• No results found

Génotoxicité des chimiothérapies et radiothérapies: Quelles sont les conséquences pour le spermatozoïde humain?

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2020

Share "Génotoxicité des chimiothérapies et radiothérapies: Quelles sont les conséquences pour le spermatozoïde humain?"

Copied!
11
0
0

Loading.... (view fulltext now)

Full text

(1)

Andrologie 2002, 12, N ~ 3 284-294

Gdnotoxicitd des chimiothdrapies et radiothdrapies :

Quelles sont les cons( quences

pour le

spermatozo'ide humain ?

L o u i s B U J A N 1, Philippe DE MAS 2

1Groupe de recherche en Fertilite Humaine et CECOS Midi-Pyrdn~es, CHU La Grave, Toulouse

2Service de GdnOtique m~dicale, CHU Purpan, Toulouse

RESUME

Le pronostic des cancers de I'homme jeune en ~ge

de procr6er s'est considdrablement am61ior6 ces

derni6res d6cades grace aux progr~s thdrapeu-

tiques. Les chimioth6rapies et radioth6rapies ont

des effets bien connus sur la spermatogen~se. Au

dela de I'atteinte quantative et qualitative de la sper-

matogen&se, des 6tudes r6alis6es chez I'animal ont

pu mettre en 6vidence des atteintes nucl6aires

(aneuplo'idie, pr6sence d'adduits, fragmentation de

rADN...) et parfois des atteintes au niveau des

g6n6rations FI et F2. Chez rhomme, 1'6tude des

chromosomes des spermatozo'ides apr6s radioth6-

rapie a mis en 6vidence une augmentation de la frd-

quence

des

anomalies

chromosomiques.

Concernant la chimioth6rapie, les premi6res 6tudes

utilisaient la technique de f6condation h6t6rosp6ci-

flque pour mettre en 6vidence les anomalies chro-

mosomiques du spermatozo'ide. Plus r6cemment, la

technique d'hybridation de sondes chromoso-

miques fluorescentes (FISH) permet d'6tudier plu-

sieurs chromosomes sur un grand nombre de sper-

matozoides. Les r6sultats des diff6rentes 6tudes

portant sur des effectifs r6duJts sont variables en

fonction du protocole th6rapeutique administrd et

de la dur6e s6parant le pr61~vement de la fin du trai-

tement. Nous avons 6tudi6 5 patients ayant fait un

pr61bvement de sperme 6 & 17 mois apr~s le proto-

cole de chimiothdrapie BEP (BI6omycin, Etoposide,

Cisplatin). Nous avons mis en 6vidence une aug-

mentation du taux de spermatozo'ides pr6sentant

une aneuplo'idie et une diplo'idie. Les r6sultats de

notre 6tude et de celles du groupe de R. Martin [45,

47] 6voquent la possibilitd d'un effet transitoire de

la chimioth6rapie sur les chromosomes gam6-

tiques. Dans le cadre de la maladie de Hodgkin

d'autres 6tudes ont mis en 6vidence I'aspect transi-

toire de I'effet sur raneuplo'fdie. Au dela de rattein-

te chromosomique, raction d616t~re des traite-

ments pourrait avoir pour cible I'ADN du spermato-

zo'ide. Ainsi des 6tudes sur des effectifs importants,

utilisant d'autres m6todes d'analyse nous parrais-

sent n6cessaires. Dans I'attente, il parait souhai-

table de toujours conseiller I'autoconservation de

sperme avant les traitements et d'adopter une gran-

de prudence Iors du conseil apport6 aux patients

d6sirant une grossesse, prdcoc6ment, apr6s la fin

des traitements.

M o t s c l d s : chimiothdrapie, radioth6rapie, spermatozo'(- de, aneuplo'(die, minisatellites, A D N , effets secondaires, revue

Correspondance :

Dr Louis Bujan - Groupe de Recherche en fertilitd Humaine et CECOS Midi-Pyrdn~es. H6pital La Grave, TSA 60033, 31059 Toulouse Cedex 9. France - Tel 05.61.77.78.41 - Fax 05. 61.77. 78.43 - Email

bujan.l@chu-toulouse.fr

(2)

I. I N T R O D U C T I O N

Le pronostic vital des cancers chez l'homme jeune en age

de procrrer, s'est considrrablement amrlior6 ces demi~res

d6cades grace aux progr~s des thrrapeutiques antinropla-

siques. Si ces th6rapeutiques sont efficaces sur la cellule

cancrreuse, elles ont pour inconv6nient d'affecter d'autres

types cellulaires, et notamment la spermatogrn~se. Ces

effets justifient pleinement l'autoconservation de sperme

qui doit ~tre pratiqure avant tout traitement chez l'homme

en age de procrrer et inform6 [6, 23, 24]. Les effets d616-

t~res de la chimiothrrapie et/ou de la radiothrrapie sur la

production de spermatozoi'des sont maintenant bien connus,

entraSnant un arr~t de la spermatogrn~se qui se traduit par

une azoospermie ou une oligospermie srv~re transitoires ou

parfois drfinitives. L'intensit6 de ces effets va d6pendre du

type d' agent utilisr, de la dose cumulative du principe actif,

ou de la dose totaie d'irradiation revue et de son caract~re

fractionn6 [13, 19, 22, 35, 49, 58]. La susceptibilit6 indivi-

duelle peut 6ventuellement interfrrer sur la normalisation

de la spermatogrn~se apr~s les traitements ainsi que sur

l'rtat de la fonction spermatog6nrtique prralable au traite-

ment. Toutefois, la revue de la littrrature montre que la

dynamique de la restauration de la spennatogrn~se apr~s

les traitements n'est pas prrcisrment abordre, et que peu de

donnres existent sur les deux premieres ann6es apr~s la fin

du traitement chez l'homme.

Au-del~ de l'action drl6t~re sur la spermatog6n~se, entrai-

nant des altrrations quantitatives et qualitatives du sperma-

tozoide, l'action grnotoxique de certains de ces agents a pu

~tre mise en 6vidence chez l'animal entralnant des alt6ra-

tions au niveau du grnome du spermatozoide. L'action d'un

agent drl6t~re sur la spermatogrn~se peut se traduire 1) par

des altrrations qualitatives du spermatozo'ides entrainant

une strrilit6 ou des anomalies nuclraires du spermatozoi'de,

2) par une atteinte des processus de frcondation entrainant

une strrilitr, 3) par des altrrations au niveau du zygote, de

l'embryon et 6ventuellement de renfant ainsi que des altr-

rations comme cela a 6t6 drmontr6 chez l'animal sur la pre-

miere et la deuxi~me grnrration (Figure 1).

