Text ABSTRAK pdf

KONVERSI ENZIMATIS KULIT PISANG MENJADI GLUKOSA MENGGUNAKAN ENZIM SELULASE DARI Aspergillus niger L-51 YANG

DIAMOBILISASI DENGAN ZEOLIT ALAM (Skripsi)

Oleh RICA AULIA

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

ABSTRACT

ENZYMATIC CONVERSION OF BANANA PEELS TO GLUCOSE USING CELLULASE ENZYME FROM Aspergillus niger L-51

IMMOBILIZED WITH NATURAL ZEOLITE

By

Rica Aulia

Cellulase is a hydrolase enzyme that hydrolyze cellulose in β-1,4-glycoside bonds. Cellulase is widely used in industry to convert cellulose to glucose. In this study, immobilization cellulase enzyme from Aspergillus niger L-51 was carried out using natural zeolite to improve the stability of the enzyme. The cellulase enzyme from the immobilization process is used to convert banana peel to glucose. The stages carried out in this study include: production, isolation, purification, immobilization using natural zeolite, characterization of cellulase enzymes purified before and after immobilization, and enzymatic conversion of banana peels. The results showed that the enzyme specific activity from the purification was 11.560 U/mg and its purity increased 5.2 times compared to the crude extract of cellulase enzyme with a specific activity 2.194 U/mg. The purified enzyme has an optimum temperature at 60oC; KM = 34.683 mg/mL

substrate; Vmax = 52.631 μmol/mL minute, while the immobilized enzyme has an

optimum temperature at 70oC; KM = 0.606 mg/mL substrate; Vmax = 0.545 μmol/mL

minutes. The residual activity of purified and immobilized enzymes in the thermal stability test was 18 and 34%, respectively. The results of purification of enzyme kinetics obtained by ki value = 0.016 1/minute; ∆Gi = 76.695 kJ/mol, and t1/2 = 43.310

minutes, while the immobilization enzyme obtained ki value = 0.009 1/minute; ∆Gi =

78.240 kJ/mol, and t1/2 = 77 minutes. Kivalues, t1/2, and∆Gi showed that immobilized

enzyme was more stable than purified enzyme so it can be used to stage hydrolysis.

Hydrolysis of banana peel with immobilized cellulase enzyme for 24 hours produced the highest glucose level, which was 11.524 mg/mL.

ABSTRAK

KONVERSI ENZIMATIS KULIT PISANG MENJADI GLUKOSA MENGGUNAKAN ENZIM SELULASE DARI Aspergillus niger L-51 YANG

DIAMOBILISASI DENGAN ZEOLIT ALAM

Oleh Rica Aulia

Selulase adalah enzim hidrolase yang menghidrolisis selulosa pada ikatan β-1,4-glikosida. Selulase banyak digunakan dalam industri untuk mengkonversi selulosa menjadi glukosa. Pada penelitian ini telah dilakukan amobilisasi enzim selulase dari

Aspergillus niger L-51 menggunakan zeolit alam untuk meningkatkan stabilitas enzim

tersebut. Enzim selulase hasil amobilisasi digunakan untuk mengkonversi kulit pisang menjadi glukosa. Adapun tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi: produksi, isolasi, pemurnian, amobilisasi menggunakan zeolit alam, karakterisasi enzim selulase hasil pemurnian sebelum dan setelah amobilisasi, dan konversi kulit pisang secara enzimatis. Hasil penelitian menunjukkan aktivitas spesifik enzim hasil pemurnian sebesar 11,560 U/mg dan kemurniannya meningkat 5,2 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim enzim selulase yang mempunyai aktivitas spesifik sebesar 2,194. Enzim hasil pemurnian memiliki suhu optimum 60oC; KM= 34,683 mg/mL substrat; Vmaks =

52,631μmol/ mL.menit, sedangkan enzim hasil amobilisasi memiliki suhu optimum 70oC; KM= 0,606 mg/mL substrat; Vmaks = 0,545 μmol/ mL.menit. Aktivitas sisa dari

enzim hasil pemurnian dan enzim hasil amobilisasi pada uji stabilitas termal berturut-turut sebesar 18 dan 34%. Data kinetika enzim hasil pemurnian diperoleh nilai ki =

0,016 menit-1;∆Gi= 76,695 kJ/mol, dan t1/2= 43,31 menit, sedangkan enzim amobilisasi

diperoleh nilai ki = 0,009 menit-1;∆Gi = 78,240 kJ/mol, dan t1/2 = 77 menit. Nilai ki, t1/2

dan ∆G_i yang diperoleh menunjukkan bahwa enzim hasil amobilisasi lebih stabil dibandingkan dengan enzim hasil pemurnian sehingga digunakan untuk tahap hidrolisis. Hidrolisis kulit pisang kepok dengan enzim selulase amobil selama 24 jam menghasilkan kadar glukosa tertinggi, yaitu 11,524 mg/mL.

Kata kunci : selulase, Aspergillus niger L-51, amobilisasi, zeolit alam, kulit pisang,

KONVERSI ENZIMATIS KULIT PISANG MENJADI GLUKOSA MENGGUNAKAN ENZIM SELULASE DARI Aspergillus niger L-51

YANG DIAMOBILISASI DENGAN ZEOLIT ALAM

Oleh RICA AULIA

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar SARJANA SAINS

Pada

Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bandar Lampung, pada tanggal

28 Januari 1997, sebagai anak kedua dari tiga

bersaudara yang Penulis merupakan putri dari

pasangan Bapak Yulianto dan Ibu Junariah.

Penulis mengawali jenjang pendidikan dari Taman

Kanak- Kanak Aisyah Bandar Lampung pada tahun 2001–2002.

Kemudian melanjutkan pendidikan Sekolah Dasar (SD) di SD Al-Azhar 2

Bandar Lampung hingga tahun 2008. Pendidikan Sekolah Menengah

Pertama (SMP) diselesaikan pada tahun 2011 di SMP Negeri 4 Bandar

Lampung. Pendidikan Sekolah Menengah Atas (SMA) diselesaikan di

SMA YP UNILA Bandar Lampung pada tahun 2014 dan pada tahun yang

sama penulis diterima sebagai Mahasiswa Jurusan Kimia Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan AlamUniversitas Lampung melalui

jalur UMPTN (Ujian Mandiri Perguruan Tinggi Negeri).

Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif di Lembaga Kemahasiswaan

Himpunan Mahasiswa Kimia (HIMAKI) FMIPA Universitas Lampung

sebagai anggota Sosial Masyarakat (SOSMAS) pada tahun 2015-2016.

Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum Biokimia untuk Jurusan

Kimia FMIPAUniversitas Lampung pada tahun2017. Pada bulan

Juli-Agustus 2017 penulis melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) di Desa

MOTTO

“ La Tahla”

(Hei, Jangan Mengeluh! )

“ Allah tidak membebani seseorang itu melainkan

sesuai dengan kesanggupannya.”

( Al Baqarah (2) : 286 )

“Apabila Kita Ridho Pada Sesuatu Yang Mengecewakan Hati

Kita, Maka Percayalah Allah Akan Menggantikan

Kekecewaan Itu Dengan Sesuatu Yang Tidak Kita Sangka”

Jangan pernah menunggu waktu yang tepat untuk

melakukan sesuatu, karena sesuatu datang di waktu yang

tidak kita duga.

Sesungguhnya Keberhasilan Yang Kita Gapai Merupakan

Doa Orang Tua Yang Diridhoi Allah SWT

“Jangan terdiam teruslah bergerak, karena dunia tidak akan

pernah menunggu mu”

Alhamdulillah Puji Syukur Atas Kehadirat Allah SWT yang Maha Pengasih dan Maha Penyayang

Kupersembahkan karya sederhanaku ini sebagai wujud sayang, bakti, dan tanggung jawab kepada:

Kedua orang tuaku yang telah merawatku dengan penuh kasih sayang, yang selalu memberikan do’a–do’a terbaik, nasihat,

dukungan, serta senantiasa berkorban untukku.

Kakak & adikku yang selalu memberikan dukungan dan semangat.

Para ibu dan bapak dosen yang selama ini telah memberikan banyak ilmu pengetahuan, pelajaran, arahan, serta

bimbingannya kepadaku.

Seluruh sahabat dan teman-teman terdekatku yang selama ini telah memberikan banyak dukungan, bantuan dan motivasi

kepadaku.

Serta Almamaterku, tercinta

SANWACANA

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan karunia-Nya

sehingga penulis dapa tmenyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul

“Konversi Enzimatis Kulit Pisang Menjadi Glukosa Menggunakan Enzim Selulase dari Aspergillus niger L-51 yang Diamobilisasi dengan Zeolit Alam”. Skripsi ini adalah salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Sains pada Jurusan Kimia, Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam,Universitas Lampung.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini tidak mungkin terselesaikan tanpa

adanya bimbingan, dorongan, nasihat serta bantuan dari berbagai pihak.

Oleh karena itu penulis menyampaikan terimakasih kepada:

1. Ibu Junariah dan Bapak Yulianto selaku kedua orangtua atas kasih

sayang yang telah diberikan selama ini serta segala doa, dukungan,

nasihat dan motivasinya sehingga penulis dapat menyelesaikan

skripsi ini dengan baik.

2. Bapak Prof. Dr. Ir. Yandri A.S, M.S. selaku Pembimbing I

penelitian dan Pembimbing Akademik atas segala bimbingan,

dukungan dan motivasi serta saran yang diberikan kepada

menyelesaikan skripsi ini.

