Tractability and Computational Complexity

Esta técnica establece el método de análisis para la determinación de azúcares reductores totales en la miel final.

1. Fundamento del método. Está basado en la inversión de los azúcares presentes en la

miel final y su posterior reacción con el Cu²+en medio alcalino. 2. Reactivos químicos.

Oxalato de sodio o potasio Tierra de infusorios Ácido clorhídrico

Solución de ácido clorhídrico 6,34 N.

- se transfieren 311,7 mL de ácido clorhídrico de densidad 1,16 g/mL a un frasco volumétrico de 500 mL que contenga aproximadamente 200 mL de agua, se homogeniza y completa a volumen. De no usarse estas especificaciones para el ácido se harán ajustes en la relación ácido-agua. Se verificará la solución utilizando un areómetro Brix de 20 a 30 % ajustando en caso necesario a 24,85 % a 20 º C.

Solución de hidróxido de sodio N.

- se pesa 40,0 g de hidróxido de sodio, se disuelve en 800 mL de agua, se espera a que alcance la temperatura ambiente y se completa a volumen hasta 1 000 mL.

Solución A de Fehling.

- se pesa 70,0 g de sulfato de cobre pentahidratado, se transfiere a un frasco volumétrico de 1 000 mL, se completa a volumen y se homogeniza. Se filtra a través de tierra de infusorios y se envasa en un frasco ámbar.

Solución B de Fehling.

- se pesa 346,0 g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado (sal de Rochelle), se transfiere a un frasco volumétrico de 1 000 mL y se adicionan de 400 a 500 mL de agua, se añade 100,0 g de hidróxido de sodio, se disuelve y completa a volumen. Se deja en reposo durante 2 días. Se filtra a través de tierra de infusorios y se envasa en frasco ámbar.

Solución de referencia de azúcar invertido.

- se pesa 23,750 g de sacarosa, se transfiere a un frasco volumétrico de 250 mL y se disuelve con 120 mL de agua. Se añaden 9 mL de ácido clorhídrico y se deja en reposo durante 15 días a temperatura ambiente. Se completa a volumen y se homogeniza, debiendo comprobarse si la hidrólisis ha sido completa. Para ello es necesario leer la solución de referencia de azúcar invertido en un tubo de observación de 200 mm debiendo dar -11,6 º S a 20 º C.

Solución alcohólica de fenolftaleína al 0,5 % (m/v) Solución acuosa de azul de metileno al 0,3 % (m/v)

Solución de referencia A de azúcar invertido de 10 mg/mL y 2 mg/mL con respecto al ácido benzoico.

- de la solución de referencia se transfieren 200 mL a un frasco volumétrico de 2 000 mL y se diluye con agua hasta aproximadamente la mitad. Se añade rotando el frasco volumétrico suficiente solución de hidróxido de sodio N para que cuando se diluya a 2 000 mL dicha solución resulte 0,001 N con respecto al ácido clorhídrico. Para el volumen de hidróxido de sodio a añadir se valoran 10 mL de la solución de referencia con solución de hidróxido de sodio N, usando fenolftaleína como indicador hasta

39alcanzar su color final rosado permanente. El volumen de hidróxido de sodio a añadir se calcula mediante la siguiente fórmula:

NaOH (N) = (20. V) - 2 (mL) dónde:

- se añade a la solución anterior 4,0 g de ácido benzoico disueltos en agua a una temperatura de 60 a 70 º C, se lleva a temperatura ambiente y se completa a volumen, obteniéndose así la solución de referencia de azúcar invertido en una solución al 0,2 % (m/v) de ácido benzoico. Esta solución es estable y se mantiene en buen estado por 1 año.

Solución de referencia B de azúcar invertido de concentración 2 mg/mL.

- se pipetean 50 mL de la solución de referencia A de azúcar invertido a un frasco volumétrico de 250 mL, se añaden 50 mL de agua y se neutraliza con solución de hidróxido de sodio N usando fenolftaleína como indicador, manteniéndose el frasco volumétrico en constante agitación. Se completa a volumen y se homogeniza. Está solución no es estable, por lo que se preparará cada vez que sea necesario valorar la solución A de Fehling.

2.1 Valoración de la solución A de Fehling.

Se pipetean a un frasco cónico 5 mL de solución B y se añaden 23 mL de agua medidos con bureta.

Se llena una bureta con la solución de referencia B de azúcar invertido y se añade 25,5 mL de la solución A y B de Fehling contenida en el frasco con la seguridad de que sólo faltará alrededor de 1 mL de la misma para el punto final.

Se coloca el frasco cónico sobre tela amiantada en una hornilla eléctrica u otra fuente de calor con regulador de temperatura y ésta se regula de tal forma, que el líquido demore en hervir 4 min y después se mantenga la ebullición moderada durante 2 min más. Transcurridos los 2 min y manteniendo la ebullición se añade 0,5 mL de la solución indicadora de azul de metileno y con la bureta que contiene la solución de referencia B de azúcar invertido se añade gota a gota hasta que el cambio de color azul oscuro a rojo ladrillo nos indique que la reacción ha terminado.

Esta valoración debe completarse en 1 min, es decir, que el contenido del frasco cónico debe hervir 3 min sin interrupción.

La operación de valoración completa se repetirá tantas veces como sea necesario para lograr conocer con exactitud la concentración de la solución A de Fehling.

