La glucosa (azúcar reductor) es la fuente principal de carbono en los hidrolizados de cebada, disminuyendo con el tiempo de fermentación, como se observa en la Gráfica 6, evidenciando que las concentraciones de azúcares reductores obtenidas en el proceso de hidrólisis caen drásticamente hasta una concentración determinada para cada ensayo, especialmente en los tratamientos con las concentraciones de enzimas más altas. Este descenso o consumo de sustrato, es causado por que los azúcares disponibles en el medio son utilizados por la levadura como fuente de carbono. Se observa también, que el consumo de sustrato es proporcional a la concentración de azúcares reductores iníciales de la fermentación, entre mayor sea la fuente de carbono disponible, mayor será el consumo de sustrato por parte de la levadura. Demostrando que la variación observada a nivel de población de S. cerevisiae en los diferentes tratamientos con enzimas, se debe a la concentración de azúcares disponibles, valor que está directamente determinado por la concentración de enzimas presente en el medio.
El consumo de sustrato observado, demuestra que los azúcares reductores presentes en el hidrolizado son fácilmente metabolizados por la levadura, ya que,
Saccharomyces cerevisiae posee una baja batería enzimática, donde solo puede fermentar hexosas como: D-glucosa, D-fructosa y D-manosa, aunque no todas las utiliza a la misma velocidad (Tuite y Oliver, 1991), indicando también que el azúcar que posiblemente pueden estar presente en el hidrolizado es principalmente la glucosa, a demás de ser el monómero constituyente del almidón.
Gráfica 6. Relación entre la concentración de azúcares reductores inicial y final de la fermentación con S. cerevisiae en función de la concentración de enzimas, (C+)
control de comparación y (C-) control negativo.
En la Tabla 7, se observa que la variación entre los valores de la biomasa máxima obtenidos, no es tan grande como la del consumo de sustrato, en relación a la concentración de enzimas, por lo que se puede decir que la presencia de las enzimas influye en el aprovechamiento del sustrato para producir biomasa (Santander, 2006). Sin embargo, al comparar el tratamiento con 15 mL/L de enzimas, y el de 25 mL/L, el consumo de sustrato obtenido para estos es muy parecido (42,312 g/L, 41,084 g/L, respectivamente), pero la biomasa producida con ese mismo consumo es más alta cuando la concentración de enzimas es mayor. Según estos resultados, adicionar una dosis de enzimas mayor al medio, hace más eficiente el consumo de sustrato, la célula aprovecha los azúcares para producir más biomasa que para otras funciones fisiológicas (Santander, 2006), demostrándose con los resultados obtenidos de formación de biomasa (Ver Gráfica 4), donde Saccharomyces cerevisiae incrementa su tasa de crecimiento a medida que aumenta la concentración de enzimas, ya que en los tratamientos con dosis de enzimas mayores, se obtuvieron las concentraciones de azúcares reductores y consumos de sustrato más altos, confirmando que la levadura toma los azúcares
reductores presentes en el medio como fuente de carbono y energía (Navarro y Sossa, 2003).
Tabla 7. Datos de la biomasa máxima alcanzada y el consumo de sustrato bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo. Concentración de enzimas mL/L Log Biomasa máx (UFC/mL) Sustrato Consumido (g/L) 5 8,902 36,159 10 9,295 38,274 15 9,261 42,312 20 9,332 53,400 25 9,371 41,084 C + 9,366 34,208 C - 8,889 0,159
Por otro lado, en el control negativo, se evidencia que Saccharomyces cerevisiae
alcanza un valor de biomasa máxima de 8,889 Log UFC/mL, mostrando una mínima diferencia de 0,013 Log UFC/mL con el tratamiento de 5 mL/L de enzimas, teniendo en cuenta que en este control no hay un elemento enzimático que realizara la hidrólisis del almidón, se considera que este comportamiento se da, por la presencia de fuentes de carbono diferentes a los azúcares liberados del almidón y de fácil asimilación para la levadura, porque los valores obtenidos de azúcares reductores y del consumo de estos para este control fueron muy bajos, razón por la cual, la concentración de azúcares obtenida no tiene una correlación con el valor de biomasa obtenido .