3. Ibu Dr. Nurhasanah, S.Si., M.Si. selaku Pembimbing II penelitian

atas bimbingan, kritik, saran dan arahannya kepada penulis

sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dengan baik.

4. IbuProf. Dr. Buhani, M.Si. selaku pembahas penelitian yang

telah memberikan kritik serta saran kepada penulis sehingga

skripsi ini terselesaikan dengan baik.

5. Kakak ku Rico Fambela dan Adikku Muhammad Abdul Wahid yang

selalu memberikan kasih sayang yang tulus, kecerian serta dukungan

untuk keberhasilanku.

6. Seseorang yang selalu menemaniku dalam jatuh dan bangun untuk

tugas akhir ini“Renaldi Arlento”. Terimakasih atas kebahagiannya,

dukunganmu, semangat , nasihatmu, canda dan tawa, keluh kesah,

saran dan kritik yang telah diberikan. Terimakasih sudah menjadi

pendengar yang baik selama ini untukku.

7. Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T. selaku Ketua Jurusan

Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA)

Universitas Lampung.

8. Prof. Warsito, S.Si., D.E.A., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Lampung.

9. Bapak Jon Isman selaku laboran Laboratorium Biokimia yang telah

banyak membantu dalam menyediakan alat serta bahan untuk

10. Bapak A.Gani selaku staff loket FMIPA KIMIA yang selalu

membantu memudahkan dan mendukung penulis menyelesaikan

tugas akhir.

11. Seluruh dosen dan staf administrasi di Jurusan Kimia FMIPA

Universitas Lampung yang telah memberikan banyak ilmu

pengetahuan dan motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan

skripsi ini.

12. Erika Liandhini seseorang yang bersamaku selama ini untuk sampai

titik akhir perjuangan perkuliahan. Terimakasih atas pengertianmu,

dukungan, bantuan dan tawamu.

13. Teman seperjuangan penelitan dilab, Riza Mufarida Akhsin, Bunga

Lantri D, Ni Putu , Asrul , Bidari , Leony yang selama ini

menemani dan mendukung penulis dalam segala hal tentang

penelitian.

14. Sahabatku AIB yang memang AIB; Aniza, Ayuning, Hesty, Ana,

Devi, Erien, Pew, Ferita, Ismi, Dira dan Cindy yang selama ini

mendukung dan menemaniku selama masa perkuliahan, makan,

ngelab, ngapa-ngapain. ILoveYouAll~

15. Kakak-kakak, teman-teman dan adik-adik seperjuangan diLab

Biokimia yang selama ini membantu penulis jika ada kesulitan

dilab.

16. Teman-teman seperjuangan Kimia 2014 yang tidak bisa

disebutkan namanya satu persatu. Terimakasih sudah

17. Sahabat masa SMP dan SMA-ku : AyuMon, Aniza, IndriGun, Ipeh,

Mbulqu(Ayuning), Aldha, Tami, Kiky, Imut dan Ungil(Irma) yang

telah memberikan semangat dan motivasi. Thx u All.

18. Semua pihak yang tidak dapatku sebutkan satu persatu yang telah

mendukung dan memotivasi penulis untuk menyelesaikan skripsi

ini dan menyelesaikan studi sebagai mahasiswa S1Kimia.

Akhir kata penulis menyadari bahwa skripsi ini masih kurang dari

kesempurnaan. Penulis berharap semoga skripsi yang sederhana ini dapat

i

DAFTAR ISI

DAFTARTABEL ... iv

DAFTAR GAMBAR ... vi

DAFTAR LAMPIRAN ... viii

I. PENDAHULUAN ... 1

A. Latar Belakang ... 1

B. Tujuan Penelitian ... 4

C. Manfaat Penelitian ... 5

II. TINJAUAN PUSTAKA... 6

A. Enzim ... 6

1. Klasifikasi enzim ... 7

2. Sifat katalitik enzim ... 9

3. Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim ... 9

4. Teori pembentukan enzim substrat ... 13

B. Aspergillus niger ... 14

C. Enzim Selulase... 15

D. Produksi dan Isolasi Enzim Selulase ... 16

E. Pemurnian Enzim Selulase... 17

F. Pengujian Aktivitas Selulase dengan Metode Mandels ... 19

G. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry ... 19

H. Zeolit ... 20

I. Amobilisasi ... 23

J. Kinetika Reaksi Enzim ... 25

ii

1. Stabilitas termal enzim... 27

2. Stabilitas pH enzim ... 28

L. Kulit Pisang... 29

M. Hidrolisis Enzimatik ... 30

N. Glukosa ... 32

III. METODE PENELITIAN ... 33

A. Tempat dan Waktu Penelitian ... 33

B. Alat dan Bahan... 33

C. Prosedur Penelitian ... 34

1. Pembuatan media inokulum dan fermentasi ... 34

2. Isolasi enzim selulase... 35

3. Pemurnian enzim selulase... 35

4. Uji aktivitas enzim selulase metode mandels ... 37

5. Penentuan kadar protein metode lowry... 38

6. Amobilisasi enzim selulase hasil pemurnian dengan zeolit... 39

7. Karakterisasi enzim selulase murni dan amobil... 40

8. Konversi enzimatis menjadi glukosa ... 42

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 45

A. Enzim Selulase dari Aspergillus niger L-51 ... 45

B. Enzim Selulase Amobil... 48

C. Enzim Selulase Hasil Pemurnian dan Enzim Selulase Amobil ... 50

1. Suhu optimum enzim selulase hasil pemurnian dan enzim selulase amobil ... 50

2. Stabilitas termal enzim selulase hasil pemurnian dan amobil... 51

3. Nilai Km dan Vmaks enzin selulase hasil permurnian dan enzim selulase hasil amobilisasi ... 52

4. Pemakaian berulang enzim amobil ... 54

D. Konstanta Laju Inaktivasi Termal (ki), Waktu Paruh (t1/2), danPerubahan Energi Akibat Denaturasi (∆Gi) Enzim Selulase Hasil Pemurnian dan Hasil Amobilisasi... 55

1. Konstanta laju inaktivasi ... 56

2. Perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi)... 56

3. Waktu Paruh... 57

E. Produksi Konversi Enzimatis Kulit Pisang... 57

V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 60

iii

B. Saran ... 61

iv

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Pemurnian enzim selulase dari Aspergillus niger L-51 ... 48

2. Nilai ki, t1/2, dan∆Gi enzim selulase hasil pemurnian dan hasil amobilisasi 55 3. Hubungan antara berbagai tingkat kejenuhan ammonium sulfat dengan aktivitas unit enzim selulase ... 69

4. Hubungan antara kejenuhan ammonium sulfat fraksi (0-20%) dan (20-80%) dengan aktivitas spesifik enzim selulase... 69

5. Pengikatan enzim selulase pada matriks (zeolit alam)... 70

6. Hubungan antara suhu (oC) aktivitas enzim selulase hasil pemurnian ... 71

7. Hubungan antara suhu (oC) aktivitas enzim selulase hasil amobilisasi ... 71

8. Hubungan antara aktivitas unit (U/mL) enzim selulase hasil pemurnian selama inaktivasi termal 100 menit... 72

9. Hubungan antara aktivitas unit (U/mL) enzim selulase hasil amobilisasi selama inaktivasi termal 100 menit... 72

10. Data untuk penentuan Km dan Vmaks enzim selulase hasil pemurnian berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk ... 73

11. Data untuk penentuan Km dan Vmaks enzim selulase hasil amobilisasi berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk ... 73

12. Hubungan antara pengulangan enzim selulase hasil amobilisasi dengan aktivitas unit (U/mL)... 74

v

14. Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim hasil amobilisasi pada suhu 50oC... 75

15. Absorbansi glukosa pada berbagai konsentrasi untuk menentukan kurva standar glukosa... 78

16. Hasil konversi enzimatis kulit pisang ... 79

17. Absorbansi serum albumin (BSA) pada berbagai konsentrasi untuk

vi

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Hubungan suhu dengan aktivitas enzim ... 10

2. Hubungan pH dengan aktivitas enzim ... 10

3. Hubungan kecepatan reaksi dengan konsentrasi enzim... 11

4. Teori kunci gembok dan teori induksi ... 14

5. Struktur zeolit... 22

6. Struktur Kerangka Zeolit ... 22

7. Kurva Lineweaver-Burk ... 27

8. Mekanisme hidrolisis selulosa dengan enzim ... 32

9. Skema proses fraksinasi enzim dengan ammonium sulfat ... 36

10. Skema singkat mengenai prosedur penelitian ... 44

11. Hubungan antara kejenuhan ammonium sulfat (0-95%) dengan aktivitas unit enzim selulase dari Aspergillus niger L-51... 46

12. Hubungan antara fraksi enzim pada 2 tingkat kejenuhan ammonium sulfat dengan aktivitas unit enzim selulase dari Aspergillus niger L-51 ... 47

13. Hubungan antara aktivitas unit (U/mL) enzim selulase pada berbagai pH pengikatan matriks zeolit alam ... 50

14. Suhu optimum enzim selulase hasil pemurnian dan amobil ... 51

vii

16. Grafik Lineweaver-Burk enzim selulase hasil pemurnian dan amobil ... 53

17. Pemakaian berulang enzim hasil amobilisasi... 54

18. Grafik ln (Ei/E0) enzim selulase hasil pemurnian dan hasil amobil... 56

19. Hasil konversi enzimatis dari kulit pisang ... 58

20. Kurva standar glukosa... 78

viii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 : Data aktivitas enzim selulase hasil fraksinasi dengan ammonium

sulfat... 69

Lampiran 2 : Data pengikatan enzim selulase pada matriks ... 70

Lampiran 3 : Data aktivitas enzim selulase hasil pemurnian dan hasil amobil pada variasi suhu ... 71

