la sección de materiales y métodos. Se incubó esta fracción con PBS, soluciones de alto contenido salino (1.0 – 3.0 M KCl) o pH elevado (0.5 y 0.1 M Na2CO3 pH 10), y por ultracentrifugación
Resultados
53 se obtuvo un pellet, donde se ubican las proteínas resistentes a la extracción, y un sobrenadante, que contiene las proteínas sensibles a la extracción. La presencia de vinculina se analizó por Western Blot. En la Figura 22A se muestran los resultados del tratamiento de la fracción microsomal con soluciones alcalinas de KCl. Se observa la banda correspondiente a vinculina en el pellet (P) y en el sobrenadante (S) de las muestras tratadas con PBS (control). Pero se observa en el sobrenadante, que a mayor fuerza iónica, es mayor la cantidad de vinculina extraída de la membrana de las vesículas, hecho que se ve reflejado por la intensidad creciente de las bandas. Se obtuvo un resultado similar cuando se sometió a las muestras a concentraciones crecientes de Na2CO3. Se observa que una concentración baja como de 0.5 M resultó ser suficiente para provocar la liberación de vinculina de la membrana (Figura 22B). Estos resultados reflejan el efecto del cambio de pH en la desestabilización de las uniones electrostáticas entre las proteínas y las membranas. La gran sensibilidad a la acción de soluciones de alta fuerza iónica y a cambios de pH sugiere que el tipo de asociación de la vinculina con la membrana de las vesículas es de tipo electrostática.
Figura 22- Características de la asociación de vinculina a la membrana de las vesículas. En (A) se
muestra la extracción con soluciones de alta fuerza iónica y en (B) con pH alcalino de la fracción microsomal obtenida según el protocolo explicado en el capítulo de materiales y métodos. La presencia de vinculina fue analizada mediante Western Blot. Los resultados corresponden a uno de tres experimentos independientes. (P) pellet, (S) sobrenadante. Se muestran diferentes partes de la misma membrana.
Para completar el estudio de la naturaleza de la asociación de vinculina a la membrana de las vesículas se aplicó un ensayo de partición de fases con Tritón X-114 [163]. Las soluciones de Tritón X-114 son homogéneas a 0ºC y se separan en dos fases (una acuosa y una detergente) por encina de 20ºC (Cloudy point precipitation). Las proteínas periféricas hidrosolubles se ubican en la fase acuosa, y las proteínas integrales anfipáticas, en la fase detergente. Se utilizó como material de estudio la fracción microsomal aislada de cortes de papila renal según se detalla en la sección de materiales y métodos. Como control positivo de proteína integral de membrana se usó el receptor de transferrina (RTf). La presencia de vinculina y de RTf se analizó por Western Blot. Los resultados indican que la vinculina se ubica exclusivamente en la
Resultados
54 fase acuosa, mientras que su presencia en la fase de detergente fue casi indetectable. Contrariamente, la señal de RTf que se detecta en la fase detergente es mucho mayor a la presente en la fase acuosa (Figura 23).
Figura 23- Ensayo de partición de fases con Tritón X-114. Se muestra el resultado del ensayo de partición
de fases con Tritón X-114 de la fracción microsomal (M). Se analizaron volúmenes iguales de la fase acuosa (Aq) y de la fase detergente (Det) para detectar vinculina y el receptor de transferrina (RTf). Los resultados corresponden a uno de tres experimentos independientes.
3.5- Caracterización bioquímica de las vesículas que contienen vinculina
3.5-a) Análisis de la presencia de marcadores del compartimento endosomal de reciclaje
Como se ha mencionado, la BK ejerce un efecto modulatorio sobre los contactos focales (CF) de células del túbulo colector de la papila renal, movilizando vinculina por un mecanismo que involucra la hidrólisis de PIP2 por activación de la PLC [75]. Este proceso ocurre con la aparición simultánea en el citosol de vesículas que contienen vinculina, PIP2 y el receptor de transferrina (RTf) [146]. Las Rab GTPasas se asocian específicamente con ciertas organelas. Rab 5 está presente en los endosomas tempranos [139, 143], y Rab 11 en el compartimiento de reciclaje [136, 139]. Puesto que después de la internalización, el RTf pasa por los endosomas tempranos y de reciclaje [174], ambas moléculas son usadas con frecuencia como herramientas para visualizar este compartimiento.
