ی
قیق
حت
هلا
قم
لباب یکشزپ مولع هاگشناد هلجم هرود ،متسیب ةرامش 6 ، دادرخ 3179 هحفص ، 67 -66هت
ی
ه
و
زرا
ی
با
ی
راذگراب
ی
ئتورپ
ی
ن
سکاویر
رد
تارذونان
ک
یا
نازوت
( یقداص دواد
PhD
)
3،
یمیهاربا زوریف
(
PhD
)
3 *( ینیدلا نیز یدهم ،
PhD
)
6( هداز یدرورات فسوی ،
MSc
)
3( یشخب یفطصم ،
PhD
)
3،
داوج دمحم
( روپ یرقاب
PhD
)
3( ییاقآ یبتجمدیس ،
MSc
)
3 3 -زكرم تاقیقحت تسیز ،یسانش هدکشناد مولع ،هیاپ هاگشناد ماما ،)ع( نیسح ،نارهت ناریا 6 -هدکشهوژپ یروانف و مولع ناریا ،نارهت ،رتشا کلام یتعنص هاگشناد ،یتسیز تفایرد : 4 / 30 / 76 ، :حلاصا 34 / 36 / 76 ، ذپ ی شر : 6 / 3 / 79هصلاخ
هقباس و فده : یم رمیادورته نیئتورپوکیلگ کی نیسیر مس یم هدافتسا یمسیرورتویب لماع کی ناونعب نآ زا لااب تیمس هب هجوت اب هك دشاب ضاح لاحرد .دوش تاعلاطم ر ینمیا لماش یدحاو ریز نسكاو دیدناك ود یور رب نیسیر هیلع ییاز سكاویر و RVEc ینمیا ،تاعلاطم نیا .تسا هدش زكرمتم ییاز هارمه و اهنت تروص هب ار نسكاو دیدناك هداد رارق یسررب دروم تناوجدا اب متسیس زا نونكات یلو دنا ینمیا دوبهب یارب ،تارذونان دننام نیون لیوحت یاه .تسا هدشن هدافتسا اهنآ ییاز فده زا نیا قیقحت ، یبایزرا و هیهت ازوتیك تارذونان رد سكاویر بیكرتون نسكاو دیدناك یراذگراب ن دشاب یم . داوم و شور اه : نژ لاقتنا زا سپ ،یبرجت هعلاطم نیا رد سكاویر هب ،یرتكاب نیئتورپ صیلخت و نایب ءاقلا سكاویر یفارگوتامورك نوتس طسوت یبیكرت لیم نیئتورپ ، سكاویر نویسلاژ شور اب نازوتیاك تارذونان رد روم ،هزادنا لماش تارذونان تایصوصخ سپس .دش یراذگراب ینوی یژولوف ، تارذونان زا سكاویر نیئتورپ شیاهر یوگلا و سابتحا دصرد طسوت تارذونان رد یراذگراب یدیسا طیارش یط رد نیئتورپ نیا یرادیاپ و SDS-PAGE .تفرگ رارق یبایزرا دروم ینمیا یسررب نینچمه یور رب ییاز 1 هورگ 4 ییات شوم .تفریذپ تروص تافسفرفاب و نیئتورپ یواح تارذونان ،سكاویر نیئتورپ طسوت :اه هتفای هزادنا یاراد نیئتورپ یواح تارذونان هك داد ناشن قیقحت نیا جیاتن 391 رتمونان ، یاتز لیسناتپ 1 / 69 یلیم + و تلو ربارب یگدنكارپ صخاش 371 / 0 یم نینچمه .دنشاب قبطرب جیاتن SDS-PAGE صخشم دش هك نیئتورپ سكاویر رف یط رد آ یم بیرخت نازوتیاك تارذونان هیهت دنی .دوش یتنآ رتیت نیرتلااب نك تفایرد هورگ هب طوبرم یداب هدن ( دوب ییاهنت هب نیئتورپ 016 / 0 ± 606 / 6 تفایرد هورگ اب هك ) ( نیئتورپ یواح تارذونان هدننك 000 / 0 ± 169 / 0 ینعم توافت دهاش هورگ و ) ( تشاد یراد 03 / 0 p< زا نینچمه .) ینعم توافت یرامآ ظاحل هنومن نیب یراد دشن هدهاشم هدش یراذگراب تارذونان و دهاش یاه . تن ی هج گ ی ر ی : داد ناشن قیقحت نیا جیاتن هك نیئتورپ سكاویر نویسلاژ شور و هدوب رادیاپان ،نازوتیاك تارذونان دیلوت یدیسا طیارش رد گراب یارب ینوی یراذ سكاویر رد تارذونان یمن بسانم نازوتیاك .دشاب هژاو اه ی لك ی د ی : نازوتیاك سكاویر ،تارذونان ، نسكاو ، .همدقم
نیسیر تسا یمس نیئتورپ کی هك رد هناد یاه هایگ کچرك یم دوجوم ب .دشا نیسیر نیتکل نیئتورپوکیلگ کی اب یلوکلوم نزو kDa 60 -60 لکشتم و ود زا هریجنز A و B یم ید دناب کی طسوت هك دشاب لصتم رگیدکی هب دیفلوس هدش دنا ( 6 و 3 ) هریجنز . B دورو مس یم لیهست ار لوزوتیس هب دنك و هریجنز A زین اب یلوکلوم نزو kDa 16 قیرط زا موزوبیر ریذپان تشگرب ندرك لاعفریغ یاه یتویراكوی نیئتورپ زتنس زا ، یم یریگولج دنك هك دنیآرف نیا تیاهن رد هب رجنم گرم یم لولس دوش ( 4 و 1 .) تیمومسم اب یم نیسیر قیرط زا دناوت ی ،یقاشنتسا ،یكاروخ ا تسوپ و مشچ ریسم زا نینچمه و یقیرزت (دوش داجیا 3 لاحرد .) رضاح نامرد چیه یارب یصاخ تیمومسم هناشن هب هجوت اب و درادن دوجو نیسیر اب یرامیب یاه ، ًاتدمع تروص هب نامرد یم یکمك دشاب ( 0 .) یم ناشن یناویح تاعلاطم قیرط زا دهد لصاح هلاقم نیا نایاپ ان یقداص دواد هم هتشر یوجشناد یژولونکتویبونان هاگشناد )ع( نیسح ماما عماج .