Lampiran 4 : Data aktivitas enzim selulase hasil pemurnian dan hasil amobil selama inaktivasi terml 100 menit ... 72

Lampiran 5 : Data untuk penentuan nilai KMdan Vmaksenzim selulase hasil pemurnian dan hasil amobil ... 73

Lampiran 6: Data aktivitas enzim selulase amobil hasil pengulangan enzim selulase hasil amobil ... 74

Lampiran 7 : Data untuk penentuan nilai ki enzim selulase hasil pemurnian dan hasil amobil pada suhu 50oC... 75

Lampiran 8 : Perhitungan nilai∆Gi dan t1/2enzim selulase hasil pemurnian... 76

Lampiran 9 : Perhitungan nilai∆Gi dan t1/2enzim selulase hasil amobil... 77

Lampiran 10 : Data absorbansi glukosa dan kurva standar glukosa ... 78

ix

Lampiran 12 : Data absorbansi serum albumin (BSA) dan kurva standar albumin (BSA)... 81

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kulit pisang kepok merupakan limbah pertanian yang belum banyak

dimanfaatkan oleh masyarakat. Kulit dari pisang kepok biasanya oleh masyarakat

hanya dibuang dan hal itu menjadi permasalahan limbah di alam karena akan

meningkatkan keasaman tanah dan mencemarkan lingkungan (Setiawati dkk.,

2013). Minimnya pengetahuan dan informasi mengenai potensi-potensi yang

dimiliki suatu bahan dapat membuat bahan tersebut menjadi tidak berguna dan

tidak memiliki nilai ekonomis. Pembuatan etanol dari limbah selulosa merupakan

rangkaian dari proses pembuatan glukosa, tahapan diawali dengan menghidrolisis

limbah selulosa tersebut sehingga menghasilkan glukosa yang nantinya dapat

digunakan sebagai bahan baku pembuatan etanol. Terdapat beberapa metode pada

proses konversi karbohidrat menjadi gula atau glukosa, di antaranya dengan

hidrolisis asam, secara enzimatis dan menggunakan katalis padat.

Kulit pisang memiliki kandungan selulosa yang tinggi (60-65 %), hemiselulosa

6-8 %, dan lignin 5-10 % (Tjahyono, 1998). Untuk lebih mengoptimalkan

fungsinya, kulit pisang dibuat menjadi bahan yang dapat bermanfaat, salah

2

dapat dipisahkan dan diolah menjadi glukosa dengan proses hidrolisis. Proses

hidrolisis limbah pisang dilakukan dengan cara mereaksikan pati pisang dengan

air berlebih menggunakan katalisator. Menurut Atmaji dkk. (2013) metode

hidrolisis secara enzimatis lebih ramah lingkungan dibandingkan dengan katalis

asam, akan tetapi harganya lebih mahal. Pada penelitian ini hidrolisis secara

enzimatis dengan menggunakan enzim selulase.

Penggunaan enzim selulase tersebut digunakan untuk memecah kulit pisang

kepok menjadi glukosa berdasarkan pada sifat enzim selulase yang dapat

menghidrolisis ikatanβ-1,4-glikosidik pada selulosa, yaitu enzim tersebut bekerja

secara sinergis mendegradasi selulosa dan melepaskan gula reduksi (glukosa)

(Sixta, 2006). Enzim dapat diisolasi dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme.

Namun, secara umum enzim diisolasi dari mikroorganisme karena pertumbuhan

mikroorganisme relatif lebih cepat sehingga enzim yang dihasilkan lebih banyak.

Aspergillus niger adalah spesies yang biomasanya sering digunakan sebagai

adsorben dan dapat dibiakkan dengan baik dalam media agar, ramah lingkungan,

dan bernilai ekonomis. Aspergillus niger adalah salah satu mikroorganisme yang

berkemampuan baik dalam menghasilkan enzim (Frazier and Westhoff, 1981).

Pada umumnya enzim hanya mampu bekerja pada kondisi fisiologis dan tidak

tahan terhadap kondisi ekstrim (Goddette et al., 1993). Untuk mendapatkan

enzim yang stabil dapat melalui proses amobilisasi. Amobilisasi enzim adalah

suatu enzim yang secara fisik maupun kimia tidak bebas bergerak yang masih

mempunyai aktivitas katalitik dan dapat digunakan secara berulang maupun

proses kontinyu (Winarno, 1986). Pada saat digunakan, enzim amobil dapat

3

enzim amobil dapat dipisahkan dari produk dan diperoleh kembali, sehingga

enzim amobil dapat digunakan berulang kali (Darwis dan Sukara, 1990).

Penggunaan enzim amobil hingga saat ini masih banyak digunakan dalam proses

industri karena mempunyai keunggulan tertentu. Menurut Wang et al. (1979)

selain dapat digunakan berulangkali, penggunaan enzim amobil dalam industri

mempunyai beberapa keuntungan lain, di antaranya adalah pemakaian produknya

tidak terkontaminasi oleh enzim, memudahkan proses pengendalian reaksi, dapat

digunakan untuk analisis, dan pada proses amobilisasi tertentu dapat

meningkatkan stabilitas enzim. Amobilisasi enzim dapat dilakukan dengan

metode pengikatan (carrier-binding), metode ikat silang (cross linking), dan

metode penjebakan (entrapment). Salah satu metode yang paling sederhana

adalah dengan metode pengikatan (carrier-binding) secara adsorpsi fisik pada

suatu padatan pendukung. Metode adsorpsi fisik memiliki kelebihan, yaitu

aktivitas dari enzim tetap tinggi (tidak terjadi perubahan konformasi enzim) dan

media dapat diregenerasi (Susanto dkk., 2003).

Padatan pendukung yang digunakan pada penelitian ini adalah zeolit alam. Zeolit

alam digunakan sebagai senyawa pengamobilisasi enzim karena sifat yang

dimiliki oleh zeolit memungkinkan untuk dimodifikasi menjadi katalis, adsorben,

dan sebagai matrik pengamobil, sehingga dapat digunakan untuk meningkatkan

stabilitas enzim dan mendapatkan kondisi optimum enzim selulase bebas dan

amobil, yang meliputi pH optimum, suhu optimum, dan stabilitas termal (Sutarti

dan Rachmawati, 1994). Pemanfaatan zeolit sebagai media pendukung

4

dari Aspergillus niger dan terbukti dapat meningkatkan stabilitas enzim selulase.

Enzim hasil pemurnian bekerja optimum pada suhu 50ºC, sedangkan enzim

amobil pada suhu 75ºC. Aktivitas spesifik enzim hasil pemurnian diperoleh

sebesar 38, 029 U/mg, meningkat 7 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim yaitu

5,394 U/mg (Oktariani, 2018).

Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang diuraikan, maka pada

penelitian ini akan dilakukan amobilisasi enzim selulase dari Aspergillus niger

L-51 dan menggunakan enzim amobil tersebut untuk mengkonversi kulit pisang

menjadi glukosa.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Memperoleh enzim selulase dari Aspergillus niger L-51 dengan aktivitas dan

tingkat kemurnian yang tinggi.

2. Meningkatkan kestabilan enzim selulase dari Aspergillus niger L-51 melalui amobilisasi menggunakan zeolit alam.

5

C. Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai dasar untuk

mengoptimalkan potensi kulit pisang untuk produksi gula yang dihidrolisis oleh

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Enzim

Enzim adalah biokatalisator yang sangat efektif yang dapat meningkatkan

kecepatan reaksi kimia spesifik secara nyata, suatu reaksi tanpa enzim akan

berlangsung lambat (Lehninger, 2005). Suatu enzim dapat mempercepat laju

reaksi kira-kira 108sampai 1011kali lebih cepat dibandingkan dengan reaksi yang

tidak menggunakan katalisis (Poedjiadi, 1994). Molekul enzim biasanya

berbentuk bulat (globular), sebagian besar terdiri lebih dari satu polipeptida

(Wirahadikusumah, 1997) dan umumnya mempunyai berat molekul yang

beraneka ragam berkisar 104-107kDa (Dryer dan Montgomery, 1993).

Mikroorganisme, terutama ragi, telah banyak digunakan selama beberapa ribu

tahun untuk membuat bir, minuman anggur dan beberapa produk lainnya.

Namun, baru pada tahun 1878 oleh Kuhne, komponen sel ragi yang bertanggung

jawab terhadap fermentasi disebut sebagai enzim. Kurang dari dua dasawarsa

berikutnya, sifat enzim yang tidak hidup dibuktikan secara jelas dengan

menggunakan ekstrak ragi yang bebas sel dan ternyata ekstrak tersebut mampu

7

Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang

bereaksi sehingga mempercepat proses reaksi. Percepatan reaksi terjadi karena

enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan

mempermudah terjadinya reaksi. Enzim mengikat molekul substrat membentuk

kompleks enzim substrat yang bersifat sementara kemudian terurai membentuk

enzim bebas dan produknya (Lehninger, 2005).

Enzim banyak digunakan di berbagai sektor industri, terutama industri makanan.