En una primera etapa realizamos Western Blots para analizar la presencia de proteínas involucradas en el tráfico vesicular, en las vesículas aisladas mediante el método inmunomagnético. Teniendo en cuenta que se ha descripto la participación de Rab 11 en el reciclaje de transferrina [175], y que Rab 5 se localiza en los endosomas tempranos, se estudió si Rab 5 y Rab 11 coprecipitan con vinculina durante el inmunoaislamiento.
Es sabido que los fosfoinosítidos cumplen un rol importante en la definición de la identidad de las membranas [175], y que el PIP2 es una molécula esencial para que vinculina participe en la formación de los CF [58]. Además, trabajos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que en las células del túbulo colector de la papila renal, la disminución de la producción de PIP2 altera el reclutamiento de vinculina hacia los CF [113, 114]. Por lo tanto, utilizando un
Resultados
55 anticuerpo específico dirigido contra PIP2 se evaluó la presencia del fosfoinosítido en las vesículas inmunoaisladas. Como control negativo (C) se utilizaron esferas no recubiertas con el anticuerpo anti-vinculina. Se comprobó que además del RTf, las vesículas contienen Rab 5 y Rab 11 (Figura 24). Estos resultados sugieren que las vesículas que transportan vinculina forman parte del compartimiento endosomal de reciclaje. También se observó una banda de ~116 kDa, que corresponde a PIP2 unido a vinculina. No se detectó señal positiva en el control negativo de las muestras analizadas (Figura 24).
Figura 24- Análisis bioquímico de las vesículas. Las vesículas unidas a las esferas magnéticas (Bound: B)
se analizaron mediante Western Blot. Las membranas se incubaron con anticuerpos dirigidos contra las proteínas indicadas. Como control negativo (C) se usaron esferas magnéticas donde se omitió el anticuerpo anti-vinculina.
3.5-b) Análisis de la presencia de proteínas de los contactos focales en las vesículas aisladas
Como se describió en los antecedentes que dieron lugar al desarrollo de este trabajo de tesis, en las células de túbulo colector de papila renal, la vinculina se asocia a talina en los CF que se localizan en los microdominios DRM de membrana [113, 114], y después del tratamiento con BK, mientras que la vinculina se disipa de los CF, la talina permanece asociada a la membrana plasmática [75]. También se ha descripto que este proceso ocurre con la aparición simultánea en el citosol de vesículas que contienen vinculina, PIP2, el receptor de transferrina, y proteínas que participan en la vía endosomal de reciclaje, Rab 5 y Rab 11. Por lo tanto, es de esperar que la molécula de talina no se halle presente en las vesículas que contienen vinculina. Otra proteína que cumple un rol importante y forma parte de los CF es paxilina [176]. Con el fin de investigar si las vesículas contienen talina y paxilina, se aislaron por el método inmunomagnético vesículas conteniendo vinculina, utilizando como material de partida el sobrenadante posnuclear (SPN) según el protocolo explicado en la sección de materiales y métodos. Como control positivo de la presencia de ambas proteínas se utilizó la fracción microsomal. En el Western Blot se sembró una alícuota de la fracción unida (que contiene las vesículas) y no unida que se obtienen al aplicar el protocolo de inmunoaislamiento. Como se
Resultados
56 observa en la fracción de vesículas unida, no se obtuvo señal positiva para ninguna de las proteínas (Figura 25). Para corroborar este resultado, se duplicó la cantidad de proteínas sembradas de la fracción de vesículas, obteniendo similar resultado. En el caso de la fracción no unida, la falta de señal positiva para talina y paxilina no se debió a una dilución de las mismas en el volumen de muestra analizado, dado que si se pudo detectar la presencia de vinculina en las mismas condiciones experimentales (Figura 19A). Es probable que la señal negativa se deba al hecho de que cuando talina y paxilina se encuentran libres en el citosol, son rápidamente degradas por la enzima calpaína [177] y por esta razón no pudieron ser detectadas en el Western Blot.