La rrsultante d'une action drlrt~re des traitements anti-nro-

plasiques drpendra du type cellulaire atteint, de la sensibi-

lit6 variable en fonction de l'agent et de l'efficience des

mrcanismes des rrparations qui seront mis en place au

niveau testiculaire. Au niveau des spermatozoides cette

action drlrt~re peut avoir pour consrquence la prrsence

d'adduits, l'altrration de I'ADN avec notamment des frag-

mentations de I'ADN, une anomalie num6rique ou structu-

rale des chromosomes secondaire ~ des dysfonctionne-

ments du processus mriotique, une mort cellulaire par

nrcrose ou par mise en jeu du processus apoptotique [53].

I1 a 6t6 drmontr6 que des spermatozoides vivants porteurs

de telles anomalies peuvent 6ventuellement frconder [1] et

donc la potentialit6 d'alt6ration du d6veloppement

embryonnaire est envisageable.

Chez

l'animal du reste, les 6tudes

utilisant le

Cyclophosphamide, la Procarbazine ou la radiothrrapie

font 6tat d'atteinte de la spermatogrn~se, de la fertilit6 mais

6galement de consrquences transmissibles aux grnrrations

suivantes [7, 8, 9, 10, 11, 37, 64, 65]. Chez l'homme

quelques 6tudes cliniques sugg~rent qu'il n ' y a pas d'aug-

mentation de la frrquence des malformations chez les

enfants nrs de p~res ayant eu une chimiothrrapie [14, 17,

29, 41, 57, 59]. Malheureusement beaucoup de ces 6tudes

sont des cas rapportrs ou ont des effectifs tr~s rrduits, ne

permettant pas de drtecter une augmentation de risque rela-

tif de 3 ~ 5 fois [50].

I I . A N O M A L I E S C H R O M O S O M I Q U E S

D U

S P E R M A T O Z O I D E

L'rtude du contenu chromosomique des spermatozoides a

pu ~tre envisagre grace, dans un premier temps, a l'utilisa-

tion du test hrt~rosprcifique de Hamster qui permettait de

visuahser les chromosomes, et dans un deuxi~me temps,

grace aux techniques d'hybridations in situ de sondes fluo-

rescentes, qui permettaient d'envisager l'~tude du nombre

de chromosomes [21, 31, 66] ou la prrsence de cassures

chromosomiques au niveau du spermatozo'ide [62].

Concernant la radioth~rapie, l'rtude des chromosomes des

spermatozoa'des, par le test de f~condation h~trrosp~cifique

de hamster, r~alisre chez neuf patients porteurs de tumeur

testiculaire et quatre patients porteurs d'autres pathologies

tumorales, trait~s par radiothrrapie et recevant des doses

testiculaires de 0,4 ~ 5 Gy, a permis de mettre en 6vidence

une 616vation du pourcentage de spermatozoides porteurs

d'anomalies chromosomiques pour 8 patients 36 mois apr~s

la radiothrrapie [43]. I1 est ~ noter dans cette 6tude (Tableau

1) que d'une part h 12 mois et 24 mois, l'effectif est rrduit

en raison de la faible frcondance des spermatozo'ides et que

d'autre part, peu d'analyses ont 6t6 rralisres en prr-radio-

thrrapie. Nranmoins, les auteurs comparant les rrsultats

36 mois, et les rrsultats moyens obtenus sur l'ensemble des

analyses, montrent une 616vation par rapport au groupe

trmoin pris en rrfrrence. De plus, cette 6tude a montr6 qu'il

existait une relation entre la dose testiculaire reque et le

pourcentage de spermatozoides prrsentant une anomalie

chromosomique (R = 0,88 ; P < 0,02).

En ce qui concerne l'effet des chimioth6rapies plusieurs

6tudes ont 6t6 rralisres [15, 27, 28, 38, 39, 44, 45] certaines

montrant une augmentation de la fr&tuence des anomalies

chromosomiques, alors que d'autres n'en retrouvaient pas

(Tableau 2). Ces 6tudes du caryotype du spermatozo'ide fai-

saient appel ~ la mrthode de frcondation h6trrosprcifique

de hamster, qui ne permet l'analyse que sur un faible

(3)

Anomalies

?

Zygote

, o ,

Anomalies

Anomalies

Figure 1 : Les consdquences d'un agent ddldtbre pour la spermatogenbse peuvent se voir it diff~rents niveaux.

Tableau 1 : Radiothdrapie et anomalies chromosomiques des spermatozo~des, d'aprbs Martin et aL [431.

9 p a t i e n t s a v e c t u m e u r t e s t i c u a i r e :

4 p a t i e n t s a v e c t u m e u r n o n t e s t i c u l a i r e :

doses t e s t i c u l a i r e s : 0.4 - 3.1 G y d o s e s t e s t i c u l a i r e s : 0.5 - 5.0 G y

% a n o m a l i e s (*)

Pr6 radioth6rapie (RT) 0 (0/9)

Post RT 12 mois n=2 13 ( I / 8 )

24 mois n=3 13 (7/55)

36 mois n=8 21 (18/86)

m o y e n n e 18 (26/149)

T 6 m o i n s 8.5 (85/1000)

(*) Nombre de caryotypes spermatiques anormaux /nombre 6tudids

Dose % anomalies

testiculaire h 36 mois

0.4 6

0.5 15

0.8 16

0.8 20

0.9 4 6

1.0 67

1.6 25

r = 0.88, p<0.02

(4)

nombre de spermatozo~des, spermatozo~des qui doivent 8tre

capables de f6conder pour la r6alisation du test. La variabi-

lit6 des r6sultats peut s'expliquer par ce biais de s61ection,

par les diff6rences de traitement et le type de cancer 6tudi6

(Tableau 2). Plus r6cemment s'est d6velopp6e la technique

d'hybridation in situ de sondes chromosomiques fluores-

centes (FISH) sur les noyaux du spermatozoide.