دشاب یم * رتكد :هلاقم لوئسم یمیهاربا زوریف :سردآ ،نارهت ع( نیسح ماما عماج هاگشناد ،) هدکشناد مولع زكرم ،هیاپ تاقیقحت تسیز یسانش . :نفلت 99304714 -063 E-mail: [email protected] نمیا لاعف ای و لاعفریغ یزاس طسوت( نسكاو یسیر اب تیمومسم ربارب رد ناوت یم ) ن (دومن داجیا تظفاحم 6 .) Smallshaw شناراکمه و یلوت فده اب نسكاو کی د یب و یمسریغ ،رطخ هریجنز یاهدحاوریز A تناتوم بیكرتون رارق یسررب دروم ار نسكاو دیدناك کی تیاهن رد و هداد نیئتورپ ی بیكرتون مانب سكاویر ر یفرعم ا نیا .دندومن رد شهج ود یاراد نیئتورپ ،یلاوت لماش نیزوریت 10 نینلاآ هب هاگیاج( یموزوبیر تیمس لامعا ) نیلاو و 96 نینویتم هب )یقورع تشن مردنس فیتوم( یم نونكات .دشاب رد یفلتخم تاعلاطم صوصخ نازیم یتیسینژونومیا و یرادیاپ ر سكاوی شور و زیوجت فلتخم یاه تروص ندب هب نآ هتفرگ شیامزآ نینچمه .تسا یاه ینمیا ییاز نیا دیدناك نسكاو تناوجدا اب هارمه و اهنت تروص هب یور رب ویح تانا وم رارق یسررب در تسا هتفرگ ( 33 -9 ) ،نسكاو نیا یناسنا زیوجت یارب یلو هب زاینCORE Metadata, citation and similar papers at core.ac.uk
J Babol Univ Med Sci; 20(6); June 2018
61
Preparation and Evaluation of Rivax…; D.Sadeghi, et al
تناوجدا متسیس و نیزگیاج یاه نیون لیوحت یاه یم ،دشاب زا نونكات نکیل ییاز ینمیا تایصوصخ دوبهب یسررب یارب تارذونان دننام نیون لیوحت یاهمتسیس ییاهرمیلپ زا یکی .تسا هدشن هدافتسا نیئتورپ نیا رتسگ روط هب هزورما هك تهج هد تسیز تارذونان دیلوت تسیز و راگزاس بیرخت یم رارق هدافتسا دروم ریذپ گ نازوتیاك دری یم یبسانم هنیزگ هك دشاب یارب شناسر نژ ،اهورادویدار اه ، نیئتورپ تپپ و اه اهدی یم نازوتیاك تارذونان هزورما .دشاب ،یناهد هرفح ،یسفنت ،یمشچ یاهریسم زا سد وراد زیوجت یارب نژاو و شراوگ هاگت نسكاو و یم هدافتسا دوش ( 31 و 36 فده .) بیكرتون نسكاو دیدناك یراذگراب یبایزرا و هیهت قیقحت نیا ماجنا زا یر رد سكاو نازوتیاك تارذونان .دشاب یم
اه شور و داوم
اب )ع(نیسح ماما هاگشناد قلاخا هتیمك بیوصت زا سپ یبرجت هعلاطم نیا رد دددك 3100 . 3176 IR.IHU.REC. یرتكاددب زا ، E. coli BL21-DE3 و طیحم زا نآ دشر تهج تشك یاه LB ،ییایمیش داوم .دیدرگ هدافتسا راگآ و عیام رگنادشن و تیك تكردش زا یلوکلوم یاه هیهت زاتنمرف و نژایك ،نژانیس ،کرم یاه تكرش زا طدسوتم یلوکلم نزو اب یلوکلوم نزو اب نازوتیاك رمیلپ .ددش Sigma-Aldrich یرت میدس ، تكرش زا تافسف یلپ Scharlau یعانص نژ و سكاویر هریجنز رد شهج ود یاراد هك A یددسانددش تددسیز زكرم و هورگ زا دوب نیددسیر زا تارذونان ریودددصت هیهت تهج .دیدرگ هیهت )ع( نیدددسح ماما عمادج هادگدددشناد ینورتکلا اوکددسورکیم SEM تكرددش تخاددس KYKY یددسررب روظنم هب و دنا و هزا هاگتسد زا تارذونان یاتز لیدسناتپ DLS لدم Malvern روشك تخاس .دش هدافتسا ناتسلگنا بیكرتون نیئتورپ هیهت سكاویر : لولس هیهت زا سپ یرتكاب دعتسم یاه E. coli BL21(DE3) نیئتورپ یواح یعانص نژ ، سكاویر هب یترارح کوش شور اب لولس نژ نایب ءاقلا یارب و دش مروفسنارت دعتسم یاه سكاویر یامد رد 10 هجرد زا دارگیتناس isopropyl-B-d thiogalactopyranoside ( IPTG اب ) کی ییاهن تظلغ mM زا ،نایب یسررب و یرتكاب زیل زا سپ نینچمه .دش هدافتسا نوتس Ni-NTA وزادیمیا یتظلغ بیش اب نیئتورپ صیلخت تهج ل سكاویر .دش هدافتسا نیئتورپ یواح نازوتیاك تارذونان هیهت سكاویر : سلاژ شور اب نازوتیاك تارذونان نوی تظلغ اب یلولحم .