2.1.1 Ajuste de la solución A de Fehling. Cuando se prepara la solución A de Fehling,

se pesa un ligero exceso, unos 720 mg de la sal de cobre, por lo que se consume una mayor cantidad de la solución de referencia B de azúcar invertido que ha requerido, siendo necesario ajustar la solución A de Fehling mediante la adición de agua en la proporción siguiente:

- por cada 0,1 mL de solución de referencia B de azúcar invertido que se consuma por exceso de 26,25 mL se añadirá 3,8 mL de agua, por cada litro de solución A de Fehling preparada

- después de añadir el agua según cálculos, se valora nuevamente la solución A de Fehling para comprobar la concentración de la misma. De no coincidir el gasto con el valor anterior se repetirá el procedimiento.

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3. Aparatos y utensilios.

Balanza de laboratorio de 200 g y precisión 0,002 g Cronómetro con vD 1 s

Fuente de calor con regulación de temperatura Bomba de vacío

Frasco cónico de 250 a 300 mL y boca estrecha Termostato

Bureta de 50 mL y vD de 0,1 mL

Termómetro de 0 a 100 º C

4. Procedimiento.

4.1 Preparación de la solución de ensayo. Se pesan 5,000 g de la muestra de ensayo

con un error máximo permisible de 0,005 g, se lleva a un frasco volumétrico de 500 mL, se añade 2,5 mL de oxalato de sodio o potasio y se agrega agua hasta la marca del frasco.

Se agita vigorosamente y se filtra colocando de 1 a 2 cucharaditas de tierra de infusorios en el papel de filtro, se desechan los primeros 20 a 30 mL del filtrado, se cubre con un vidrio reloj mientras dure la filtración.

Del filtrado obtenido se pipetean 100 mL a un frasco volumétrico de 300 mL, se añaden 50 mL de agua y se inserta un termómetro, se lleva a un termostato haciendo rotar el frasco hasta que el contenido alcance 65 º C. Se retira el frasco de la fuente de calor e inmediatamente se adiciona 10 mL de solución de ácido clorhídrico 6,34 N y se homogeniza por rotación. Se deja en reposo por 30 min.

Se lleva a temperatura ambiente, usando para ello agua corriente u otro medio. Se retira el termómetro del frasco volumétrico, lavándolo con agua de manera que los lavados caigan en el interior del mismo, se neutralizan con hidróxido de sodio N usando fenolftaleína como indicador, operación que se realizará en forma lenta y rotando continuamente el frasco, se completa a volumen y homogeniza.

4.2 Determinación.

4.2.1 Evaluación de reductores. Valoración incremental. Se llena una bureta de 50 mL

con la solución preparada en 4.1, se preparan 3 frasco cónico de 250 a 300 mL y boca estrecha con 5 mL de soluciones A y B de Fehling respectivamente.

Se añaden a uno de los frasco cónico 20 mL de agua y 15 mL de la solución de ensayo, se calienta colocándolo sobre tela amiantada en una fuente de calor, de manera que ebulla en 4 min. Se añaden porciones sucesivas de la solución de ensayo hasta que el líquido en que está suspendido el precipitado rojo tome una coloración azul muy ligera. Se mantiene la ebullición moderada 2 min más y se añaden 0,5 mL de solución indicadora de azul de metileno al 0,3 % sin que toque las paredes del frasco cónico. Se mantiene la ebullición durante 1 min más añadiendo pequeñas porciones de solución de ensayo dejando que el líquido hierva 10 s entre cada adición y se dará por terminada la valoración cuando se produzca el cambio de azul oscuro a rojo ladrillo.

4.2.2 Evaluación de los reductores. Valoración normal. Se toma otro frasco cónico

preparado en 4.2.1 y se adiciona una cantidad tal de solución de ensayo (determinada anteriormente) que sólo reste adicionar 1 mL para finalizar la valoración.

Se añade agua hasta que se complete un volumen de 59 mL, se calienta colocándolo sobre una tela amiantada en una fuente de calor de forma tal que comience a hervir en 4 min, se deja 2 min en ebullición moderada y se agrega 0,5 mL de solución indicadora de azul de metileno al 0,3 %, sin que toque las paredes del frasco.

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Se valorará añadiendo porciones sucesivas de 2 a 5 gotas dejando que el líquido hierva 10 s entre cada adición hasta que se acerque lo más posible al punto final (azul ligero) y finalmente se disminuyen las porciones a 1 ó 2 gotas y el tiempo entre 2 a 3 s entre cada adición, completando la valoración en 1 min a partir de los 2 min de ebullición. Se dará por terminada la valoración cuando se reduzca el cambio de color azul oscuro a rojo ladrillo, la operación completa se repite con el objetivo de promediar las dos determinaciones y tomar el valor medio para los cálculos.

5.1 Métodos para los cálculos. Teniendo en cuenta los mL de solución preparada

gastada en la valoración normal y la fórmula siguiente se calculan los azúcares reductores totales.

52,5

ART =——. F

C dónde:

ART azúcares reductores totales contenidos en la muestra % (m/m)

C volumen de la solución de ensayo gastados en la valoración normal (mL) 52,5 factor correspondiente a la concentración de sacarosa en el frasco cónico F factor de dilución

Nota: Si no se hacen modificaciones a las cantidades de muestras señaladas en el método F tendrá un valor de 30.

5.2 Aproximación de los resultados. Los resultados se darán aproximados hasta la