L'am61ioration de cette technique avec notamment l'hybri-

dation simultan6e de plusieurs sondes chromosomiques

avec des fluorochromes diff6rents (double et triple marqua-

ge), permet de d6tecter des anomalies num6riques de plu-

sieurs chromosomes et d'6valuer la ploidie des spermato-

zo'fdes en m~me temps, sur un grand nombre de cellules ou

de d6tecter pour des techniques plus r6centes certaines ano-

malies structurales des chromosomes. Ainsi, une 6tude r6a-

lis6e chez 4 patients ayant une chimioth6rapie (protocole

BEP : B16omycin, Etoposide, Cisplatin) pour tumeur [46]

testiculaire ne montre pas de diff6rence dans la fr6quence

de l'aneuploidie des spermatozoides avant ou apr6s chimio-

th6rapie (suivi du premier patient : 2 ans; deuxi~me patient

: 3 ans ; troisi~me patient : 9 ans ; quatri6me patient : 7 ans)

(Tableau 3). I1 s'agit des m~mes patients qui avaient 6t6 6tu-

di6s par Martin et al. [45], avec le test h6t6rosp6cifique de

Hamster, sans montrer d'augmentation des anomalies au

niveau des chromosomes des spennatozo~des. Plus r6cem-

ment le m~me groupe [47] a 6tudi6 un patient porteur d'une

tumeur testiculaire trait6e par BEP, mais durant la chimio-

th6rapie, et un an apr~s la fin de la chimioth6rapie (Tableau

3). Chez ce patient 6tudi6, donc pr6cocement apr~s la chi-

mioth6rapie, une augmentation du taux de spermatozoides

pr6sentant une aneuplo'fdie a 6t6 raise en 6vidence.

En cas de maladie de Hodgkin, une augmentation du taux

d'aneuplo'fdie a 6t6 rapport6 chez neuf patients qui ont 6t6

6tudi6s par deux groupes (Tableau 3). Chez huit patients

trait6s par NOVP (Novanthrone, Oncovin, Vimblastine,

Prednisone) et une irradiation compl6mentaire pour mala-

die de Hodgkin [54], une augmentation de l'aneuplo'/die des

spermatozo'fdes d ' u n facteur 5 a 6t6 mise en 6vidence

durant la chimioth6rapie avec une diminution de l'aneu-

plo~die 100 jours apr~s l'arrSt de la chimioth6rapie. Chez un

patient trait6 par Vimblastine et radioth6rapie (dose testicu-

laire cummul6e de 0.5Gy) une augmentation de l'aneuploi-

die est retrouv6e h la fin du traitement et 38 jours apr~s [51 ].

L'ensemble de ces demi~res 6tudes pourrait sugg6rer un

effet transitoire de la chimioth6rapie ou de la radioth6rapie

sur l'aneuploidie des spermatozoides.

Pour notre part, nous avons 6tudi6 r6cemment l'aneuploidie

dans les spermatozoYdes de patients trait6s pour cancer du

testicule, 6 ~ 17 mois apr~s deux h quatre cures de BEP

[25]. U s'agissait de patients suivis au CECOS Midi-

Pyr6n6es dans le cadre de leur autoconservation de sperme,

qui 6taient volontaires pour r6aliser un suivi apr~s la fin de

la chimioth6rapie et ont donn6 leur consentement h 1' analy-

se de leurs spermatozo'fdes par FISH. Ne pouvant ufiliser

les spermatozoides pr6-th6rapeutiques qui 6taient conserv6s

en pr6vention de l'atteinte de la fertilit6, nous avons com-

par6 les r6sultats obtenus chez ces hommes, ~t 5 hommes

appari6s sur l'ftge, volontaires sains. Le fait que les hommes

atteints de cancer du testicule, avant traitement, n'ont pas

d'augmentation de l'aneuplo'idie par rapport h des hommes

t6moins sains [2], permet cette comparaison. Nous avons

donc utilis6 la technique de l'hybridation in situ de sondes

centrom6riques fluorescentes pour les chromosomes, 7, 16,

18, X et Y permettant ainsi l'6tude de plusieurs chromo-

somes sur un tr~s grand nombre de cellules. Sans d6tailler

la technique, la d6condensation nucl6aire indispensable h

l'hybridation est r6alis6e par du dithiothreitol et du diiodo-

salicylate de lithium. Une double hybridation est ainsi r6a-

lis6e sur chaque 6chantillon de sperme : une hybridation

avec les sondes centrom6riques des chromosomes 7 et 16

et une hybridation avec les sondes centrom6riques des chro-

mosomes X, Y e t 18. Pour chaque hybridation sont analy-

s6s 10 000 spermatozoides ce qui repr6sente l'analyse de 20

000 spermatozo~des par 6chantillon. Cette 6tude permet de

mettre en 6vidence une anomalie du nombre de chromo-

somes par spermatozo'ide, soit une dysomie, soit une diplol-

die (Figure 2). Le fait que nous ayons obtenu des r6sultats

similaires, tant chez les t6moins que chez les patients apr~s

chimioth6rapie, en ce qui concerne le taux de spermato-

zo~des diplo~des sur chaque hybridation, conforte la repro-

ductibilit6 de nos r6sultats.

Nous avons ainsi montr6 (Tableau 4) qu'il existait une aug-

mentation significative du pourcentage de spennatozo~des

porteurs d'une disomie 16, 18 et d'une disomie XY. Par

ailleurs, notre 6tude a mis en 6vidence 6galement, une aug-

mentation de la diplo~die qui est multipli6e environ par un

facteur 3.

Cette augmentation de l'aneuploidie met en 6vidence ainsi

une anomalie de la disjonction chromosomique lors de la

m6iose. Les inhibiteurs de la topoisom6rase comme la bl6o-

mycine ou l'6toposide peuvent 8tre impliqu6s dans ce

trouble de la disjonction m6iotique. Une 6tude r6cente [42],

chez la souris, a montr6 que l'6toposide provoquait une

augmentation des anomalies des chromosomes au niveau

des spermatocytes avec notamment une augmentation, d'un

facteur 28, des aberrations chromosomiques au niveau du

spermatocyte pachyt~ne et par un facteur 13 au niveau du

spermatocyte pr6-1eptot~ne. Ces anomalies peuvent 8tre

transmises ~ la descendance comme en t6moigne l'augmen-

tation de l'aneuplo~die sur les zygotes obtenus [42].