Como se observa en la Gráfica 7, el aumento de la dosis de enzimas influye en el consumo de sustrato, mostrando un comportamiento de variación similar. Se evidencia que la concentración de enzimas con mayor consumo de sustrato es la recomendada en este estudio, 20 mL/L (53,4 g/L), sin embargo, en los tratamientos
Dosis de Enzimas (ml/L) 5 10 15 20 25 C + C - Sustrato Consumido (g/ L ) 0 10 20 30 40 50 60 70 Gráfica 7. Consumo total de sustrato bajo las diferentes concentraciones de
enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo.
con las diferentes concentraciones de enzimas se observan consumos no tan lejanos a los obtenidos en esta concentración, pero si superiores al control de comparación (Ver tabla ANEXO 6.9), demostrándose, que el empleo de este tipo enzimas favorece a la liberación de azúcares reductores en la hidrólisis del almidón de la cebada sin maltear, los cuales serán asimilados por la levadura para su mantenimiento celular. Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos de consumo de sustrato, se comprueba que existe diferencias significativas entre los tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.5), confirmando que las dosis de enzimas influyen significativamente en la formación de biomasa, obteniendo el mayor consumo en el tratamiento con 20 mL/L de enzimas (p<0,005).
6.4.2 Producción de etanol
En la Gráfica 8 se observa, la concentración de etanol obtenido en la fermentación con S. cerevisiae Safwhisky M-1 en función de la concentración de enzimas utilizadas en el proceso hidrolítico. Se evidencia, que la tendencia que tiene la concentración etanol es aumentar, a medida que se incrementa la dosis de enzima
(Ver tabla Anexo 6.11). El tratamiento con mayor producción de etanol fue con 20 mL/L de enzimas, comprobando que el aumento de la dosis de enzimas, favorece la obtención de etanol. Sin embargo, los valores de etanol obtenidos en la concentración de 15 mL/L, en relación a los de la concentración de 20 mL/l presentan una variación de solo 0,58% de etanol, por lo que el rendimiento de esta concentración es muy cercano al mejor (20mL/L).
Gráfica 8. Producción total de etanol bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo.
En la gráfica 9, se observa que la producción de etanol en la concentración de 25/mL fue la menor en relación a los demás ensayos y al control de comparación, indicando que en este caso, la levadura utilizó gran parte del sustrato para formar biomasa y el remanente lo utiliza para la formación de producto, porque la biomasa producida en este ensayo no tuvo mayor diferencia a la de los demás resultados obtenidos, pero la influencia de esta concentración si se refleja en el sustrato consumido y porcentaje de alcohol producido. De la misma forma, se observa que para los demás tratamientos y control de comparación, la producción de etanol requiere un consumo mayor de sustrato, observando una proporción directa entre estos dos parámetros.
Gráfica 9. Consumo total de sustrato y producción total de etanol bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control
negativo.
Por otro lado, en el control negativo, se evidencia que Saccharomyces cerevisiae
alcanza un valor de etanol de 0,46 %, considerando que este valor, a pesar de ser muy bajo, es obtenido posiblemente por la fermentación de azúcares liberados por hidrólisis enzimática por acción de alfa y beta amilasas de la cebada, las cuales se encuentran en concentraciones tan bajas que para un proceso productivo no son representativas en relación a la concentración presente en la cebada malteada, sin embargo, como se observa en la grafica 8, la concentración de enzimas presentes en esta cebada tuvo la capacidad de liberar azúcares del almidón para producir este valor de etanol, pero la naturaleza de estos azúcares son diferentes a la glucosa, ya que el valor de azúcares reductores obtenido y el consumo de sustrato, reflejan un comportamiento muy bajo, por lo que la levadura pudo realizar la fermentación a partir de una fuente de carbono diferente a los azúcares cuantificados por el método de Fehling.