Figura 25- Análisis de la presencia de talina y paxilina en las vesículas que contienen vinculina. Como
material de partida para el inmunoaislamiento de las vesículas se utilizaron 200 µg de proteínas del sobrenadante postnuclear (SPN). Como control positivo se sembraron alícuotas de la fracción microsomal (M) y del SPN que se utilizó como material de partida para el aislamiento de las vesículas, de la fracción de vesículas unida a las esferas magnéticas (B), y de la fracción no unida (NB). Se muestra un Western Blot representativo de tres experimentos independientes.
En resumen, la presencia en las vesículas de señales positivas para el RTf, Rab 5 y Rab 11, al igual que para PIP2 asociado a vinculina, sugiere que en el proceso de internalización de vinculina, inducida por la acción de BK, participan los endosomas tempranos, que contienen Rab 5, y el compartimiento de reciclaje endosomal, que contiene Rab 11 y el RTf. La ausencia en las vesículas, tanto de talina como de paxilina, se corresponde con la selectividad de BK de inducir la movilización de vinculina, y no del resto de las proteínas del CF.
3.5 -c) Caracterización de las vesículas mediante espectrometría de masa
Para realizar una caracterización más detallada del contenido de las vesículas, se implementó una estrategia experimental para aislar una cantidad de vesículas adecuada para ser analizada mediante espectrometría de masa. Para ello, partiendo de cortes de papila renal previamente incubados con BK, se aplicó un protocolo de centrifugación diferencial, del cual se obtuvo una
Resultados
57 fracción de membranas de alta densidad (High Density-HD), y una fracción de membranas de baja densidad (Low Density-LD). De acuerdo a la literatura, esta última fracción es libre de membrana plasmática [178]. Para el inmunoaislamiento de vesículas se utilizó como material de partida la fracción de membranas de baja densidad (Low Density-LD). En la Figura 26A se muestra un gel de electroforesis de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS- PAGE) donde se observa el perfil proteico de las diferentes fracciones de membrana obtenidas luego de aplicar el protocolo de centrifugación diferencial explicado en el capítulo de materiales y métodos. Para corroborar la especificidad del aislamiento de las vesículas que contienen vinculina, se analizó mediante Western Blot la presencia de vinculina en alícuotas del sobrenadante de la centrifugación que se realizó a 4000 g por 10 minutos (SN), de las fracciones de alta densidad (HD) y baja densidad (LD), y de las vesículas inmunoaisladas a partir de LD. Se observó una banda positiva para vinculina no solo en las vesículas aisladas, sino también en las fracciones SN, HD y LD, pero con diferente intensidad (Figura 26B). La señal positiva de la fracción HD podría corresponder a vinculina asociada a la membrana plasmática presente en la fracción microsomal, mientras que en la fracción LD representaría a la vinculina asociada a las vesículas.
Figura 26- Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western Blot mostrando las diferentes fracciones obtenidas a partir de la centrifugación diferencial. A) Muestras de sobrenadante (SN) obtenida de la
centrifugación a 4000 g durante 10 minutos; fracción de alta densidad (HD) y baja densidad (LD) obtenidas como se describió en la sección de materiales y métodos. Se sembraron igual cantidad de proteínas totales (50 µg) de cada muestra en geles de SDS-PAGE del 10% y se colorearon con Coomassie blue. B) Análisis de la presencia de vinculina en muestras SN, HD, LD y vesículas aisladas de la fracción LD. Se sembraron cantidades iguales de proteínas (40 µg). Las bandas indicadas con asteriscos corresponden a las cadenas de IgG pesada (55 kDa) y liviana (25 kDa). Se muestra una membrana representativa.