Si l'on reprend l'ensemble des 6tudes concernant l'effet de

la chimioth6rapie de type BEP sur le spermatozoide mon-

trant chez l'homme une augmentation de la fr6quence des

anomalies chromosomiques au niveau du spermatozo'ide

(5)

Tableau 2 : Anomalies c h r o m o s o m i q u e s des spermatozo~des (test h~te'rosp~cifique de hamster) et chimioth~rapie

( - : a b s e n c e d ' e f f e t ; + : e f f e t positiJ).

temps apr~s Anomalies

Cancer n traitement traitement S N

G e n e s c a et al. 1990 [28] T G N S 2 PVB _+ B E P 2 - 5 ans + +

J e n d e r n y et al. 1992 [39] TS 1 P V B 9 mois

M a r t i n et al. 1995 [44] L y m p h o m e 1 M A C O P - B 3 ans

A n o m a l i e s c h r o m o s o m i q u e s : S = structurales, N = num~riques. T G N S = t u m e u r germinale n o n s d m i n o m a t e u s e . T S = t u m e u r s#minomateu- se. B E P = bleomycine, etoposide, cisplatine. D a c t = D-actinomycine. P V B = cisplatine, virnblastine, b l e o m y c i n e . C Y V A D I C = cyclophos- pharnide, adriamycine, vincristine, dicarbazine. V A C = vincristine, adriamycine, cyclophosphamide. M O P P = m o u t a r d e d'azote, vincristine, procarbazine, prednisone. M A C O P - B = methotrexate, doxorubicine, cyclophosphamide, vincristine, p r e d n i s o n e . R T = radioth~rapie.

Tableau 3 : Anomalies c h r o m o s o m i q u e s des spermatozo~les (FISH) et chimiothdrapie ( - : absence d'effet ; + : effet positiJ). temps aprbs anomalies

Cancer n traitement traitement namdriques

R o b b i n s et al. 1997 [54] H o d g k i n 8 N O V P 0 j o u r +

100 j ours

M a r t i n et al. 1999 [47] T G N S 1 B E P

38 jours +

0 j o u r +

l a n +

TGNS = tumeur germinale non sdminomateuse. BEP = bleomycine, etoposide, cysplatine. NOVP = novanthrone, vincristine, vinblastine, prednisone.

Vinbla = vinblastine. R T = radiothdrapie.

(6)

Figure 2 : Hybridation in situ de sondes chromosomiques fluorescentes sur le spermatozo~de humain (sondes pour les chromosomes 7, 16, 18, X et Y). Etude de patients ayant eu une chimiothdrapie et d'un groupe tdmoin.

dans les deux premieres anntes et pas d'augmentation entre

2 et-13 ans, la question d'un effet dtltt~re transitoire sur la

spermatogtn~se se pose.

Pour confirmer cela, il est n6cessaire de rtaliser des 6tudes

sur des stries plus importantes, et il serait opportun d'ttu-

dier la dynamique de la frtquence de ces anomalies lors de

la rtcuptration de la spermatogtn~se. Dans l'attente, il

semble peut ~tre souhaitable de difftrer de deux ans, un

projet parental ou d'utiliser des paillettes autoconserv6es

avant la chimioth6rapie plut6t que du sperme frais dans la

premiere et 6ventuellement la deuxi~me annte.

I l L A N O M A L I E S

INFRACHROMOSOMIQUES

si la pr6sence d'anomalies chromosomiques au sein du

gamete male peut 8tre h l'origine d'anomalies chromoso-

miques dans la descendance, qu'en est-il d'atteintes infra-

chromosomiques du g6nome ? On sait actuellement que la

qualit6 du noyau des spermatozo'fdes est impliqu6e dans le

d6veloppement embryonnaire. Par exemple, l'architecture

de la chromatine du sperrnatozo'fde influencerait l'initiation

et la r6gulation de l'activit6 du g6nome paternel au d6but du

d6veloppement embryonnaire [32]. Dans ce sens, des ano-

malies du g6nome paternel ont 6t6 d6crites lors d'6chec du

d6veloppement embryonnaire [52, 55, 56]. Des alt6rations

de I'ADN du spermatozoide ont 6t6 6galement rapporttes

apr~s exposition h difftrents agents comme les radicaux

libres [30, 36, 60], les toxiques [40, 63] ou l'irradiation [61,

33]. I1 a 6t6 suggtr6 que ces alt6rations seraient dues ~ des

phtnom~nes d'apoptose au niveau des cellules germinales

et testiculaires [3] et rtcemment des preuves de fragmenta-

tion de I'ADN g6ntrte par un processus apoptoptique ont

6t6 observ6es au niveau des spermatozo'ides 6jacul6s [12].

Cependant, il ne semble pas licite de r6duire les atteintes de

I'ADN au processus d'apoptose [26]. En effet si l'on prend

l'exemple du protocole BEE les drogues utilis6es sont sus-

ceptibles d'entrainer des 16sions de I'ADN, la B16omycine

est un agent cytotoxique g6ntrant des cassures de I'ADN

[16], le Cisplatine est un alkylant qui induit des ponts intra

et inter brins ainsi que de volumineux adduits [20, 34],

l'6toposide un inhibiteur de la topoisomtrase [42].

Plusieurs tests devraient se dtvelopper prochainement pour

analyser les constquences des traitements anti-ntopla-

siques sur le gtnome du spermatozoide.

Actuellement deux types d'ttudes ont 6t6 rtalists : d'une

part, la recherche des mutations dans les stquences minisa-

tellites chromosomiques, et d'autre part, l'6tude de la frag-

mentation de I'ADN du spermatozoide. Trois 6tudes [4, 48,

67] ont recherch6 des mutations dans les s6quences minisa-

tellites chez 15 patients trait6s par chimiothtrapie et/ou

radiothtrapie (Tableau 5). Chez un patient trait6 par MOPP

(7)

Tableau 4 : Etude de l'aneuplo~die de spermatozo~des de 5 patients ayant eu une chimioth6rapie par BEP et de spermatozo'fdes de 5 hommes t~moins.