Con el análisis estadístico se comprobó que existe diferencias significativas entre los cinco tratamientos (p<0,005), (Ver Tabla Anexo 9.6), demostrando que los tratamientos con una concentración de enzimas entre 15 y 20 mL/L, producen
mayor concentración de etanol, que en los tratamientos donde se utilizan dosis menores o mayores a estas.
Gráfica 10. Relación entre la concentración de etanol producido y productividad producto-sustrato en función en función de la concentración de enzimas, (C+)
control de comparación y (C-) control negativo.
En la Gráfica 10 (Ver Tabla Anexo 9.7) se observa la productividad del proceso, en la cual, la relación de gramo de etanol producido por gramo de azúcar consumido no presenta una diferencia considerable entre ensayos, sin embargo la influencia de las dosis de enzimas si afecta este valor, ya que la producción de etanol depende de la cantidad de azúcar consumido y por ende la concentración de azúcares producidos en la hidrólisis por acción de una determinada concentración de enzimas. Estos resultados concuerdan con lo referenciado por Siqueira et al. (2008) obteniendo resultados donde el porcentaje de etanol generado, por gramo de sustrato consumido en cada ensayo no presenta diferencias considerables. Por lo tanto se concluye que la productividad con mejor comportamiento es para las dosis con 15 y 20 mL/L de enzimas, confirmando los demás resultados presentados donde el desempeño de estas enzimas fue el óptimo para este estudio. Por otro lado, al observar la Gráfica 9 y 10, se evidencia que la mayor concentración de etanol obtenida fue con una concentración de enzimas de 20 mL/L, confirmando a esta
Dosis de enzima (ml/litro)
5 10 15 20 25 C + C - E tanol ( % ) 0 1 2 3 4 5 Y p /s ( g de et anol /g azúcar es r educt o res) 0 1 2 3 4
como la mejor concentración de alfa y beta amilasas, para la obtención de una alta concentración de azúcares reductores fácilmente asimilables por Saccharomyces cerevisiae.
Finalmente, se sometieron a una prueba sensorial los diferentes destilados obtenidos en los diferentes tratamientos con las concentraciones de enzimas, con el fin de determinar una posible alteración en la calidad organoléptica del alcohol obtenido en estos ensayos, determinado que en ninguno de los ensayos se presentó una alteración de sabor y olor, resultado que favorece y respalda la propuesta de este ensayo, como lo es la utilización de enzimas comerciales como alternativa en el proceso de producción en Destilería Premier, teniendo en cuenta también experiencias similares en la destilería que presentaron un producto picante y con deficiente aceptación por el panel de evaluación sensorial.
6.5 COSTOS DE PRODUCCIÓN
Chen et al. (2007), reportaron como el costo de las enzimas contribuye significativamente al costo total del proceso de conversión de biomasa, donde la dosis de enzimas debe ser minimizado tanto como sea posible. Teniendo en cuenta esto, las concentraciones empleadas en este estudio se establecieron basándose en las recomendaciones del proveedor, y en un ensayo previo con una dosis de 1 mL/L, dando este último un resultado desfavorable a nivel de hidrólisis y generando un medio muy viscoso para la fermentación. La reducción de los costos de producción son la esencia de la adopción de medidas contundentes en la mejora del proceso manufacturero de la industria de destilería (Kłosowski, 2006), por lo tanto, se calculó el costo de un litro de etanol producido en la destilería para un lote de 10.000 litros, el cual es de 4.428 pesos/litro como resultado de la destilación de un volumen de 1.000 litros de etanol (Ver Anexo 10). Además, se determinó el costo del mismo litro de alcohol, pero empleando una contracción de 20 mL/L de enzimas para un lote de producción de 10.000 litros, dando como resultado que el litro de alcohol tendría una equivalencia de 15.936 pesos/litro de etanol, en base a los resultados obtenidos del presente estudio. Además, la propuesta de este estudio de emplear únicamente cebada nacional como materia prima para el proceso hidrolítico
y fermentativo, presenta ventajas como ser 2.500 pesos/kilo más económica que la cebada malteada, asimismo su disposición no requiere un proceso de importación.