دش هیهت ینوی mg/ml 6 کیتسادیسا رد نازوتیاك زا 6 % ینزو ( 0 / 4 pH= ) تظلغ اب یلولحم زین و mg/ml 3 یرت میدس زا یلپ هیهت تافسف .دیدرگ 0 یلیم یرت میدس لولحم زا رتیل یلپ یط و هرطق هرطق تروص هب تافسف نامز تدم 60 هب هقیقد 0 / 9 یلیم یواح نازوتیاك لولحم رتیل 3 یلیم نیئتورپ مرگ هفاضا ،دوب هتفرگ رارق تباث تعرس اب یسیطانغم نزمه یور رب هك یلاح رد بیكرتون .دش تدم هب لولحم تیاهن رد 10 زمه هقیقد لولحم ،شنكاو نایاپ زا سپ .دش هد یامد رد تارذونان یواح 4 تدم هب لورسیلگ رتسب رد و دارگیتناس هجرد 10 هقیقد تعرس اب rpm 31000 .دیدرگ ژوفیرتناس طسوت تارذونان ییایمیشوکیزیف تایصوصخ یسررب شارپ وپرون یا ( DLS :) تهج و یگدنكارپ صخاش ،هزادنا یسررب اتز لیسناتپ تارذونان ی سد زا ،هدش دیلوت هاگت DLS یامد رد یریگ هزادنا و هدافتسا 60 .دش ماجنا دارگیتناس هجرد :ینورتکلا اوکسورکیم طسوت تارذونان یژولوفروم یسررب صخ یسررب تهج تایصو ینورتکلا اوکسورکیم زا تارذونان یرهاظ SEM .دش هدافتسا هیهت زا سپ تارذونان نازوتیاك یور رب نآ زا یرادقم ، هشیش حطس کی یامد رد و تفرگ رارق یا دیدرگ کشخ قاتا رد .دش هداد ششوپ لاط کزان هیلا کی هلیسوب هنومن سپس . هنومن تیاهن اه .دنتفرگرارق یبایزرا دروم اوکسورکیم طسوت ینزو هدزاب یسررب و :میقتسمریغ شور هب تارذونان رد نیئتورپ سابتحا ب نیا یار تارذونان هکنآ زا سپ روظنم یتنآ یواح نویسناپسوس ،دش هتخاس هنیهب طیارش رد نژ تدم هب لصاح 10 هقیقد یامد رد 4 تعرس اب و دارگیتناس هجرد rpm 31000 لولحم و ژوفیرتناس عمج ییور دوجوم دازآ نیئتورپ رادقم شجنس اب سپس .دش یروآ لولحم رد یتنآ رادقم ،دروفدارب شور طسوت ییور تارذونان رد هدش سوبحم نژ تارذونان سابتحا تیفرظ و نامدنار ،هطوبرم یاه لومرف رد نداد رارق اب و دمآ تسدب رت تارذونان نینچمه .دش هبساحم ك زا سپ زین هدش بی طیارش رد ندش کشخ یدامجنا یارب مه راك نیا .دش هبساحم تارذونان ینزو هدزاب نازیم و نیزوت ، یواح تارذونان BSA نیئتورپ یواح تارذونان مه و بیكرتون سكاویر ماجنا تفریذپ ( 30 و 34 .) نورب یسررب نت ی یتنآ شیاهر :نازوتیاك تارذونان زا نژ شیاهر تاعلاطم ماجنا یارب مجح رد تارذونان هنومن ،نازوتیاك تارذونان زا بیكرتون نیئتورپ 000 رتیلورکیم لولحم SBF= Simulated Body Fluid بویتورکیم نورد 6 یلیم یرتیل اب و هتخیر ندزمه یامد رد هنومن سپس .دش هدنكارپ 19 رکیش رد دارگیتناس هجرد تعرس اب روتابوکنا rpm 600 تدم هب شیاهر و دش هدزمه 376 .دش یسررب تعاس هنومن راب ره رد هنومن ،یرادرب تدم هب اه 30 تعرس اب هقیقد rpm 31000 ژوفیرتناس و هدش 000 لولحم زا رتیلورکیم ور یی نیزگیاج هزات رفاب نازیم نامه هب و هتشادرب رکیش رد و دروفدارب یجنس نیئتورپ شور زا هدافتسا اب سپس .تفرگ رارق روتابوکنا یعمجت دصرد ینحنم و نییعت هنومن رد دوجوم نیئتورپ تظلغ ،رارکت راب هس اب نیئتورپ هدشاهر نامز تدم رد تارذونان زا یاه عت یی ن هدش .دش میسرت ، :نازوتیاك تارذونان هیهت لوط رد بیكرتون نیئتورپ یراگدنام و یرادیاپ یسررب ب یار یراگدنام و یرادیاپ یور رب نازوتیاك هرذونان دیلوت شور یلامتحا ریثأت یسررب لوا تلاح رد .تفرگ رارق یسررب دروم تلاح هس رد نیئتورپ نیا ،بیكرتون نیئتورپ ورپ بیكرتون نیئت هب لولحم mg/ml 6 کیتسادیسا رد نازوتیاك زا 6 % ینزو ( 0 / 4 pH= ) ندرك هفاضا نودب و هفاضا TPP و هرذونان دیلوت زا یریگولج تهج( )نیئتورپ سابتحا مدع رریتسا یور رب تلاح طیارش نامه مود تلاح رد .دش هدز مه یبآ لولحم رد بیكرتون نیئتورپ موس تلاح رد و تفریذپ ماجنا ندزمه نودب لوا ادیسا نودب .دش هدز مه کیتس رد قوف یاهلولحم ،تعاس کی زا سپ تیاهن رد کهاچ لژ یاه SDS-PAGE نایرج تدش اب و قیرزت 60 یلیم زروفورتکلا رپمآ .