P a t i e n t s a p r ~ s C h i m i o t h ~ r a p i e

T ~ m o i n s

T

P

S

G

B

M o y

M o y

1

2

3

4

5

d i s o m i e 7

0,10

0,05 0,04 0,11

0,05 0,070

0,044

0,09

0,03

0,02

0,05

0,03

d i s o m i e l 6

0,10

0,10 0,08 0,09

0,08 0,090*

0,046

0,04

0,04

0,06

0,03

0,06

d i s o m i e 1 8

0,06

0,04 0,03 0,06

0,03 0,044**

0,014

0,01

0,00

0,01

0,02

0,03

d i s o m i e X

0,02

0,02 0,03 0,03

0,04

0,028 0 , 0 3 0

0,01

0,05

0,04

0,03

0,02

d i s o m i e Y

0,01

0,04 0,02 0,07

0,02

0,032 0 , 0 0 8

0,00

0,00

0,01

0,01

0,02

d i s o m i e X Y

0,14

0,13 0,15 0,27

0,24 0,186"** 0,072

0,07

0,08

0,07

0,05

0,09

d i p l o s a

0,29

0,29 0,16 0,11

0,42 0254*** 0,094

0,10

0,06

0,10

0,09

0,12

diplohtie b

0,49

0,24 0,16 0,20

0,28 0274*** 0,080

0,07

0,04

0,06

0,13

0,10

V a l e u r s e x p r i m ~ e s en p o u r c e n t a g e s .

C o m p a r a i s o n a v e c g r o u p e t ~ m o i n : t e s t Z 2 : * p < 0 , 0 5 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001 a : H y b r i d a t i o n c h r o m o s o m e s 7 et 16 ; b : h y b r i d a t i o n c h r o m o s o m e s 18, X, et Y

pour maladie de Hodgkin il a 6t6 mis en 6vidence, une aug-

mentation de la fr6quence des mutations dans les s6quences

minisatellites et ceci 15 ans apr~s la fin de la chimioth6ra-

pie. Bien que la chimioth6rapie utilis6e dans ce cadre l~t ait

6t6 une chimioth6rapie lourde, les auteurs se posaient la

question de savoir si cette augmentation ne pouvait pas ~tre

en partie li6e au vieillissement du patient.

Une seule 6tude (Tableau 6) r6alis6e chez un patient porteur

d'une leuc6mie lymphoide chronique a 6tudi6 la fragmenta-

tion de I'ADN du spermatozoide par le test du comet essai

[18]. L'6tude est difficile ~ interpr6ter car le patient a eu une

chimioth6rapie par sept cycles de fludarabine mais avait eu

9 mois auparavant un cycle de chlorambucil et de plus avait

eu une protection par analogues du GnRh durant 6 mois,

protection d6but6e un mois avant la chimioth6rapie. I1 est

apparu au 7e mois de la chimioth6rapie une augmentation

du pourcentage de cellules poss6dant un ADN fragment6.

La question de savoir si le GnRh n'a pas eu une action pro-

tectrice se pose, ce patient pr6sentant, au 7e mois de sa chi-

mioth6rapie, 200 millions de spermatozoides par ml.

t~res ont ~t~ d~crits s u r la spermatog~n~se mais ~gale-

ment sur les g~n~rations F1 et F2, le fait que chez l'hom-

me on ait pu m e t t r e en ~vidence des anomalies de la fr~-

quence de raneuplo'idie des spermatozo'ides p e n d a n t ou

dans les suites de la chimioth~rapie, doit inciter ~ la pru-

dence en ce qui concerne les conseils donn~s aux couples

qui d~sirent devenir parents, d u r a n t les phases de trai-

tement et dans les suites proches du traitement ainsi

qu'~ventuellement d u r a n t les phases de r~cup~ration de

la spermatog~n~se. Ii nous a p p a r a i t n~cessaire de pour-

suivre les ~tudes s u r les effets des traitements anti-n~o-

plasiques sur ie g~nome d u gamete male en utilisant plu-

sieurs outils d ' a n a l y s e p o u r identifier ses effets (~tude de

l'aneuplo'idie, de la f r a g m e n t a t i o n de I'ADN, des muta-

tions dans les s~quences minisatellites, recherche d ' a d -

duits...). II est n~cessaire de r~aliser ces ~tudes de

mani~re pr~coce apr~s la fin de la chimioth~rapie ou de

la radioth~rapie et de mani~re r~p~t~e dans le b u t

d'avoir plusieurs points de surveillance, et de pouvoir

dire si les effets sont r~versibles et dans quel temps ils

sont r~versibles.

IV. C O N C L U S I O N

L'ensemble des ~tudes r~alis~es ~ ce j o u r sont contra-

dictoires mais il semble a p p a r a l t r e un effet des chimio-

therapies et radioth~rapies sur |e n o m b r e de chromoso-

me ou les alterations de r A D N dans les suites proches

du traitement. Le fait que chez l'animal, des effets d~l~-

Dans l'attente, nous r e p r e n d r o n s les r~flexions de

Arnon et coll. [5] qui, passant en revue les effets

g~niques et t~ratog~niques des traitements anticanc~-

reux sur les gametes et les embryons, sugg~rent que les

grossesses des patients a y a n t ~t~ trait~s p o u r un cancer,

soient pr~cis~ment m o n i t o r i e s et que toute anomalie ou

incident soit r~pertori~. Ils soulignent qu'actuellement il

(8)

Tableau 5 : R e c h e r c h e de mutations dans les s~quences minisatellites ( - : absence d'effet ; + : effet positif).

Pathologies n traitement effet

Armour et al.

glomerulon~phdte

1

1999 [4]

lymphome

1

cyclophosphamide 2,2g

Cyclo/EtopNin/Doxo + RT

Zengh et al.

Hodgkin

4

NOVP+RT

2000 [67]

2

CVPP/ABDIC + RT

1

MOPP

2

ABVD

1

NOVP

May et al.

seminomes

3

RT 0.38 - 0.82 Gy

2000 [48]

Tableau 6 : Fragmentation de l ' A D N des spermatozo~des aprbs chimiothdrapie, d'aprbs Chatterjee et aL [18].

1 leuc~mie lympho'='de chronique

7 cycles fludarabine (45,8mglcycle)

1 cycle de chlorambucil (2mglj x 15) 9 mois

avant

GnRh 6 mois, d6but~ 1 mois avant chimioth(~rapie

mois Spermatozo'fdes/ FSH LH L. Comet M. C o m e t 6jacul&t mUll mUll pm unit

0

2 5 0 x 106

8.2

6.7

54.0:1:1.5

10+ 1.7

1

10 x 106

23.4

19.9

50.1 + 0.6

6.7 + 0.2

7

200 x 106

11.6

8.2

67.6 + 0.5 *

14.8 + 0.2 *

18

160 x 106

9.2

8.0

54.0 _+ 1.4

7.5 + 0.1

* difference significative avec valeurs au temps 0.

L. Comet : Iongueur ; M. Comet : moment de la com6te qui est le produit de la migration par le pourcentage d'ADN

dans la queue de la com~te.