Selain itu, enzim juga dapat digunakan dalam industri deterjen, farmasi, dan

tekstil. Lebih dari 2000 enzim yang telah diisolasi, hanya 14 enzim yang

diproduksi secara komersial. Kebanyakan dari enzim ini adalah hidrolase,

misalnya amilase, protease, pektinase dan selulase. Enzim penting lainnya adalah

glukosa isomerase dan glukosa oksidase. Alasan digunakannya enzim dalam

industri karena enzim mempunyai kelebihan (Flower, 1998) antara lain :

1. Kemampuan katalitik yang tinggi mencapai 109-1012kali laju reaksi

nonaktivitas enzim.

2. Spesifikasi substrat yang tinggi.

3. Reaksi dapat dilakukan pada kondisi yang lunak, yaitu pada tekanan dan

temperatur rendah.

1. Klasifikasi enzim

Klasifikasi enzim dapat dibedakan sebagai berikut :

a. Berdasarkan tempat bekerjanya enzim dibedakan menjadi dua, yaitu:

1. Endoenzim, disebut juga enzim intraseluler, yaitu enzim yang bekerja

8

2. Eksoenzim, disebut juga enzim ekstraseluler, yaitu enzim yang

bekerja di luar sel.

b. Berdasarkan fungsinya enzim dapat dibedakan menjadi enam kelas dan

tiap kelas mempunyai beberapa subkelas. Pada tiap subkelas, nama resmi

dan nomor klasifikasi dari tiap enzim mengindikasikan reaksi yang

dikatalisis berdasarkan IUPAC yaitu:

1. Oksidoreduktase, yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi

oksidasi-reduksi, yang merupakan pemindahan elektron, hidrogen atau

oksigen.

2. Transferase, yaitu enzim yang mengkatalisis perpindahan gugus

molekul dari suatu molekul ke molekul yang lain, seperti gugus

amino, karbonil, metal, asil, glikolis atau fosforil.

3. Hidrolase, yaitu enzim yang mengkatalisis pemutusan ikatan antara

karbon dengan berbagai atom lain dengan adanya penambahan air.

4. Liase, yaitu enzim yang mengkatalisis penambahan gugus fungsi dari

suatu molekul tanpa melalui proses hidrolisis.

5. Isomerase, yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi isomerasi.

6. Ligase, yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi penggabungan dua

molekul dengan dibebaskannya molekul pirofosfat dari nukleosida

trifosfat.

c. Berdasarkan cara terbentuknya enzim dibedakan menjadi dua, yaitu:

1. Enzim konstitutif, yaitu enzim yang jumlahnya dipengaruhi kadar

9

2. Enzim adaptif, yaitu enzim yang pembentukannya dirangsang oleh

adanya substrat, contohnya enzim β-galaktosidase yang dihasilkan

oleh bakteri E. coli yang ditumbuhkan di dalam medium yang

mengandung laktosa (Lehninger, 1982).

2. Sifat katalitik enzim

Sifat-sifat katalitik dari enzim ialah sebagai berikut :

a. Enzim mampu meningkatkan laju reaksi pada kondisi biasa (fisiologis)

dari tekanan, suhu, dan pH.

b. Enzim berfungsi sebagai selektifitas tinggi terhadap substrat (substansi

yang mengalami perubahan kimia setelah bercampur dengan enzim) dan

jenis reaksi yang dikatalisis.

c. Enzim memberikan peningkatan laju reaksi yang tinggi dibanding

dengan katalis biasa (Page, 1989).

3. Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim

Beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim sebagai berikut :

a. Suhu

Enzim dapat mempercepat terjadinya reaksi kimia pada suatu sel hidup.

Dalam batas-batas suhu tertentu, kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim

akan naik bila suhunya naik. Reaksi yang paling cepat terjadi yaitu pada

suhu optimum (Rodwell, 1987). Suhu yang terlalu tinggi akan

menyebabkan enzim terdenaturasi (Poedjiadi, 1994). Pada suhu 0oC

10

(Lay dan Sugyo, 1992). Hubungan antara aktivitas enzim dengan suhu

ditunjukkan dalam Gambar 1.

Aktivitas Enzim

Suhu

Gambar 1. Hubungan suhu dengan aktivitas enzim (Poedjiadi, 1994).

b. pH

Enzim bersifat amfolitik, yang berarti enzim mempunyai konstanta

disosiasi pada gugus asam maupun gugus basanya, terutama pada gugus

residu terminal karboksil dan gugus terminal aminonya, diperkirakan

perubahan kereaktifan enzim akibat perubahan pH lingkungan (Winarno,

1986). Hubungan kecepatan reaksi dengan pH ditunjukkan pada

Gambar 2.

11

c. Konsentrasi enzim

Konsentrasi enzim secara langsung mempengaruhi kecepatan laju reaksi

enzimatik, laju reaksi meningkat seiring dengan bertambahnya

konsentrasi enzim (Poedjiadi, 1994). Laju reaksi tersebut meningkat

secara linier selama konsentrasi enzim jauh lebih sedikit daripada

konsentrasi substrat, hal ini biasanya terjadi pada kondisi fisiologis (Page,

1997). Hubungan antara kecepatan reaksi dengan konsentrasi enzim

ditunjukkan dalam Gambar 3.

Kecepatan reaksi

Konsentrasi enzim

Gambar 3. Hubungan kecepatan reaksi dengan konsentrasi enzim (Page,

1997).

d. Konsentrasi substrat

Kecepatan reaksi enzimatis pada umumnya tergantung pada konsentrasi

substrat. Kecepatan reaksi akan meningkat apabila konsentrasi substrat

meningkat. Peningkatan kecepatan reaksi ini akan semakin kecil hingga

mencapai suatu titik batas yang pada akhirnya penambahan konsentrasi

substrat hanya akan sedikit meningkatkan kecepatan reaksi (Lehninger,

12

e. Pengaruh kadar air

Kadar air dari bahan sangat mempengaruhi laju reaksi enzimatik. Kadar

air bebas yang rendah mengakibatkan difusi enzim atau substrat,

akibatnya hidrolisis hanya akan terjadi pada bagian substrat yang

langsung berhubungan dengan enzim. Misalnya pada kadar air 20 % atau

kira-kira bahan mengandung 4 % air bebas, amilase hanya menghasilkan

produk hidrolisis glukosa dan maltosa. Pada kadar air yang lebih tinggi,

selain glukosa dan maltosa terbentuk juga dekstrin (Winarno, 1986).

f. Pengaruh kadar garam

Kadar elektrolit yang tinggi umumnya mempengaruhi kelarutan protein,

karena itu sering digunakan untuk melarutkan beberapa jenis protein.

Peristiwa ini disebut dengan salting in. Sebaliknya beberapa jenis larutan

garam lain dapat digunakan untuk membuat protein enzim menjadi tidak

larut. Proses ini disebut dengan istilah salting out, yang dapat

dimanfaatkan untuk mengisolasi enzim. Garam ammonium sulfat sering

digunakan untuk fraksinasi dan isolasi enzim karena sifat kelarutannya

dalam air yang tinggi dan tidak mengganggu bentuk dan fungsi enzim

(Scopes, 2002).

g. Aktivator dan inhibitor

Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya. Aktivator

adalah senyawa atau ion yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi

13

kofaktor. Kofaktor tersebut dapat berupa ion-ion anorganik seperti Zn,

Fe, Ca, Mn, Cu atau Mg atau dapat pula sebagai molekul organik

kompleks yang disebut koenzim (Martoharsono, 1984).

Inhibitor merupakan suatu zat kimia tertentu yang dapat menghambat

aktivitas enzim (Wirahadikusumah, 1997). Pada umumnya cara kerja

inhibitor adalah dengan menyerang sisi aktif enzim sehingga enzim tidak

dapat berikatan dengan substrat dan fungsi katalitik enzim tersebut akan

terganggu (Winarno, 1986).

h. Kadar protein enzim

Menurut Scopes (2002) kandungan protein di dalam enzim sangat

berpengaruh terhadap daya katalitik enzim tersebut. Pada umumnya

dengan meningkatnya kadar protein dalam suatu enzim, maka daya

katalitiknya akan meningkat. Salah satu metode dapat digunakan dalam

menentukan kadar protein adalah metode Lowry.

4. Teori pembentukan enzim-substrat

Cara kerja enzim (Page, 1997) dapat dijelaskan dengan dua teori, yaitu teori

kunci gembok (lock and key theory) dan teori kecocokan yang terinduksi

(induced fit theory), ditunjukkan dalam Gambar 4. Menurut teori

kunci-gembok, enzim dan substrat bergabung bersama membentuk kompleks,

seperti kunci yang masuk dalam gembok, hal ini dikarenakan adanya

kesesuaian bentuk ruang antara substrat dengan sisi aktif enzim, sehingga sisi

14

dengan energi aktivasi yang rendah. Setelah bereaksi, kompleks lepas dan

melepaskan produk serta membebaskan enzim. Sedangkan menurut teori

kecocokan yang terinduksi, sisi aktif enzim merupakan bentuk yang fleksibel.

Ketika substrat memasuki sisi aktif enzim, bentuk sisi aktif termodifikasi

melingkupi substrat membentuk kompleks. Ketika produk dihasilkan, maka

enzim akan dilepaskan dalam bentuk bebas dan dapat bereaksi kembali

dengan substrat yang baru.

Gambar 4. Teori kunci-gembok dan teori induksi (Shahib, 2005).