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, se considera que el empleo de las enzimas en una concentración de 20 mL/L como única herramienta hidrolítica sustituyente de la cebada importada, no se favorece a nivel de rentabilidad en el proceso productivo de las destilería. Sin embargo, la utilización de estas enzimas como ayudante en el proceso de hidrólisis, especialmente para la degradación del almidón de cebada sin maltear, favorecería el rendimiento de este proceso y tiempo de producción, además de ser una posible solución a los problemas que en ocasiones se presenta en el proceso productivo en la destilería, a nivel de tiempos muy largos en la hidrólisis del almidón, incremento de la viscosidad, generando apelmazamiento del medio y retraso en la producción, teniendo en cuenta que estas enzimas contribuyeron en la disminución de la viscosidad del medio, de acuerdo con los resultados obtenidos en el proceso hidrolítico (Ver Anexo 5)
Por otro lado, en este estudio se demostró que las enzimas empleadas para el proceso amilolítico, realmente degradaron el almidón de la cebada sin maltear, por lo que se podría considerar para futuros estudios el empleo de concentraciones de sustrato mayores, empleando las mismas concentraciones de enzimas de este estudio durante periodos de tiempo más largos y a su vez, concentraciones de enzimas menores tales como las reportadas por Kolusheva y Marinova (2007), las cuales fueron 6, 8, 10, 12 y 14 unidades de enzimas por mL, obteniendo un 30,2 % de rendimiento de hidrólisis, teniendo en cuenta que entre mayor sea el uso de la cebada nacional o sin maltear en el proceso productivo, mayor será el ahorro para la destilería.
7. CONCLUSIONES
Con la concentración de enzimas propuesta (20 mL de enzimas/L suspensión) se logró mejorar el rendimiento de hidrólisis en un 89,44 % en relación al que se obtiene normalmente en la planta 41.85 %, considerando a esta como la dosis óptima para la etapa hidrolítica del proceso de producción de alcohol cuando se emplea como sustrato cebada sin maltear.
Las condiciones de experimentación en el proceso hidrolítico favorecieron la degradación del almidón de cebada, logrando un medio con una temperatura y pH favorable para la actividad de las enzimas, reflejándose en los valores de azúcares reductores obtenidos en todos los tratamientos.
Todos los resultados obtenidos en el estudio, muestran que se puede producir etanol a partir de almidón de cebada sin maltear empleando las enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L, considerando el uso de α y β-amilasas comerciales como una alternativa viable para la degradación del almidón de cebada sin maltear, especialmente cuando se presentan problemas de hidrolisis del almidón de cebada (apelmazamiento) en el proceso de producción, pero la producción del hidrolizado requiriere más estudios de optimización para la obtención de una mayor gran cantidad de azúcares reductores que sean asimilados rápidamente por la levadura y así obtener mayores niveles de producción de etanol.
En etapa fermentativa, aumentar la concentración de enzimas de 15 a 20 mL/L ayuda a incrementar la obtención de producto, sin embargo con la dosis de 25 mL/L se presenta el hecho de tener más concentración de células en el medio, generándose más necesidades nutricionales para el mantenimiento de la levadura y menos disponibilidad de sustrato para la producción de alcohol.
El empleo concentraciones de enzimas comerciales en el medio de cultivo de reproducción mejora la eficiencia de consumo de sustrato, elimina la fase de adaptación del microorganismo y asegura la rápida obtención de la biomasa
máxima a las 48 horas de fermentación dependiendo de la cantidad de enzimas presentes en el medio.
El porcentaje de etanol obtenido al final de la fermentación fue de 4,98 % v/v por destilación utilizando a Saccharomyces cerevisiae en hidrolizado de cebada sin maltear con una concentración de enzimas de 20 mL/L, mostrando una productividad de producto en sustrato de 0,0951 g de etanol/ g de azúcares reductores.