(9)

e s t n ~ c e s s a i r e d e m o n t r e r u n e e x t r e m e p r u d e n c e l o r s d u c o n s e i l ~ a p p o r t e r ~ n o s p a t i e n t s .

R e m e r r :

N o t r e ~ t u d e a b r n r f i c i 6 d ' u n e s u b v e n t i o n d e l ' A s s o c i a t i o n d e R e c h e r c h e c o n t r e le C a n c e r ( A R C 9 6 9 8 ) .

R E F E R E N C E S

1. A H M A D I A., NG S.C. : Developmental capacity of damaged spermatozoa. Hum. Reprod., 1999, 14 : 2279-2285.

2. ALVAREZ R., TUSELL L., G E N E S C A A., MIRO R., GARCIA- D E L - M U R O X., E G O Z C U E J. : Absence of chromosomal insta- bility of m e n affected by testicular cancer. Hum. Reprod., 1999, 14 : 247-251.

3. ARAVINDAN G.R., BJORDAHL J., JOST L.K., EVENSON D.P. : Susceptibility of human sperm in situ D N A denaturation is strongly correlated with D N A strand breaks identified by single- cell electrophoresis. Exp. Cell Res., 1997, 236 : 231-237. 4. A R M O U R J.A.L., B R I N K W O R T H M.H., K A M I S C H K E A. :

Direct analyses by small PCRof MS205 minisatellite mutation rates in sperm after mutagenic therapies. Mutat. Res., 1999, 445 : 73-80.

5. A R N O N J., M E I R O W D., L E W l S - R O N E S S H., ORNOY A. : Genetic and teratogenic effects of cancer treatments on gametes and embryos. Hum. Reprod. Upd., 2001, 4 : 349-403.

6. A U G E R J., K U N T S M A N N J.M., C Z Y G L I K E, J O U A N N E T P.: Conservation du sperme avant traltement anticancrreux : une mesure efficace pour prrserver les chances de conception future. Contr. Fertil. Sex., 1993, 21 : 749-752.

7. A U R O U X M. : Chimiothrrapie anticancrreuse chez le male : risques pour la descendance. Andrologie, 1995, 5 : 465-475.

8. A U R O U X M., DULIOUST E. : Cyclophosphamide in the male rat : Behavioral Effects in the Adult Offspring. Behav. Res., 1985,

16 : 25-36.

9. A U R O U X M., DULIOUST E., NAWAR N.N.Y., YACOUB S.G.: Antimitotic Drugs (Cyclophosphamide and Vinblastine) in the male rat : Deaths and Behavorial Abnormalities in the Offspring. J. Androl., 1986, 7 : 378-386.

10. A U R O U X M., DULIOUST E., NAWAR N.N.Y., YACOUB S.G., K E M P F E.H., EBEL A.B. : Cyclophosphamide in the male rat : cerebral biochemical changes in progeny. Biomed. Pharmacother., 1990, 44 : 519-523.

11. A U R O U X M., D U L I O U S T E., SELVA J., R I N C E P. : Cyclophosphamide in the FO male rat : physical and behavorial changes in three successive adult generations. Mutat. Res., 1990, 229 : 189-200.

12. B A C C E T T I B., COLLODEL G., P I O M B O N I P. : Apoptosis in h u m a n ejaculated sperm cells. J. Submicrosc. Cytol. Pathol., 1996, 28 : 587-596.

13. B A C H A U D J.M., ALZIEU C., B U J A N L. : Effets de la radio- thrrapie sur la fonction testiculaire de l'adulte. Andrologie, 1995, 5, : 476-485.

14. BLA'IT J., MULVIHILL J.J., Y O U N G R.G., P O P L A C K D.G. : Pregnancy outcome following cancer chemotherapy. Am. J. Med., 1980, 69 : 828-832.

15. B R A N D R I F F B., MEISTRICH M., G O R D O N L., C A R R A N O

A., LIANG J. : Chromosomal damage in sperm of patients survi- ving Hodgkin's disease following M O P P (nitrogen mustard, vin- cristine, procarbazine and prednisone) therapy with and without radiotherapy. Hum. Genet., 1994, 93 : 295-299.

16. BUSCHINI A., ALESSANDRINI C., MARTINO A. et al. : Bleomycin genotoxicity and amifostine (WR-2721) cell protec- tion in normal leukocytes vs. K562 tumoral cells. Biochem. Pharmacol., 2002, 7116 : 1-9.

17. BYRNE J., MULVIHILL J., CONNELLY R. et al. : Reproductive problems and birth defects in survivors of Wilms'tumor and their relatives. Med. Pediatr. Oncol., 1988, 16 : 233-240.

18. CHATTERJEE R., HAINES G.A., PERERA D.M.D., GOLD- STONE A., MORRIS I.D. : Testicular and sperm DNA damage after treatment with fludarabine for chronic lymphocytic leukae- mia. Hum. Reprod., 2000, 15 : 762-766.

19. C H E V R E A U C., H U G U E T E : Chimiothrrapie anticancrreuse et fertilit6 masculine. Andrologie, 1995, 5 : 458-464.

20. COHEN S.M., LIPPARD S.J. : Cisplatin : from D N A damage to cancer chemotherapy. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 2001, 67 : 93-130.

21. COONEN E., PIETERS M., D U M O U L I N J. et al. : Nonisotopic in situ hybridization as a method for nondisjunction studies in human spermatozoa. Molec. Reprod. Develop., 1991, 28 : 18-22.

22. COSTABILE R.A. : The effects of cancer and cancer therapy on male reproductive function. J. Urol., 1993, 149 : 1327-1330. 23. C Z Y G L I K E, A U G E R J., ALBERT M., DAVID G. : L'auto-

conservation du sperme avant thrrapeutique strrilisante. Nouvelle Presse Medicale, 1982, 11 : 2749-2752.

24. D A U D I N M., B U J A N L. : Place et r r l e des CECOS en cancrro- logie : prrservation de la fertilit6 avant traitement anticancrreux. Oncologie, 2000, 2 : 402-412.

25. DE MAS P., D A U D I N M., V I N C E N T M.C. et al. : Increased aneuploidy in spermatozoa from testicular tumour patients after chemotherapy with cisplatin, etoposide and bleomycin. Hum. Reprod., 2001, 16 : 1204-1208.