B. Aspergillus niger

Aspergillus niger merupakan fungi dari ascomycota yang berfilamen, mempunyai

hifa, bercabang-cabang dan bersekat, berwarna terang atau tidak berwarna, dan

ditemukan melimpah di alam (Esser, 2002). Aspergillus niger dapat tumbuh

optimum pada suhu 30-37oC, pH 4-6 dengan suhu minimum 6-8oC dan suhu

maksimal 45-47oC, dan bersifat aerob atau memerlukan oksigen pada proses

pertumbuhannya. Jamur ini memiliki warna dasar putih atau kuning dengan

lapisan konidiospora tebal berwarna coklat gelap sampai hitam. Jamur ini

15

Koloninya berwarna putih pada agar dekstrosa kentang (PDA) 25oC dan berubah

menjadi hitam ketika konidia dibentuk. Kepala konidia dari Aspergillus niger

berwarna hitam, bulat, cenderung memisah menjadi bagian-bagian yang lebih

longgar seiring dengan bertambahnya umur (Rao, 1998).

Aspergillus niger dapat tumbuh dengan cepat sehingga banyak digunakan secara

komersial dalam produksi asam sitrat, asam glukonat, dan pembuatan beberapa

enzim seperti amilase, peptinase amiloglukosida, dan selulase (Broekhuijsen et

al., 1993; Okada, 1985). Aspergillus niger mampu mensintesis asam sitrat dalam

medium fermentasi ekstraseluler dengan konsentrasi yang cukup tinggi, jika

dibiakkan dalam media yang kadar garamnya rendah dan mengandung gula

sebagai sumber karbon (Hang et al., 1977; Ji et al.,1992).

C. Enzim Selulase

Enzim yang dapat menghidrolisis ikatan β-1,4-glikosidik pada selulosa adalah

selulase. Selulase adalah enzim terinduksi yang disintesis oleh mikroorganisme

selama ditumbuhkan dalam medium selulosa (Lee, 2001). Selulase termasuk

sistem multienzim yang terdiri dari tiga komponen. Untuk menghidrolisis

selulosa yang tidak larut atau selulosa kristal diperlukan kerja sinergik dari ketiga

komponen enzim tersebut.

Menurut Reese (1976) adapun ketiga komponen enzim tersebut, yaitu:

1. Ekso-β-(1,4)-glukanase dikenal sebagai faktor C1. Faktor ini diperlukan

16

2. Endo-β-(1,4)-glukanase dikenal sebagai faktor Cx. Faktor ini diperlukan

untuk menghidrolisis ikatan β-(1,4)-glukosida (selulosa amorf)

3. Β-(1,4)-glukosidase menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa.

Aktivitas selulase disebabkan oleh enzim non hidrolitik C1, hidrolisis selulosa

yang telah diaktifkan dilakukan oleh enzim Cx. Menurut hipotesa ini, mikroba

yang tumbuh pada selulosa yang telah dilonggarkan oleh asam fosfat atau selulosa

tersubtitusi akan kekurangan enzim C1, tetapi banyak menghasilkan enzim Cx

(Muchtadi et al., 1992).

Selulase dapat diproduksi oleh fungi, bakteri, dan ruminansia. Produksi enzim

secara komersial biasanya menggunakan fungi atau bakteri. Fungi yang bisa

menghasilkan selulase antara lain dari genus Tricoderma, Aspergillus, dan

Penicillium, sementara bakteri penghasil selulase antara lain Acidothermus,

Bacillus, Clostridium, Pseudomonas dan Rhodothermus (Sukumaran et al., 2005).

D. Produksi dan Isolasi Enzim Selulase

Enzim dapat diisolasi secara ekstraseluler dan intraseluler. Enzim ekstraseluler

merupakan enzim yang bekerja diluar sel, sedangkan enzim intraseluler

merupakan enzim yang bekerja di dalam sel. Ekstraksi enzim ektraseluler lebih

mudah dibandingkan ekstraksi enzim intraseluler, karena tidak memerlukan

pemecahan sel dan enzim yang dikeluarkan dari sel mudah dipisahkan dari

pengotor lain serta tidak banyak bercampur dengan bahan-bahan sel lain (Pelczar,

17

Isolasi enzim selulase dapat dilakukan dengan metode sentrifugasi. Metode ini

digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa sel. Sentrifugasi

akan menghasilkan supernatan yang jernih dan endapan yang terikat kuat pada

dasar tabung, yang kemudian dipisahkan secara normal. Sel-sel mikroba biasanya

mengalami sedimentasi pada kecepatan 5000 selama 15 menit (Scopes, 1982).

Prinsip sentrifugasi berdasarkan pada kenyataan bahwa setiap partikel yang

berputar pada laju sudut yang konstan akan memperoleh gaya keluar (F). Besar

gaya ini bergantung pada laju sudut ω (radian/detik) dana radius pertukarannya

(sentimeter) (Cooper, 1997).

E. Pemurnian Enzim Selulase

Setelah enzim selulase diisolasi, selanjutnya enzim tersebut dimurnikan

menggunakan metode fraksinasi dengan menggunakan ammonium sulfat

(NH4)2SO4dan dialisis.

1. Fraksinasi

Fraksinasi merupakan proses pengendapan protein atau enzim dengan

penambahan senyawa elektrolit seperti garam ammonium sulfat, natrium

klorida atau natrium sulfat. Pada umumnya garam yang sering digunakan

adalah ammonium sulfat karena (1) kebanyakan enzim tahan terhadap garam

ini, (2) memiliki kelarutan yang besar dalam air, (3) mempunyai daya

pengendapan yang besar, dan mempunyai efek penstabil terhadap kebanyakan

18

Suhartono (1989), penambahan senyawa elektrolit menurunkan kelarutan

protein, karena kelarutannya dipengaruhi oleh kekuatan ion. Dengan

meningkatnya kekuatan ion, kelarutan enzim akan semakin besar atau disebut

dengan peristiwa salting in, setelah mencapai suatu titik tertentu kelarutannya

akan semakin menurun atau disebut peristiwa salting out. Pada kekuatan ion

rendah, protein akan terionisasi sehingga interaksi antar protein akan

menurun dan kelarutan akan meningkat. Peningkatan kekuatan ion ini

meningkatkan kadar air yang terikat pada ion, dan jika interaksi antar ion

kuat, kelarutannya menurun akibatnya interaksi antar protein lebih kuat dan

kelarutannya menurun (Agustien dan Munir, 1997).

2. Dialisis

Dialisis adalah suatu metode yang digunakan untuk memisahkan garam dan

larutan protein atau enzim berdasarkan prinsip membran semipermeabel

akibat adanya proses fraksinasi menggunakan garam pada tahap pemurnian

larutan protein atau enzim. Secara umum proses dialisis adalah dengan

memasukkan enzim atau larutan protein hasil fraksinasi kedalam kantong

dialisis yang bersifat membran semipermeabel (kantong selofan). Jika

kantong yang berisi larutan enzim dimasukkan ke dalam buffer sambil

diputar-putar, maka molekul kecil yang ada di dalam larutan enzim akan

keluar melewati pori-pori membran, sedangkan molekul besar akan tertahan

dalam kantong dialisis. Kendala ini dapat dilakukan dengan cara mengganti

19

konsentrasi rendah sampai ion-ion dalam kantong dialisis dapat diabaikan

(Lehninger, 1982).

F. Pengujian Aktivitas Selulase dengan Metode Mandels

Pengujian aktivitas selulase dilakukan dengan metode Mandels (Mandels et al.,

1976), yaitu berdasarkan pembentukan glukosa dari substrat Carboxy methyl

Cellulase (CMC) oleh enzim selulase yang dideteksi dengan penambahan

pereaksi Dinitrosalisilic acid (DNS) ke dalam larutan uji serta proses pemanasan,

sehingga akan dihasilkan larutan berwarna kuning hingga merah pekat. Semakin

pekat warna larutan sampel dibandingkan larutan kontrol, maka semakin tinggi

aktivitasnya.

G. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry

Penentuan kadar protein bertujuan untuk mengetahui bahwa protein enzim masih

terdapat pada setiap fraksi pemurnian (tidak hilang dalam proses pemurnian)

dengan aktivitas yang baik. Salah satu metode yang digunakan untuk menentukan

kadar protein adalah metode Lowry. Metode ini bekerja pada kondisi alkali dan

ion tembaga (II) yang akan membentuk kompleks dengan protein. Ketika reagen

folin-ciocelteau ditambahkan, maka reagen akan mengikat protein. Ikatan ini

secara perlahan akan mereduksi reagen folin menjadi heteromolybdenum dan

20

Pada metode ini, pengujian kadar protein didasarkan pada pembentukan komplek

Cu2+dengan ikatan peptida yang akan tereduksi menjadi Cu+pada kondisi basa.

Cu+dan rantai samping tirosin, triptofan, dan sistein akan bereaksi dengan reagen

folin-ciocelteau. Reagen ini bereaksi menghasilkan produk yang tidak stabil yang

tereduksi secara lambat menjadi molybdenum atau tungesteen blue. Protein akan

menghasilkan intensitas warna yang berbeda tergantung pada kandungan triptofan

dan tirosinnya.

Metode ini relatif sederhana dan dapat diandalkan serta biayanya relatif murah.