Las pruebas realizadas mostraron que la ausencia de enzimas en la cebada no malteada, puede ser reemplazada por amilasas comerciales donde el aumento en la concentración de estas se ve reflejado en la obtención de concentraciones mayores de producto, siempre y cuando esta concentración libere los azúcares reductores necesarios para que la levadura pueda generar un buen nivel de etanol
La realización de este tipo de trabajos permite entender el proceso de producción de alcohol y por lo tanto saber cómo influyen factores tales como la temperatura y el tiempo de hidrólisis, concentración de azúcares reductores, tiempo de fermentación, concentración de inóculo y por su puesto la concentración de enzimas, obteniéndose así herramientas para solucionar los problemas que se puedan presentar y bases para la optimización del proceso.
8. RECOMENDACIONES
Es necesario realizar al menos un ensayo de la concentración de enzimas propuestas a nivel piloto en la planta, con el fin de confirmar la correspondencia de los resultados obtenidos en el laboratorio, debido a que los resultados que se obtienen en el proceso industrial son el punto definitivo para considerar a estas enzimas como una alternativa rentable para la empresa, ya que en el laboratorio se trato de simular al máximo el proceso de la destilería, las condiciones ambientales, separación de afrecho, control de temperatura no se llevaron a cabo de forma igual, por lo que los resultados pueden generar variaciones.
Realizar el proceso de hidrolítico bajo tiempos de hidrólisis más prolongados, con el fin de poder obtener rendimientos interesantes empleando concentraciones de enzimas inferiores a la sugerida en este estudio.
Debido a que en este estudio no se determinó la concentración de azúcares reductores al durante el proceso de hidrólisis, al iniciar la fermentación y en la fermentación, así como también la realización de un seguimiento de la producción de etanol durante toda la fermentación, sería muy valioso continuar con la investigación teniendo en cuenta estos aspectos, puesto que estos factores en la industria de producción de alcohol son puntos de suma importancia que podrían reportar resultados más significativos.
Es necesario realizar una cromatografía para conocer el tipo y cantidad de componentes del hidrolizado, para identificar la naturaleza de las fuente nutricionales que puede utilizar Saccharomyces cerevisiae en la fermentación del hidrolizados de cebada.
Establecer un procedimiento para la determinación de la actividad enzimática de las enzimas, con el fin de determinar la tasa de reacción de estas a diferentes concentraciones y en presencia del almidón de cebada no malteada.
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alfenore, S., Molina-Jouve, C., Guillouet, S. E., Uribelarrea, J. L., Goma, G., Benbadis, L. 2002. Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process. Appl. Microbiol. Biotechnol 60 (1–2), 67–72.
Andreason, A. A., y Stier, T. J. 1954. Anaerobic nutrition of Saccharomyces cerevisiae. II. Unsaturated fatty acid requirement for growth in defined medium. J. Cell. Comp. Physiol. 43:271-281.
Aries, V., Kirsop, B.H., Taylor, G.T. 1977. Yeast lipids. Proceedings of 16th Congress, Amsterdam. European Brewery Convention, Zoeterwonde, The Netherlands, Rotterdam, pp 255-266.
Bailey, P.S., y Bailey, C.A. 1998. Química orgánica: conceptos y aplicaciones. Quinta edición. Editorial Prentice Hall. México. 470 p.
Baker, C. 1994. Curso conservación de papel en archivos, conservación de los objetos de papel. Centro Nacional de Conservación y Restauración, Santiago de Chile.
Beavan, M. J., Charpentier, C., Rose. A. H. 1982. Production and tolerance of ethanol in relation to phospholipid fattyacyl composition in Saccharomyces cerevisiae NCYC 431. J. Gen. Microbiol. 128:1447-1455.
Beltran, P. Z., y Maldonado, P K. 2002. Caracterización microbiológica de cebada malteada y arroz y determinación de actividad enzimática amilolítica microbiana en l proceso de elaboración de mosto cervecero. . Requisito parcial para optar por el título de Microbiólogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Departamento de Microbiología. Bogotá, Colombia.