دیدرگ :یناویح لدم یور تارذونان ینت نورد تاعلاطم یتنآ دیلوت روظنم هب ب و یداب یسرر شوم ،ینمیا خساپ مرس و نسكاو هسسوم زا یروس داژن یاه اس .دندش هیهت یزار یز ینمیا یسررب تهج هورگ هس زا ،ییاز 4 ییات شوم یبیرقت نزو اب 60 -60 مرگ .دش هدافتسا لحارم یمامت رد ، تاناویح یور رب هدش ماجنا یاهراك ، نیناوق اب قباطم هیصوت دوب یهاگشیامزآ تاناویح اب راك هدش . یاهزور رد بیترت هب تبون ود یط یقیرزت تروص هب زیوجت (لوا D0 و ) مهدراهچ ( D14 هدش یراذگراب نازوتیاك تارذونان ،لوا هورگ هب .تفرگ تروص ) دش زیوجت ییاهنت هب بیكرتون نیئتورپ ،مود هورگ هب و بیكرتون نیئتورپ طسوت . هب64
هرود ،لباب یکشزپ مولع هاگشناد هلجم هرامش /متسیب 6 / دادرخ 3179 هت ی ه و زرا ی با ی راذگراب ی ئتورپ ی ن سكاویر ... ؛ یقداص دواد ناراکمه و ،لرتنك ناونع هب زین موس هورگ PBS مود قیرزت زا سپ هتفه کی .دش قیرزت ( D21 نوخ ) تروص یریگ ادجزا سپ و تفرگ یتنآ رتیت نازیم ،مرس یزاس یداب IgG هنومن رد هزادنا میقتسمریغ یازیلاا شور اب اه یرامآ زیلانآ تیاهن رد .دش یریگ هنومن مرن زا هدافتسا اب اه رازفا Statistica تفریذپ ماجنا )نکناد نومزآ( و 00 / 0 p< دش هتفرگ رظن رد راد ینعم .اه هتفای
نیئتورپ صیلخت یددسررب سكاویر : زا یرتكاب زیل زا لددصاح لولحم روبع زا سپ نوتددس Ni-NTA ینیئتورپ دناب ،لوزادیمیا یتظلغ بیددش طددسوت وددشتددسددش و یواح یوشتسش رفاب رد هدش صیلخت لوزادیمیا 600 یلیم زا هك دش هدهاشم رلاوم دوب رادروخرب یبسانم صولخ لکش( 3 .) طسوت تارذونان ییایمیشوکیزیف تایصوصخ یسررب DLS : زا لصاح جیاتن DLS هزادنا یاراد نیئتورپ دقاف تارذونان هك دوب نیا هدنهدناشن 664 و رتمونان 136 / 0 = PDI لکش( 6 هزادنا یاراد نیئتورپ یواح تارذونان و )فلا 391 و رتمونان 371 / 0 = PDI لکش( 6 تارذونان یاتز لیسناتپ نیگنایم نینچمه .دندوب )ب رت هب نیئتورپ یواح و دقاف نازوتیاك ربارب بیت 66 و + 1 / 69 یلیم + لکش(تلو 1 .دوب ) :ینورتکلا اوکسورکیم طسوت تارذونان یژولوفروم یسررب سورکیم ریواصت اوک رف زا لصاح تارذونان حطس ندوب یورك ینورتکلا آ ار هنیهب طیارش رد دیلوت دنی هاگتسد جیاتن ،ریواصت نیا نینچمه .داد ناشن بولطم DLS هزادنا عیزوت هب طوبرم یم دیئات ار تارذونان لکش(درك 4 .) :میقتسمریغ شور هب تارذونان رد نیئتورپ سابتحا و ینزو هدزاب یسررب م هدزاب ریداق نزو ،ی نیئتورپ سابتحا تیفرظ و سابتحا نامدنار سكاویر وتیاك تارذونان رد هب ناز ربارب بیترت 0 / 07 ، 300 و 1 یارب و دصرد BSA ربارب بیترتب لرتنك ناونع هب 6 / 09 ، 1 / 61 و 6 / 0 .دوب دصرد نورب یسررب :نازوتیاك تارذونان زا نیئتورپ شیاهر ینت نورب یسررب جیاتن ت ین زا دعب داد ناشن نازوتیاك تارذونان زا بیكرتون نیئتورپ شیاهر 376 دودح اهنت تعاس 6 نازیم نیا هك دندوب هدش اهر طیحم رد نیئتورپ زا دصرد تایصوصخ فلاخرب یم نازوتیاك تارذونان زا راظتنا دروم یشیاهر دشاب لکش( 0 .) لکش 3 . نیئتورپ صیلخت و نایب هجیتن سكاویر لژ یور رب SDS-PAGE . 3 نوتس زا روبع زا لبق هدش ءاقلا هنومن : Ni-NTA . 6 زا سپ هدش ءاقلا هنومن : .نوتس زا روبع 1 .نیئتورپ یلوکلوم رگناشن : 4 لوزادیمیا( لوا یوشتسش رفاب : 40 mM .) 0 لوزادیمیا( مود یوشتسش رفاب : 600 mM .) 6 رفاب : MES . لکش 6 . نازوتیاك تارذونان هزادنا عیزوت تارذونان )ب ،نیئتورپ دقاف تارذونان )فلا هنیهب طیارش رد نیئتورپ یواح لکش 1 . پ لیسنات یاتز تارذونان تارذونان )ب ،نیئتورپ دقاف تارذونان )فلا نازوتیاك هنیهب طیارش رد نیئتورپ یواح )فلا( )ب( )فلا( )ب(J Babol Univ Med Sci; 20(6); June 2018
60
Preparation and Evaluation of Rivax…; D.Sadeghi, et al