26. EVENSON D.P., L A R S O N K.L., JOST L.K. : Sperm chromatin structure assay : its clinical use for detecting sperm DNA frag- mentation in male infertility and comparaisons with other tech- niques. J. Androl., 2002, 23 : 25-43.

27. GENESCA A., CABALLIN M., M I R O R,, BENET J., BONFILL X., EGOZCUE J. : H u m a n sperm chromosomes : long-term effect of cancer treatment. Cancer Genet. Cytogenet., 1990, 46 : 251- 260.

28. GENESCA A., MIRO R., C A B A L L I N M., B E N E T J., GERMA J., EGOZCUE J. : Sperm chromosome studies in individuals trea- ted for testicular cancer. Hum. Reprod., 1990, 5 : 286-290. 29. G R E E N D., Z E V O N M., L O W R I E G. : Congenital abnormalities

in children of patients received chemotherapy for cancer in child- hood or adolescence. N. Engl. J. Med., 1991, 325 : 141-146. 30. G R I V E A U J.E, L E L A N N O U D. : Effects of antioxydants on

human sperm preparation techniques. Int. J. Androl., 1994, 17 : 225-231.

31. G U T T E N B A C H M., SCHMID M. : Determination of Y chromo- some and aneuploidy in human sperm nuclei by non radioactive in situ hybridization. Am. J. Hum. Genet., 1990, 46 : 553-558. 32. H A A F T., WARD D.C. : Higher order nuclear structure in mam-

malian sperm revealed by in situ hybridization and extended chromatin fibers. Exp. Cell Res. 1995, 219 : 604-11.

(10)

33. HAINES G.A., H E N D R Y J.H., D A N I E L C.E, M O R R I S I.D. : Increased levels o f comet-detected spermatozoa D N A damage following in v i v o isotopic or X-irradiation of spermatogonia. Mutat. Res., 2001, 495 : 21-32.

34. H O O S E R S., VAN D I J K - K N I J N E N B U R G W., W A A L K E N S - B E R E N D S E N I. : Cisplatin-DNA adduct formation in rat sper- matozoa and its effect on fetal development. Cancer Lett., 2000, 3 : 71-80.

35. H O W E L L S.J., S H A L E T S.M. : Testicular function following chemotherapy. Hum. Reprod. Update, 2001, 7 : 363-369.

36. H U G H E S C.M., L E W I S S.E.M., McKEVEY-MARTIN V.J., T H O M P S O N W . : A comparison of baseline and induced D N A damage in human spermatozoa from fertile and infertile men, using a modified comet assay. Mol. Hum. Repred., 1996, 2 : 613- 619.

37. J E G O U B., V E L E Z D E L A C A L L E J.E, B A U C H E F. : Protective effect of medroxyprogesterone acetate plus testostero- ne against radiation induced damage to the productive function o f male rats and their offspring. Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, 88 : 8710-8714.

38. J E N D E R N Y J., R O H R B O R N G. : Chromosome analysis of human sperm.1. First results with a modified method. Hum. Genet., 1987, 76 : 385-388.

39. J E N D E R N Y J., J A C O B I M., R U G E R A., R O H R B O R N G. : Chromosome aberrations in 450 sperm complements from eight controls and lack o f increase after chemotherapy in two patients. Hum. Genet., 1992, 90 : 151-154.

40. JOFFE M., LI Z. : Male and female factors in fertility. Am. J. Epidemiol., 1994, 140 : 921-929.

41. LI EP., J A F F E M. : Progeny of chilhood cancer survivors. Lancet, 1974, 2 : 704-714.

42. M A R C H E T r I E , B I S H O P J.B., L O W E X., G E N E R O S O W.M., HOZIER J., W Y R O B E K A . J . : Etoposide induces heritable chro- mosomal aberrations and aneuploidy during male meiosis in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2001, 98, 3952-3957.

43. M A R T I N R., H I L D E B R A N D K., Y A M A M O T O J. : An increa- sed frequency of human sperm chromosomal abnormalities after radiotherapy. Mutat. Res., 1986, 174 : 219-225.

44. M A R T I N R., R A D E M A K E R A., L E O N A R D N. " Analysis of chromosomal abnormalities in human sperm after chemotherapy by karyotyping and fluorescence in situ hybridization (FISH). Cancer Genet. Cytogenet., 1995, 80 : 29-32.

45. MARTIN R., E R N S T S., R A D E M A K E R A., B A R C L A Y L., K O E., S U M M E R S N . : Analysis o f human sperm karyotypes in tes- ticular cancer patients before and after chemotherapy. Cytogenet. Cell Genet., 1997, 78 : 120-123.

46. MART1N R., E R N S T S., R A D E M A K E R A., B A R C L A Y L., K O E., S U M M E R S N . : Chromosomal abnormalities in sperm from testicular cancer patients before and after chemotherapy. Hum. Genet. 1997, 99 : 214-218.

47. M A R T I N R., E R N S T S., R A D E M A K E R A., B A R C L A Y L., K O E., S U M M E R S N. : Analysis of sperm chromosome comple- ments before, during and after chemotherapy. Cancer Genet. Cytogenet., 1999, 108 : 133-136.

48. MAY C.A., T A M A K I K., N E U M A N N R. et al. : Minisatellite mutation frequency in human sperm following radiotherapy. Mutat. Res., 2000, 453 : 67-75.

49. M E I R O W D., S C H E N K E R J. : Cancer and male infertility. Hum. Reprod., 1995, 10 : 2017-2022.

50. M E I S T R I C H M . : Potential genetic risks of using semen collec- ted during chemotherapy. Hum. Reprod., 1993, 8 : 8-10.

51. M O N T E I L M., R O U S S E A U X S., C H E V R E T E., P E L L E T I E R R., C O Z Z I J., S E L E B. : Increased aneuploid frequency in sper- matozoa from a Hodgkin's disease patient after chemotherapy and radiotherapy. Cytogenet. Cell Genet., 1997, 76 : 134-138.

52. M O R T I M E R D . : The future of male infertility m a n a g e m e n t and assisted reproduction technology. Hum. Reprod. 2000, 15 : 98-

l l 0 .

53. R O B A I R E B. 9 Mechanisms o f action o f cyclophosphamide as a male-mediated d e v e l o p m e n t a l toxicant. Second international conference on Male-Mediated Developmental Toxicity. Montreal, 2002, in press.