Namun, kekurangan dari metode ini adalah sensitif terhadap perubahan pH dan

konsentrasi protein yang rendah. Untuk mengatasi hal tersebut dapat dilakukan

dengan menggunakan volume sampel dalam jumlah kecil sehingga tidak

mempengaruhi reaksi (Lowry et al., 1951).

H. Zeolit

Zeolit merupakan adsorben yang unik, karena memiliki ukuran pori yang sangat

kecil dan seragam jika dibandingkan dengan adsorben yang lain seperti karbon

aktif dan silika gel, sehingga zeolit hanya mampu menyerap molekul-molekul

yang berdiameter sama atau lebih kecil dari diameter celah rongga, sedangkan

molekul yang diameternya lebih besar dari pori zeolit akan tertahan dan hanya

melintasi antar partikel. Dalam keadaan normal ruang hampa dalam kristal zeolit

terisi oleh molekul air yang berada disekitar kation. Bila zeolit dipanaskan maka

air tersebut akan keluar. Zeolit yang telah dipanaskan dapat berfungsi sebagai

21

Kemampuan zeolit mengadsorpsi sangat bergantung pada rasio Si/Al. Rasio Si/Al

rendah, zeolit bersifat hydrophilic mempunyai afinitas tinggi terhadap air dan

senyawa polar lainnya. Sebaliknya jika rasio Si/Al tinggi, maka zeolit bersifat

hydrophobic dan mengadsorpsi senyawa non-polar (Yuliusman dkk., 2010).

Sifat-sifat zeolit secara langsung berasal dari karakteristik tertentu, dari struktur

kristalnya, sehingga memiliki luas permukaan yang cukup besar. Zeolit dikenal

sebagai adsorben yang selektif dan mempunyai efektifitas adsorpsi yang tinggi

(Newsam, 1991).

Perbedaan jenis zeolit mempunyai daya serap (adsorption) molekul yang

berbeda-beda secara selektif. Keselektifan ini tergantung dari struktur masing-masing

jenis zeolit, sehingga zeolit dapat digunakan sebagai:

1. Penyaring ion, molekul atau sebagai katalis

Zeolit dapat menyaring ion, molekul, maupun atom karena mempunyai

saluran (channel) dan rongga (cavity) dalam struktur zeolit bila oxygen

window dari saluran atau rongga lebih kecil dari ion, molekul atau atom.

Zeolit mempunyai pori sehingga juga dapat digunakan sebagai katalis untuk

mempercepat reaksi dalam proses kimia.

2. Bahan penyerap

Bila zeolit dipanaskan pada suhu tinggi maka akan terjadi dehidrasi,

penguapan yang dikandungnya sehingga menyebabkan zeolit akan selektif

22

Proses penyerapan molekul oleh zeolit terjadi karena strukturnya juga

mempunyai polaritas yang tinggi.

3. Penukar ion

Pertukaran ion pada dasarnya terjadi dalam suatu cairan yang mengandung

anion, kation, dan molekul air. Penukaran ion juga dapat terjadi apabila salah

satu atau sebagian ion terikat pada matriks mikropori bersifat padat. Molekul

air dapat berada dalam mikropori bersama ion (kation, anion) dengan muatan

yang berlawanan dengan ion matriks sehingga terjadi kesetimbangan muatan

untuk mencapai keadaan netral, sehingga ion yang berada dalam cairan dapat

bergerak bebas di dalam matriks mikropori (Ginting dkk., 2007).

Struktur zeolit mengandung saluran atau hubungan rongga yang berisi kation dan

molekul air seperti yang tercantum pada Gambar 5.

Gambar 5. Struktur Zeolit (Kahar, 2007)

Struktur kerangka zeolit seperti yang tercantum pada Gambar 6.

23

Karakteristik struktur zeolit antara lain :

1. Sangat berpori, karena kristal zeolit merupakan kerangka yang terbentuk dari

jaring tetrahedral SiO4dan AlO4.

2. Pori-porinya berukuran molekul karena pori zeolit terbentuk dari tumpukan

cincin beranggotakan 6, 8, 10 atau 12 tetrahedral.

3. Dapat menukarkan kation, karena perbedaan muatan Al3+dan Si4+

menjadikan atom Al dapat kerangka kristal bermuatan negatif dan

membutuhkan kation penetral. Kation penetral yang bukan menjadi bagian

kerangka ini mudah diganti dengan kation lainnya.

4. Dapat dijadikan padatan yang bersifat asam. Karena penggantian kation

penetral dengan proton-proton menjadikan zeolit padatan asam Bronsted.

5. Mudah dimodifikasi karena setiap tetrahedral dapat dikontakkan dengan

bahan-bahan pemodifikasi (Kahar, 2007).

I. Amobilisasi

Amobilisasi enzim adalah proses pengikatan enzim secara fisik pada suatu

matriks tertentu yang tidak larut dalam air. Keuntungan teknik amobilisasi

diantaranya: dapat meningkatkan stabilitas enzim, memudahkan pengendalian

kondisi reaksi, enzim dapat digunakan berulang, dan kemurnian enzim maupun

produk lebih tinggi. Namun, kekurangan teknik amobilisasi, yaitu terjadinya

penurunan aktivitas katalitik enzim dan terjadinya pergeseran pH atau suhu

24

Amobilisasi dapat diklasifikasikan dalam tiga kategori, yaitu:

1. Metode pengikatan(carrier-binding) yang didasarkan pada pengikatan

enzim dengan carrier atau matriks yang tidak larut dalam air. Aktivitas

enzim amobil dipengaruhi oleh ukuran partikel dan luas permukaan

matriks. Pengikatan dapat dilakukan dengan cara:

a. Adsorpsi fisik yaitu enzim diadsorpsi pada permukaan matriks melalui

ikatan hidrofobik, ikatan hidrogen, dan gaya Van der Waals. Metode ini

mudah dilakukan,ekonomis, tidak merusak konformasi enzim, dan

penurunan aktivitas enzim cenderung rendah. Namun, kekuatan ikatan

antara enzim dan matriks cukup lemah dan rentan terhadap perubahan

pH. Jika pH atau kekuatan ion berubah, maka akan terjadi kebocoran

matriks. Matriks yang dapat digunakan, contohnya: bentonit, silikagel,

zeolit, kitosan, dan alumina. Enzim dan matriks dapat dipisahkan

kembali melalui filtrasi maupun sentrifugasi (Suhartono, 1989).

b. Ikatan kovalen antara gugus fungsi enzim yaitu αatau β-amino; α, β,atau

γ-karboksil; sulfohidril; hidroksil; imidazol; dan fenolik dengan

matriks yang mengandung gugus reaktif seperti diazonium; asam azida;

isosianat; dan halida. Ikatan yang terbentuk cukup kuat dalam mencegah

kebocoran matriks. Namun, jika konformasi berubah maka aktivitas

enzim akan hilang. Matriks yang digunakan pun sulit diregenerasi

c. Ikatan ionik antara gugus karboksil enzim bermuatan negatif dengan

gugus amina suatu matriks bermuatan positif pada matriks yang tidak

25

adsorpsi fisik.

2. Metode ikatan silang (cross-linking) antara molekul enzim dengan pereaksi

bergugus fungsi ganda. Kedua gugus fungsi tersebut akan mengikat

molekul enzim. Pereaksi yang biasa digunakan yaitu glutaraldehid. Untuk

meningkatkan stabilitas enzim, metode ini umumnya dipadukan dengan

metode adsorpsi.

3. Metode penjebakan (entrapment) yaitu penggabungan enzim ke dalam

kisi- kisi gel maupun polimer semipermeabel (mikrokapsul). Matriks gel

yang dapat digunakan, antara lain: poliakrilamida,κ-karagenan, dan

alginat. Polimer yang umum digunakan, yaitu selulosa asetat dan

amilum. Keunggulan metode ini yaitu tidak terjadinya perubahan

konformasi dan inaktivasi enzim karena enzim tidak berikatan dengan

matriks gel. Namun, kemampuan pembentukan kompleks enzim-substrat

cukup rendah apalagi jika berat molekul terlalu besar karena terhalang

kisi gel (Sirisha et al., 2016).

J. Kinetika Reaksi Enzim

Menurut Suhartono (1989) kinetika enzim merupakan salah satu cabang ilmu

enzimologi yang membahas faktor-faktor yang mempengaruhi laju reaksi.

Faktor-faktor yang mempengaruhi laju reaksi seperti; suhu, pH, konsentrasi

enzim, konsentrasi substrat, aktivator, inhibitor, dan waktu inkubasi. Berdasarkan

26

fase yaitu pembentukan kompleks enzim substrat (ES), E adalah enzim dan S

adalah substrat, modifikasi dari substrat membentuk produk (P) yang masih

terikat dengan enzim (EP), dan pelepasan produk dari molekul enzim (Shahib,

2005).

E+S ES EP E+P

Konsentrasi substrat pada laju reaksi divariasikan dan konsentrasi enzim tetap.

Kecepatan awal (V0) diukur sebagai kemiringan targen dalam kurva kemajuan

pada waktu t = 0. Ketika [S] >> [E], maka V0berbanding lurus dengan

konsentrasi enzim dalam campuran reaksi. V0adalah fungsi hiperbola

(persamaan Michaelis-Menten) dari [S]0yang bervariasi.

Ketika [S]0sangat besar maka V0= Vmaks (kecepatan maksimum) dan ketika V0

=Vmaks maka nilai [S]0= Km (tetapan Michaelis).