لکش 4 . ینورتکلا اوکسورکیم ریوصت SEM نازوتیاك تارذونان زا لکش 0 . یتنآ شیاهر یعمجت دصرد نازوتیاك تارذونان زا نژ جیاتن :نازوتیاك تارذونان هیهت لوط رد بیكرتون نیئتورپ یرادیاپ یسررب د یسررب ر جیاتن SDS-PAGE لکش( 6 نآ رد هك لوا تلاح هنومن زا یدناب هنوگچیه ) لح بیكرتون نیئتورپ رد هدش اب نازوتیاك لولحم 0 / 4 = pH مه تعاس کی تدم هب لح نیئتورپ هب طوبرم دناب یلو دشن هدهاشم ،دوب هدش هدز وتیاك لولحم رد هدش ناز اب 0 / 4 = pH رد )موس تلاح( بآ رد هدش لح نیئتورپ و )مود تلاح( ندز مه نودب .دش هدهاشم لژ لکش 6 . زروفورتکلا یوگلا یرادیاپ یسررب یراگدنام و وط رد بیكرتون نیئتورپ ل نازوتیاك تارذونان هیهت . 3 لح نیئتورپ : اب نازوتیاك لولحم رد هدش 0 / 4 = pH هك .)لوا تلاح( هدش هدز مه تعاس کی تدم هب 6 لح نیئتورپ : لولحم رد هدش اب نازوتیاك 0 / 4 = pH .)مود تلاح( ندز مه نودب 1 هك بآ رد هدش لح نیئتورپ : تعاس کی تدم هب .)موس تلاح( هدش هدز مه 4 .نیئتورپ یلوکلوم رگناشن : نورد تاعلاطم جیاتن :یناویح لدم یور تارذونان ینت یتنآ رتیت نیرتلااب ب طوبرم یدا ( دوب ییاهنت هب نیئتورپ هدننك تفایرد هورگ هب 016 / 0 ± 606 / 6 هورگ اب هك ) تفایرد ( نیئتورپ یواح تارذونان هدننك 000 / 0 ± 169 / 0 توافت دهاش هورگ و ) ینعم ( تشاد یراد 03 / 0 p< ینعم توافت یرامآ ظاحل زا نینچمه .) نیب یراد هنومن ( دشن هدهاشم هدش یراذگراب تارذونان و دهاش یاه لکش 9 .) لکش 9 . رتیت نیگنایم هسیاقم IgG ریسم زا هدش نمیا یاه شوم مرس رد .)دشاب یم راد ینعم تارییغت هدنهد ناشن هباشم ریغ فورح( یقیرزت
ثحب
و
تن
ی
هج
گ
ی
ر
ی
هدیا تارذونان دیلوت دوجو اب هك داد ناشن قیقحت نیا زا لصاح جیاتن لآ رظن زا ،ییایمیشوکیزیف تایصوصخ تارذونان هیهت لحارم یط رد بیكرتون نیئتورپ و هدش بیرخت ًلاماك نازوتیاك بیكرتون نیئتورپ یراذگراب نیاربانب یر سكاو رد یمن ریذپ ناکما طیحم یدیسا طیارش هب هجوت اب نازوتیاك تارذونان .دشاب ن جیات نرود تاعلاطم نینچمه و ینت نورب شیاهر یسررب نیئتورپ یواح تارذونان ینت بیكرتون سكاویر یم بلطم نیمه دیوم زین .دشاب شور زا یکی ینوی نویسلاژ شور ،نازوتیاك تارذونان تخاس رد جیار یاه یم طیحم رد نازوتیاك ،شور نیا رد .دش هدافتسا نآ زا هعلاطم نیا رد هك دشاب هورگ ندش رادراب تلع هب یدیسا رد ینویتاك یلپ لکش هب نآ رد دوجوم ینیمآ یاه یم و هدمآ هورگ هب دناوت یفنم راب یاراد یاه .دوش لصتم تافسف و تافلوس دننام یرت میدس یلپ یم هك تسا ینوینآ یلپ ،تافسف یاهورین یرارقرب هار زا دناوت هورگ نیب یکیتاتساورتکلا رمیلپ هب نازوتیاك ینیمآ یاه هورگ و دوخ تافسف یاه تبسن نازوتیاك تارذونان تخاس یارب طیارش نیرتهب قیقحت نیا رد .دوش لصتم 3 هب 1 لولحم TPP و نازوتیاك هب pH ربارب 0 / 4 رظنرد نازوتیاك للاحنا یارب نیئتورپ یواح و دقاف نازوتیاك تارذونان هزادنا نیگنایم ،رضاح هعلاطم رد .دش هتفرگ بیترتب 664 و 391 طسوت هدش ماجنا قیقحت رد .دوب رتمونان Bagheripour و ب نیسكوتورون بیكرتون نیئتورپ یراذگراب زا سپ ناراکمه ،موینیلوتو ن تارذونا هدودحم رد نیئتورپ یواح نازوتیاك 610 (دندش دیلوت رتمونان 36 رد نینچمه .) طسوت هك یرگید قیقحت Lee هزادنا اب نازوتیاك تارذونان ،دش ماجنا ناراکمه و 300 ات 600 (دش دیلوت رتمونان 39 .) یم بلطم نیا هدنهد ناشن قوف جیاتن یاك تارذونان هزادنا هك دشاب نازوت رد توافت و هدوب تاعلاطم رگید اب هسیاقم رد یهباشم هدودحم یم یئزج یاه دناوت هب تبسن و دیلوت شور رد یکچوك تارییغت تلع یاتن نینچمه .دشاب داوم فلتخم یاه ج طسوت تارذونان هزادنا یسررب SEM ، جیاتن هدننك دیئات DLS نیا اجنیا رد .دوبa
b
b
0 0/5 1 1/5 2 2/5 3 RiVax یواح نازوتیاک تارذونان RiVax دهاش OD ( 495 رتم ونا ن )66