54. R O B B I N S W., M E I S T R I C H M., M O O R E D. et al. : Chemotherapy induces transient sex chromosomal and autosomal aneuploidy in human sperm. Nature Genetics, 1997, 16 : 74-78.

55. S A K K A S D., M A R I E T H O Z E., St. J O H N J.C. : A b n o r m a l sperm parameters in humans are indicative of an abortive apoptotic mechanism linked to the Fas-mediated pathway. Exp. Cell Res., 1999, 251 : 350-355.

56. S A K K A S D., T O M L I N S O N M. : Assessment of sperm c o m p e - tence. Semin. Reprod. Med., 2000, 18 : 133-139.

57. S A N D E R S J., H A W L E Y J., L E V Y W. : Pregnancies following high dose cyclophasphamide with or without high dose busulfan or total body irradiation and bone marrow transplant. Blood,

1996, 87 : 3045-3052.

58. S C H R A D E R M., M U L L E R M., S T R A U B B., M I L L E R K. : The impact of chemotherapy on male fertility : a survey o f the biolo- gic basis and clinical aspects. Reprod. Toxicol., 2001, 15 9 611- 617.

59. S E N T U R I A Y., P E C K H A M C., P E C K H A M M. : Children fathe- red by men treated for testicular cancer. Lancet. 1985, II : 766- 769.

60. S H E N H.M., O N G C.N. : Dectection of oxidative D N A damage in human sperm and its association with sperm function and male infertility. Free Radical Biology and Medicine. 2000, 28 : 529- 536.

61. S I N G H N.P., M c C O Y M.T., T I C E R.R., S C H N E I D E R E.L. : A simple technique for quantification of low levels o f D N A dama- ge in individual cells. Exp. Cell. Res., 175 : 184-191.

62. S L O T E R E.D., L O W E X., M O O R E D.H., N A T H J., W Y R O B E K A.J. : Multicolor F I S H analysis of chromosomal breaks, duplica- tions, deletions, and numerical abnormalities in the sperm of heal- thy men. Am. J. Hum. Genet., 2000, 67 : 862-872.

63. S U N J.G., J U R I S I C O V A A., C A S P E R R. E : Detection of deoxy- ribonucleic acid fragmentation in human sperm : correlation with in vitro fertilization. Biol. Reprod., 1997, 56 : 602-607.

64. T R A S L E R J.M., H A L E S B . E , R O B A I R E B. : Chronic low dose cyclophosphamide treatment o f adult male rats : effect on fertili- ty, pregnancy outcome and progeny. Biol. Reprod., 1986, 34, 275- 283.

65. V E L E Z D E L A C A L L E J.E, J E G O U B. : Prevention by a contra- ception of anti-cancer drug induced sterility and genotoxicity in male rats. Cancer Res., 1990, 50 : 1308-1315.

66. W Y R O B E K A.J., A L H B O R N T., B A L H O R N R., S T A N K E R L., P I N K E L D . : Fluorescence in situ hybridization to Y chromoso- me in d e c o n d e n s e d h u m a n sperm nuclei. M o l e c . Reprod. Develop., 1990, 27 : 200-208.

(11)

-67. ZHENG N., MONCKTON D.G., WILSON G., et al. : Frequency of rninisatellite repeat number changes at the MS205 locus in human sperm before and after cancer chemotherapy. Environ. Mol. Mut., 2000, 36 : 134-145.

ABSTRACT

Genotoxicity of chemotherapy and radiotherapy:

What are consequences for human spermatozoa?

Louis BUJAN, Philippe DE MAS

the harmful action on chromosomes, treatments could

also damage spermatozoal DNA. Studies conducted on

larger sample sizes and using other methods of analysis

therefore appear to be essential. In the meantime, it

appears preferable to systematically propose semen

cryopreservation before treatment and to provide very

cautious advice to patients desiring a pregnancy soon

after completion of treatment.

Key Words : chemotherapy, radiotherapy, spermatozoa,

aneup/o'(dy, minisatellites, DNA, side effects, review

The prognosis of cancer in young men of childbearing

potential has been considerably improved over recent

decades as a

result of therapeutic

progress.

Chemotherapy and radiotherapy have well known effects

on spermatogenesis. Apart from quantitative and quali-

tative impairment of spermatogenesis, animal studies

have also demonstrated nuclear lesions (aneuploidy,

presence of adducts, DNA fragmentation, etc.) and

sometimes lesions affecting the F1 and F2 generations.

Chromosomal studies of human spermatozoa after

radiotherapy have demonstrated an increased frequency

of chromosomal anomalies. The first studies concerning

the effects of chemotherapy used the heterospecific fer-

tilization technique to demonstrate spermatozoal chro-

mosomal anomalies. More recently, the

f l u o r e s c e n c e in

situ hybridization (FISH) technique has been used to

study several chromosomes on a large number of sper-

matozoa. The results of various studies based on small

sample sizes vary as a function of the therapeutic proto-

col administered and the time of sperm collection in rela-

tion to the end of treatment. We studied 5 patients who

provided a semen sample 6 to 17 months after comple-

ting the BOE chemotherapy protocol (Bleomycin,

Etoposide, Cisplatin). We demonstrated an increased

rate of aneuploid and diploid spermatozoa. The results of

our study and those reported by R. Martin et al. [45, 47]

suggest the possibility of a transient effect of chemothe-

rapy on gamete chromosomes. Other studies, conducted

in the context of Hodgkin's disease, have demonstrated

the transient nature of the aneuploidy effect. Apart from

Figure

Figure 1 : Les consdquences d'un agent ddldtbre pour la spermatogenbse peuvent se voir it diff~rents niveaux
Figure 2 : Hybridation in situ de sondes chromosomiques fluorescentes sur le spermatozo~de humain (sondes pour les chromosomes 7, 16, 18, X et Y)

References

Related documents

Such a relational account of the tensed terms Past and Future can easily be generalized to the writing of any higher-order tensed sentence which is not part of any

We then give simple procedures to estimate the level sets and global maximas of a function given noisy observations and apply the k-NN regression bounds to establish new

Despite different business models, implementing and operating a MaaS service requires a single identity for a user, open data and open payment methods from various transport

Expresses doubt as to whether the regulation in the form proposed by the Commission, can lead in the immediate future to a satisfactory balance between supply

When the direction and level of the relationship between intrapreneurship and customer driven characteristics are examined; we see a medium level and positive

To make a contribution to the existing literature in research productivity, the present study aims to (1) examine the publication productivity of accounting faculty members in