Con el fin de analizar a las proteínas asociadas a las vesículas por espectrometría de masa, las mismas fueron aisladas a partir de la fracción LD y posteriormente sometidas a electroforesis (SDS-PAGE) (Figura 27). Las bandas de color con un peso molecular ≥ 40 kDa fueron cortadas en bloques, y luego cada bloque fue sometido a un proceso de tripsinización en el propio gel y
Resultados
58 posterior elusión de los péptidos resultantes. Los péptidos de cada fragmento del gel fueron estudiados mediante espectrometría de masa. Las proteínas fueron identificadas mediante comparación con la base de datos SwissProt utilizando el software BioWorks, versión 3.1. En la Tabla 1 se muestra la lista de proteínas con un peso molecular ≥ 40 kDa, que fueron identificadas a partir de dos o más componentes peptídicos o un péptido y la inspección manual del espectro. Se pudo identificar en las vesículas la presencia de proteínas que participan en el tráfico vesicular como así también proteínas del citoesqueleto, como actina, y varias proteínas relacionadas con actina (α-actinina-4), proteínas motoras de actina (miosina-9) y proteínas de los microtúbulos. Además, las vesículas también contienen proteínas residentes del retículo endoplasmático, consistente con la presencia de vinculina en el retículo endoplásmico rugoso donde se sintetiza. También se detectó la presencia de varias proteínas mitocondriales (sub- unidades alfa y beta de la ATP-sintasa), y proteínas inespecíficas (proteínas heat-shock y albúmina sérica). Probablemente estas últimas solo se asocian a las membranas vesiculares por sus propiedades físico-químicas, pero no participan en el proceso de tráfico vesicular.
Del análisis de los resultados expuestos concluimos que las vesículas que contienen vinculina son heterogéneas e incluyen fragmentos del retículo endoplásmico rugoso.
Figura 27- Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para análisis de las vesículas a través de LC-MS/MS.
Las vesículas que contienen vinculina fueron aisladas utilizando el método inmunomagnético a partir de la fracción LD (1000 µg de proteínas). Las muestras fueron sometidas a SDS-PAGE en geles del 10% y coloreadas con Coomassie blue. Las bandas de color con un peso molecular ≥ 40 kDa (recuadro ro o) fueron cortadas en bloques para la trispsinización en gel y posterior análisis mediante LC-MS/MS.
Resultados
59 Tabla 1
Resumen de las proteínas identificadas que se asocian con las vesículas que contienen vinculina en células del túbulo colector de la papila renal. Las bandas de color con un peso molecular ≥ 40 kDa fueron cortadas en bloques, y luego cada bloque fue sometido a un proceso de tripsinización en el propio gel y posterior elusión de los péptidos resultantes. Los péptidos de cada fragmento del gel fueron estudiados mediante espectrometría de masa. Las proteínas fueron identificadas mediante comparación de dos o más componentes peptídicos o un péptido y la inspección manual del espectro utilizando la base de datos SwissProt y el software BioWorks, versión 3.1.
Proteínas en orden de peso molecular decreciente Miosina-9
Vinculina
Proteína Heat shock HSP 90-beta Proteína Heat shock HSP 90-alfa Gelsolina
Alfa-actinina-4
ATPasa transicional del retículo endoplasmático Calnexina
Albúmina sérica
Proteína Heat shock cognado 71 kDa Proteína Heat shock 70 kDa 1A/1B ATP-sintasa subunidad alfa, mitocondrial Tubulina Beta-cadena 4B
Tubulina Alfa-cadena 1B Ig Gamma-cadena 1-región C
ATP-sintasa subunidad beta, mitocondrial Tubulina Beta-cadena 5
Tubulina alfa-cadena 1A Actina, citoplasmática 1 Actina, citoplasmática 2
Resultados
60 4. ANÁLISIS DE LA DINÁMICA DE DISTRIBUCIÓN DE LAS VESÍCULAS QUE