هرود ،لباب یکشزپ مولع هاگشناد هلجم هرامش /متسیب 6 / دادرخ 3179 هت ی ه و زرا ی با ی راذگراب ی ئتورپ ی ن سكاویر ... ؛ یقداص دواد ناراکمه و هزادنا هك تسا تیمها زئاح هتکن یواح هرذونان تنآ ی نژ یلماع ، عت یی ن هدننك د بذج ر نآ یتسیز تشونرس و تسا زا رتکچوك تارذ و 6 هك هتشاد ار ییاناوت نیا رتمورکیم هرگ رایتخا رد ریپ کلاپ قیرط زا (دنریگ رارق کیرتنازم یوافنل یاه 31 نیا رد .) هب نیئتورپ دقاف و یواح نازوتیاك تارذونان یاتز لیسناتپ ،قیقحت ترت ربارب بی 1 / 69 و + 66 دمآ تسدب + و علاطم جیاتن اب ه Amidi ناراکمه و هك تارذونان دیلوت اب 300 ات 100 یاتز لیسناتپ هب نازوتیاك یرتمونان 36 ات + 10 یلیم + تسد تلو (دنتفای 37 ) دراد یناوخمه پ یارب یمهم لماع ،تارذ یاتز لیسناتپ . نآ یرادیا رد اه رد یرتشیب یرادیاپ ،رتلااب و تبثم یاتز لیسناتپ اب نازوتیاك تارذ و هدوب لولحم (تشاد دنهاوخ لولحم 60 .) Mohammadpour دوخ تاقیقحت رد شناراکمه و شهاك نیئتورپ اب یراذگراب زا سپ نازوتیاك تارذونان یاتز لیسناتپ هك دنداد ناشن یم دبای ( 34 .) Hosseinzadeh تظلغ شیازفا اب دنداد ناشن زین شناراکمه و یم شیازفا نآ یاتز لیسناتپ و تارذونان هزادنا ،نازوتیاك لولحم نینچمه .دبای اب تظلغ شیازفا TPP شهاك نآ یاتز لیسناتپ یلو شیازفا تارذونان هزادنا ، یم (دبای 63 .) ونان رد اتز لیسناتپ تارییغت هدهاشم اب رضاح هعلاطم رد ،عومجم رد ذ تار یم هظحلام لباق تارییغت هك دومن طابنتسا ناوت نیب اتز لیسناتپ نازیم رد یا یتنآ دقاف تارذونان یتنآ یواح تارذونان و نژ ،تلاح ود ره رد و تسا هدادن خر نژ و رگیدکی هب تارذونان لاصتا زا عنام هك دنراد رارق یرادیاپ هدودحم رد تارذونان یم هدیبسچ مه هب تارذ لیکشت دوش . سابتحا تیفرظ و سابتحا نامدنار یسررب یارب رضاح هعلاطم رد نینچمه لولحم رد نیئتورپ تظلغ یسررب اب و میقتسمریغ شور زا تارذونان زا لصاح ییور دش هدافتسا تارذونان بیسرت هك بذج هدنهد ناشن جیاتن 300 رد نیئتورپ یدصرد ئتورپ شیاهر یسررب رد یلو دوب نازوتیاك تارذونان تسدب یوگلا ،تارذونان زا نی یلاح رد ،دوب رظن دروم نامز تدم لوط رد نیئتورپ مك رایسب شیاهر رگناشن ،هدمآ لوط رد ،هباشم تاعلاطم ساسارب هك 9 دازآ نازوتیاك تارذونان زا نیئتورپ رتشیب ،زور یم (دوش 66 دیلوت طیارش رد نیئتورپ ندش هروتاند لامتحا ،جیاتن نیا هب هجوت اب .) یسررب و شیامزآ کی یحارط اب هك دوب حرطم نازوتیاك تارذونان یرادیاپ و نیئتورپ یراگدنام سكاویر رد هك دش صخشم ،یبآ و یدیسا فلتخم طیارش نیئتورپ سكاویر دیلوت یط رد نیاربانب و هدوب ساسح تدش هب یدیسا طیارش هب یم بیرخت نیئتورپ ،نازوتیاك تارذونان لاخرب نیاربانب .دوش نازیم جیاتن ف ،سابتحا چیه زین نازوتیاك تارذونان شیاهر جیاتن هك دوب هدشن تارذونان بذج ینیئتورپ هنوگ هورگ ،ییاهن هلحرم رد نینچمه .دوب رما نیا هدننك دیئات ئتورپ طسوت یشوم یاه نی یتنآ رتیت جیاتن و دندش نمیا نیئتورپ یواح تارذونان و ییاهنت هب یداب نیا رد شوم ن اه بیكرتون نیئتورپ بیرخت هدننك دیئات زی سكاویر لحارم لوط رد یراذگراب نیئتورپ هك تسا هدرك صخشم تاعلاطم طابترا نیمه رد .دوب تارذونان رد یر سكاو لولحم رد نیاربانب و هدوب یمك یرادیاپ یاراد و ساسح نیئتورپ گزاس هك ییاه یرا یم بیرخت دشاب هتشادن نآ اب (دوش 61 .) نیئتورپ ،قیقحت نیا زا لصاح جیاتن ساسا رب سكاویر ك یرادیاپ یاراد رد یم یم نازوتیاك تارذونان دیلوت یدیسا طیارش شور زا دیاب و دشاب ب یرگید یاه یار .درك هدافتسا تارذونان رد نیئتورپ نیا یراذگراب یلك روط هب یم نینچ ناوت هجیتن ا تیفرظ و سابتحا نامدنار یسررب هك تفرگ میقتسمریغ شور هب تارذونان سابتح لمکم شور کی هب زاین و هدوبن تارذونان رد نیئتورپ یراذگراب یعطق هدننك دیئات نیئتورپ یرادیاپ و یراگدنام دیئات تهج یم تارذونان رد یراذگراب لوط رد اه ب دشا نیئتورپ یرادیاپ و یراگدنام دیئات تهج هداس شور کی قیقحت نیا رد هك ه ا رد لوط تارذونان رد یراذگراب .دش هئارا نازوتیاكرکشت و ریدقت