Persamaan Michaelis-Menten dapat menghasilkan garis lurus ketika satu variabel

baru diplotkan terhadap yang lain. Transformasi persamaan Michaelis-Menten

yang digunakan adalah persamaan“double reciprocal”Lineweaver-Burk.

Dengan mengambil resiprok dari dua sisi persamaan Michaelis-Menten, maka

27

Plot dari pasangan data (1/[S]0,i, 1/V0,i), untuk i = 1, ..., ...,n, dengan n adalah

jumlah pasangan data, akan memberikan suatu garis lurus dengan ordinat dan

absis intercept 1/Vmaks dan -1/Km, seperti pada Gambar 7

Gambar 7. Kurva Lineweaver-Burk (Suhartono, 1989).

K. Stabilitas Enzim

Menurut Wiseman (1985) dan Kazan et al. (1997) stabilitas enzim dapat

diartikan sebagai kestabilan aktivitas enzim selama penyimpanan dan penggunaan

enzim tersebut, serta kestabilan terhadap berbagai senyawa yang bersifat merusak

enzim seperti pelarut tertentu (asam atau basa) dan pengaruh suhu dan pH yang

ekstrim atau kondisi-kondisi non fisiologis lainnya. Ada dua cara untuk

meningkatkan stabilitas enzim agar tetap tinggi, yaitu menggunakan enzim yang

memiliki stabilitas enzim alami dan mengusahakan peningkatan stabilitas enzim

yang secara alami tidak atau kurang stabil.

1. Stabilitas termal enzim

Pada suhu yang terlalu rendah kemantapan enzim tinggi, tetapi aktivitasnya

28

kemantapannya rendah. Kenaikkan suhu enzim akan mempengaruhi

kecepatan laju reaksi, namun hanya sampai batas tertentu dan dapat

menyebabkan terjadinya denaturasi protein. Daerah suhu saat kemantapan

dan aktivitas enzim cukup besar disebut suhu optimum untuk enzim tersebut

(Wirahadikusumah, 1997).

Dalam industri, pada proses reaksinya biasanya menggunakan suhu yang

tinggi. Penggunaan suhu yang tinggi bertujuan untuk mengurangi tingkat

kontaminasi dan masalah-masalah viskositas serta meningkatkan laju reaksi.

Penggunaan enzim pada suhu yang lebih tinggi hingga 85-100 °C hanya

dijumpai pada proses hidrolisis pati dengan menggunakan α-amilase

bakterial. Oleh sebab itu,diperlukan enzim dengan stabilitas termal pada

rentang suhu yang tinggi.

2. Stabilitas pH enzim

Semua reaksi enzim dipengaruhi oleh pH medium tempat reaksi terjadi

(Suhartono, 1989). Stabilitas enzim dipengaruhi oleh banyak faktor seperti

suhu, pH, pelarut, kofaktor, dan kehadiran surfaktan (Eijsink et al., 2005).

Dari faktor faktor tersebut, pH memegang peranan penting. Diperkirakan

perubahan keaktifan pH lingkungan disebabkan terjadinya perubahan ionisasi

enzim, substrat atau kompleks enzim substrat. Enzim menunjukkan aktivitas

maksimum pada kisaran pH optimum enzim dengan stabilitas yang tinggi

(Winarno, 1989).

Pada reaksi enzimatik, sebagian besar enzim akan kehilangan aktivitas

29

optimum untuk reaksi enzimatik. Inaktivasi ini terjadi karena unfolding

molekul protein sebagai hasil dari perubahan kesetimbangan elektrostatik dan

ikatan hidrogen (Kazan et al., 1997).

L. Kulit Pisang

Pisang kepok merupakan salah satu jenis buah-buahan tropis yang tumbuh subur

dan mempunyai wilayah penyebaran merata di seluruh wilayah Indonesia. Pisang

termasuk komoditas unggulan yang mudah diusahakan, berumur singkat, dan

dapat dipanen sepanjang tahun.

Menurut Tjitrosoepomo (1991) pisang kepok memiliki klasifikasi dan ciri

morfologi sebagai berikut :

Regnum : Plantae

Divisio : Spermatophyta

Sub Divisi : Angiospermae

Classis : Monocotyledonae

Ordo : Musales

Familia : Musaceae

Genus : Musa

Spesies : Musa paradisiaca L.

Bagian yang dapat dimakan dari buah pisang adalah dua per tiga bagian dan

sepertiga bagian sisanya merupakan limbah pisang. Angka tersebut merupakan

jumlah limbah yang cukup banyak yang dapat mencemari lingkungan apabila

30

pisang juga mengandung karbohidrat yang relatif tinggi yaitu 18,50 % (Setiawati

dkk., 2013). Limbah kulit pisang kepok memiliki kandungan selulosa yang tinggi

(60-65 %), hemiselulosa 6-8 %, dan lignin 5-10 % (Tjahyono, 1998). Limbah

kulit pisang kepok mengandung monosakarida terutama glukosa sebesar 8,16 %.

Limbah kulit pisang berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai bahan baku dalam

pembuatan bioetanol melalui proses fermentasi (Setiawati dkk., 2013).

M. Hidrolisis Enzimatik

Hidrolisis merupakan proses pemecahan polisakarida di dalam biomassa

lignoselulosa, yaitu selulosa dan hemiselulosa menjadi monomer gula

penyusunnya. Pada hidrolisis sempurna selulosa akan menghasilkan glukosa,

sedangkan hemiselulosa menghasilkan beberapa monomer gula pentosa (C5) dan

heksosa (C6). Hidrolisis dapat dilakukan secara kimia (asam) atau enzimatik.

Aplikasi hidrolisis menggunakan enzim secara sederhana dilakukan dengan

mengganti tahap hidrolisis asam dengan tahap hidrolisis enzim selulase.

Keuntungan hidrolisis enzimatis dibandingkan dengan hidrolisis asam adalah

kondisi reaksi ringan dan tidak terjadi reaksi samping yang berarti (Seftian dkk.,

2012).

Faktor-faktor yang berpengaruh pada proses hidrolisis enzim diantaranya, yaitu

kualitas dan konsentrasi substrat, metode perlakuan awal yang diaplikasikan,

aktivitas enzim selulase dan kondisi proses hidrolisis seperti suhu dan pH. Suhu

31

hidrolisis. Suhu dan pH optimum pada enzim selulase umumnya pada 40 –50oC

dan pH 4–5, sehingga waktu yang digunakan tergantung pada kondisi tersebut.

Salah satu faktor utama yang berpengaruh terhadap hasil yang diperoleh dan

kecepatan hidrolisis enzimatis adalah substrat. Konsentrasi substrat yang tinggi

dapat menyebabkan penghambat yang memperlambat proses hidrolisis.

Terjadinya penghambat oleh substrat tergantung pada perbandingan antara

banyaknya enzim terhadap banyaknya substrat. Masalah pengadukan dan

perpindahan panas juga akan timbul pada substrat yang berkonsentrasi tinggi.

Banyaknya enzim yang ditambahkan pada substrat sangat berpengaruh terhadap

kecepatan proses hidrolisis. Semakin banyak enzim yang ditambahkan akan

semakin cepat proses hidrolisis yang terjadi dan hasil yang diperoleh juga

semakin banyak, tetapi semakin tinggi biaya yang harus dikeluarkan. Banyaknya

enzim yang ditambahkan pada substrat biasanya 5 –35 FPU/gram substrat.

Pengurangan biaya untuk penyediaan enzim pada proses hidrolisis enzim dapat

dilakukan dengan daur ulang enzim selulase. Bercampurnya enzim dalam

hidrolisat dan terbentuknya sisa proses yang berupa padatan (kemungkinan lignin)

mempersulit proses pemisahan enzim. Alternatif yang dapat dilakukan untuk

32

Gambar 8. Reaksi hidrolisis selulosa dengan enzim (Tomas et al., 2010).

N. Glukosa

Glukosa merupakan suatu aldoheksosa, disebut juga dekstrosa karena

memutar bidang polarisasi ke kanan. Glukosa merupakan komponen utama

gula darah, menyusun 0,065-0,11% darah kita. Glukosa dapat terbentuk dari

hidrolisis pati, glikogen, dan maltosa. Glukosa sangat penting bagi kita karena

sel tubuh kita menggunakannya langsung untuk menghasilkan energi.

Glukosa dapat dioksidasi oleh zat pengoksidasi lembut seperti pereaksi

Tollens sehingga sering disebut sebagai gula pereduksi (Budiman, 2009). hidrolisis enzimatik

selulase

hidrolisis enzimatik glukosa

hidrolisis enzimatik

Produksi degradasi glukosa

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Waktu penelitian dilakukan pada bulan Maret–Juli 2018 di Laboratorium

Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas, jarum ose,

mikropipet Eppendroff, neraca analitik, lemari pendingin, pembakar spirtus,

sentrifuga, magnetik stirer, autoclave model S-90N, oven, laminar air flow

CRUMA model 9005-FL, waterbatch shaker incubator HAAKE, pH meter,

penangas air, waterbath incubator, ayakan 100 mesh, dan spektrofotometer

UV-VIS Cary Win UV 32.

Adapun bahan-bahan yang digunakan adalah Potato Dextrose Agar (PDA),

(NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2, MgSO4, urea, FeSO4•7H2O, ZnSO4•7H2O, CoCl2,

pepton, NaOH, glukosa, Carboxymethyl Cellulase (CMC), akuades,

34

Na2SO3, HCl, Na2CO3, CuSO4•5H2O, Bovine Serum Albumin (BSA), akuades,

kantong selofan, dan zeolit. Adapun mikroorganisme yang digunakan adalah

jamur Aspergillus niger L-51 penghasil enzim selulase.