هلیسونیدب زا هاگشناد و )ع( نیسح ماما عماج هاگشناد نارگشهوژپ و ناراکمه دندومن یرای قیقحت نیا ندیسر رمث هب رد ار ام هك )جع( للها هیقب یکشزپ مولع رکشت و ریدقت یم درگ د.J Babol Univ Med Sci; 20(6); June 2018
69
Preparation and Evaluation of Rivax…; D.Sadeghi, et al
Preparation and Evaluation of Rivax Protein Loading in
Chitosan Nanoparticles
D. Sadeghi (PhD) 1, F. Ebrahimi (PhD)1, M. Zeinoddini (PhD)2, Y. Tarverdizadeh (MSc)1,
M. Bakhshi
(PhD)1, M.J. Bageripor (PhD)1, S.M. Agaii (MSc)1
1.Biology Research Center, Faculty of Basic Sciences, Imam Hossein University, Tehran, I.R.Iran 2.Institute of Biotechnology and Science, Malek-Ashtar University of Technology, Tehran, I.R.Iran
J Babol Univ Med Sci; 20(6); June 2018; PP: 62-9
Received: Dec 25th 2017, Revised: Mar 5th 2018, Accepted: Mar 26th 2018.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVE: Ricin toxin is a heterodimer glycoprotein which, due to its high toxicity, is used as a bioterrorism agent. Immunogenicity studies against ricin are now focused on two subunit vaccine candidates, including RiVax and RVEc. These studies have examined the vaccine candidate immunization as an alone and in combination with adjuvant, however, there is not a published study on the immunogenicity evaluation of the candidate vaccine through the delivery by nanoparticles. The aim of this study was preparation and evaluation of RiVax recombinant vaccine-loading in chitosan nanoparticles.
METHODS: In this experimental study, After transferring the RiVax gene to the bacterium, inducing the expression and purification of the RiVax protein by affinity chromatography column, the RiVax protein was loaded with Ionic Gelation method in chitosan nanoparticles. Then, the properties of nanoparticles including size, morphology, loading percentage and release pattern of RiVax protein from nanoparticles and stability of this protein during acidic loading conditions in nanoparticles by SDS-PAGE were evaluated. Also, Immunization study were performed on 3 mouse groups (n=4/group) by RiVax protein, Nanoparticles containing protein and phosphate buffer.
FINDING: The results of this study showed that the nanoparticles containing protein had a size of 178 nm and a Zeta potential of +27.8 MV and a polydispersity index of 0.193. Also, according to SDS-PAGE results, it was found that the RiVax recombinant protein was denatured during the process of preparing the chitosan nanoparticles.
CONCLUSION: The results of this study showed that the RiVax protein has been unstable in acidic conditions for the production of chitosan nanoparticles and Ionic Gelation method is not suitable for loading this protein in chitosan nanoparticles.
KEY WORDS: Chitosan, Nanoparticles, RiVax, Vaccine.
Please cite this article as follows:
Sadeghi D, Ebrahimi F, Zeinoddini M, Tarverdizadeh Y, Bakhshi M, Bageripor MJ, Agaii SM. Preparation and Evaluation of Rivax Protein Loading in Chitosan Nanoparticles. J Babol Univ Med Sci. 2018;20(6):62-9.
Corresponding Author: F. Ebrahimi (PhD)
Address: Biology Research Center, Faculty of Basic Sciences, Imam Hossein University, Tehran, I.R.Iran Tel: +98 21 77104934
61
هرود ،لباب یکشزپ مولع هاگشناد هلجم هرامش /متسیب 6 / دادرخ 3179 هت ی ه و زرا ی با ی راذگراب ی ئتورپ ی ن سكاویر ... ؛ یقداص دواد ناراکمه وReferences
1.Sadeghi D, Ebrahimi F, Zeinoddini M, Hosseini SA, Hedayat Manesh Z. Ricin Toxin; Mechanisms of Toxicity, Diagnosis Methods, Treatment and Immunization Against it. Jundishapur Sci Med J. 2017;16(1):103-24 [In Persian]. 2.O’Hara JM, Brey III RN, Mantis NJ. Comparative Efficacy of Two Leading Candidate Ricin Toxin A Subunit Vaccines in Mice. Clin Vaccine Immunol. 2013;20(6):789-94.
3.Roy CJ, Song K, Sivasubramani SK, Gardner DJ, Pincus SH. Animal models of ricin toxicosis. Curr Top Microbiol Immunol. 2012;357:243-57.
4.Bhaskaran M, Didier PJ, Sivasubramani SK, Doyle LA, Holley J, Roy CJ. Pathology of lethal and sublethal doses of aerosolized ricin in rhesus macaques. Toxicol Pathol. 2014;42(3):573-81.
5.Olsnes S. The history of ricin, abrin and related toxins. Toxicon. 2004;44:361-70.
6.Bramwell VW, Eyles JE, Alpar HO. Particulate delivery systems for biodefense subunit vaccines. Adv Drug Deliv Rev. 2005;57:1247-65.
7.Brey RN, Mantis NJ, Pincus SH, Vitetta ES, Smith LA, Roy CJ. Recent advances in the development of vaccines against ricin. Hum Vac Immunother. 2016;12:1196-201.
8.Smallshaw JE, Richardson JA, Pincus S, Schindler J, Vitetta ES. Preclinical toxicity and efficacy testing of RiVax, a recombinant protein vaccine against ricin. Vaccine. 2005;23(39):4775-84.
9.Smallshaw JE, Richardson JA, Vitetta ES. RiVax, a recombinant ricin subunit vaccine, protects mice against ricin delivered by gavage or aerosol. Vaccine. 2007;25:7459-69.
10.Marconescu PS, Smallshaw JE, Pop LM, Ruback SL, Vitetta ES. Intradermal administration of RiVax protects mice from mucosal and systemic ricin intoxication. Vaccine. 2010;28:5315-22.
11.Roy CJ, Brey RN, Mantis NJ, Mapes K, Pop IV, Pop LM, et al. Thermostable ricin vaccine protects rhesus macaques against aerosolized ricin: Epitope-specific neutralizing antibodies correlate with protection. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112(12):3782-7.
12.Zhao L, Seth A, Wibowo N, Zhao CX, Mitter N, Yu C, et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 2014;32(3):327-37. 13.Wang JJ, Zhao ZW, Xiao RZ, Xie T, Zhou GL, Zhan XR, et al. Recent advances of chitosan nanoparticles as drug carrier. Int J Nanomedicine. 2011;6:765-74.
14.Mohammadpour Dounighi N, Eskandari R, Avadi MR, Zolfagharian H, Mir Mohammad Sadeghi A, Rezayat M. Preparation and in vitro characterization of chitosan nanoparticles containing Mesobuthus eupeus scorpion venom as an antigen delivery system. J. Venomous Anim. Toxins Incl. Trop. Dis. 2012;18(1):44-52.
15.Adlin Jino Nesalin J, Gowthamarajan K, Somashekhara C.N. Formulation and evaluation of nanoparticles containing flutamide. Int.J. ChemTech Res.2009,1(4): 1331-4.
16.Bagheripour MJ, Ebrahimi F, Hajizadeh A, Nazarian Sh, Arefpour MA, Rashidiani J. Preparation of chitosan based botulinum neurotoxin e recombinant nanovaccine and evaluation of its immunogenicity as oral & intradermal route in mice. J RafsanjanUniv Med Sci. 2016;14(11):923-38. [In Persian].
17.Lee E, Park SJ, Lee JH, Kim MS, Kim CH. Preparation of chitosan–TPP nanoparticles and their physical and biological properties. AJPS. 2016;166-7.
18.Yeh P. Ellens H. Smith PL. Physiological considerations in the design of particulate dosage forms for oral vaccine delivery. Adv Drug Deliv Rev. 1998;34(2-3):123-33.
19.Amidi M, Romeijn SG, Borchard G, Junginger HE, Hennink WE, Jiskoot W. Amidi Preparation and characterization of protein-loaded N-trimethyl chitosan nanoparticles as nasal delivery system. J Control Release, 2006; 111:107-116. 20.Gregory AE, Titball R, Williamson D. Vaccine delivery using nanoparticles. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2013; 3:1-13.
J Babol Univ Med Sci; 20(6); June 2018
67
Preparation and Evaluation of Rivax…; D.Sadeghi, et al
21.Hosseinzadeh H, Atyabi F, Dinarvand R, Ostad SN. Chitosan-pluronic nanoparticles as oral delivery of anticancer gemcitabine: preparation and in vitro study. Int J Nanomedicine 2012;7:1851-63.
22.Jarudilokkul S, Tongthammachat A, Boonamnuayvittaya V. Preparation of chitosan nanoparticles for encapsulation and release of protein. Korean J. Chem. Eng. 2011;28(5):1247-51.