C. Prosedur Penelitian

1. Pembuatan Media Inokulum dan Media Fermentasi

a. Pembuatan Media Inokulum

Media inokulum digunakan sebagai media adaptasi awal pertumbuhan dan

media perkembangbiakan spora jamur pada media cair. Media inokulum

dibuat dengan cara menimbang bahan-bahan yang terdiri dari (NH4)2SO40,14

g; K H2PO40,2 g; urea 0,03 g; CaCl20,03 g; MgSO40,03 g; FeSO4•7H2O

0,0005 g; ZnSO4•7H2O 0,00014 g; CoCl20,0002 g; pepton 0,075 yang

dilarutkan dalam buffer fosfat 0,2 M pH 5 sebanyak 100 mL dalam labu

Erlenmeyer 250 mL dan disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu

121oC, tekanan 1 atm selama 15 menit. Selanjutnya media inokulum dikocok

dalam waterbath shaker incubator dengan kecepatan 130 rpm pada suhu

35oC selama 24 jam (Meriyanti, 2014).

b. Pembuatan Media Fermentasi

Media fermentasi yang digunakan (gL-1) terdiri dari (NH4)2SO41,4 g;

KH2PO42,0 g; urea 0,3 g; CaCl20,3 g; MgSO40,3 g; FeSO4•7H2O 0,005

g; ZnSO4•7H2O 0,0014 g; CoCl20,002 g; pepton 0,75 g; dan media

35

tekanan 1 atm selama 15 menit. Selanjutnya dimasukkan larutan media

inokulum sebanyak 2% total volume media fermentasi ke dalam

masing-masing media fermentasi secara aseptis lalu dikocok dalam waterbath shaker

incubator dengan kecepatan 130 rpm pada suhu 35oC selama 72 jam. Lalu

diuji aktivitas enzim selulase dengan metode Mandels (Meriyanti, 2014).

2. Isolasi Enzim Selulase

Isolasi enzim selulase dilakukan menggunakan metode sentrifugasi. Prinsip

sentrifugasi, yaitu memisahkan endapan dari suspensi dengan teknik sedimentasi.

Sentrifugasi digunakkan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa gel.

Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah (di bawah suhu kamar) untuk menjaga

kehilangan aktivitas enzim (Suhartono, 1989). Untuk memisahkan enzim dari

komponen sel lainnya digunakan metode sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm

selama 20 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim yang

selanjutnya dilakukan uji aktivitas enzim selulase dengan metode Mandels.

3. Pemurnian Enzim Selulase

Setelah enzim selulase diisolasi, kemudian enzim tersebut dimurnikan

menggunakan metode fraksinasi dengan menggunakan ammonium sulfat

(NH4)2SO4dan dialisis.

a. Fraksinasi

Ekstrak kasar enzim yang telah diperoleh selanjutnya diendapkan dengan

36

yaitu 0-20%; 20-40%; 40-60%; 60-80%; dan 80-95%. Skema fraksinasi

dapat dilihat pada Gambar 9.

Ekstrak Kasar Enzim

+ (NH4)2SO4(0-20%)

Endapan (F1) Filtrat

+ (NH4)2SO4(20-40%)

Endapan (F2) Filtrat

+ (NH4)2SO4(40-60%)

Endapan (F3) Filtrat

+ (NH4)2SO4(60-80%)

Endapan (F4 Filtrat

+(NH4)2SO4(80-95%)

Endapan (F5) Filtrat

Gambar 9. Skema proses fraksinasi enzim dengan ammonium sulfat

Endapan protein enzim yang didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan

ammonium sulfat, dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi pada

kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Kemudian endapan yang diperoleh

37

b. Dialisis

Endapan enzim dari tiap fraksi hasil fraksinasi dimurnikan dengan cara

dialisis melalui membran semipermeabel (kantong selofan). Endapan

tersebut dimasukkan kedalam kantong selofan dan didialisis menggunakan

buffer fosfat pH 5 0,01 M selama 24 jam pada suhu dingin (Pohl, 1990).

Selama dialisis, dilakukan pergantian buffer selama 4-6 jam agar konsentrasi

ion-ion di dalam kantong dialisis dapat dikurangi.

Untuk mengetahui bahwa sudah tidak ada lagi ion-ion garam dalam kantong,

maka diuji dengan menambahkan larutan Ba(OH)2atau BaCl2. Bila masih

ada ion sulfat dalam kantong, maka akan terbentuk endapan putih BaSO4.

Semakin banyak endapan yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat

yang ada dalam kantong. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode

Mandels dan diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.

4. Uji Aktivitas Enzim Selulase Metode Mandels(Mandels et al., 1976).

a. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran aktivitas enzim selulase metode

Mandels (Mandels et al., 1976).

Pada labu takar 100 mL, dimasukkan 1 g DNS, selanjutnya ditambahkan 1 g

NaOH lalu dikocok hingga larut, kemudian ditambahkan 1 mL larutan

Na(K)-tartarat 40 %, 0,2 g fenol, dan 0,05 g Na2S2O3kemudian dilarutkan dengan

100 mL akuades hingga tanda batas.

b. Uji aktivitas enzim selulase metode Mandels (Mandels et al., 1976)

38

Sebanyak 0,25 mL enzim ditambah 0,25 mL larutan CMC 0,5% dalam

bufferfosfat pH 5,0 dan kontrol (0,25 mL enzim), yang masing-masing

diinkubasi selama 60 menit dalam waterbath incubator pada suhu 50oC.

Kemudian kontrol ditambahkan dengan 0,25 mL (larutan CMC 0,5% dalam

buffer fosfat pH 5,0) dan selanjutnya sampel dan kontrol ditambahkan 1 mL

pereaksi DNS dan dididihkan selama 10 menit pada penangas air. Kemudian

masing-masing ditambahkan 1,5 mL akuades lalu didinginkan. Setelah

dingin, serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-VISpada λ

510 nm. Kadar glukosa yang terbentuk ditentukan dengan mengunakan kurva

standar glukosa.

5. Penentuan Kadar Protein Metode Lowry (Lowry et al., 1951).

a. Pembuatan pereaksi untuk penentuan kadar protein enzim selulase metode Lowry

1. Pereaksi A : 2 g Na2CO3dilarutkan dalam 100 mL NaOH 0,1 N

2. Pereaksi B : 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% ditambahkan kedalam 5 mL

larutan Na(K) tartarat 1 %

3. Pereaksi C : 2 mL pereksi B ditambahkan 100 mL pereaksi A

4. Pereaksi D : reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades 1:1.

5. Larutan standar : larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan kadar 0,

20, 40, 60, 80, 100, 120, dan 140 ppm.

b. Penentuan kadar protein

Sebanyak 0,1 mL enzim selulase ditambahkan 0,9 mL akuades lalu

39

selama 10 menit pada suhu ruang, setelah itu ditambahkan dengan cepat 0,5

mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit

pada suhu kamar. Untuk kontrol, 0,1 mL enzim diganti dengan 0,1 mL

akuades, selanjutnya perlakuannya sama seperti sampel. Serapannya diukur

menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 750 nm.

Untuk menentukan konsentrasi protein enzim digunakan kurva standar BSA.

6. Amobilisasi Enzim Selulase Hasil Pemurnian dengan Zeolit

a. Preparasi matriks zeolit

Serbuk zeolit diayak menggunakan ayakan berukuran 120 mesh. Aktivasi

zeolit alam dilakukan dengan cara mencampurkan 30 gram zeolit alam dan

100 mL HCl 3 M. Campuran dipanaskan sambil diaduk pada suhu 90oC

selama 2 jam, kemudian didinginkan, disaring dan dicuci dengan akuades

sampai zeolit tidak berwarna kekuningan lagi, lalu keringkan dalam oven

pada suhu 105oC selama 5 jam, dan disimpan dalam desikator (Septiani dan

Lisma, 2011).

b. Penetapan pH untuk proses pengikatan enzim selulase pada zeolit

Enzim selulase diikatkan dengan matriks dengan variasi pH 4; 4,5; 5; 5,5;

6; 6,5; dan 7 dengan menggunakan buffer fosfat 0,1 M. Kemudian matriks

diisi dengan 0,5 mL larutan enzim dan dielusi dengan buffer yang sesuai,

diaduk kemudian disentrifugasi selama 5-10 menit. Selanjutnya supernatan

40

c. Amobilisasi enzim selulase

Sebanyak 0,25 mL larutan enzim selulase diamobil dengan zeolit pada pH

optimum pengikatan. Enzim selulase diikatkan pada zeolit dengan cara

mencampurkan 0,25 mL enzim selulase dengan 0,25 gram zeolit. Kemudian

campuran diaduk hingga rata dan disimpan dalam freezer selama 30 menit.

Selanjutnya dicuci dengan akuades sebanyak tiga kali. Lalu dikeringkan pada

suhu kamar (Oktariani,2018).

d. Pemakaian berulang enzim amobil

Enzim amobil yang telah dipakai (direaksikan dengan substrat), dipakai

kembali untuk direaksikan kembali dengan substrat dengan uji metode

Mandels. Pemakaian berulang ini dilakukan hingga 4 kali.

7. Karakterisasi Enzim Selulase Murni dan Amobil

a. Penentuan suhu optimum

Untuk mengetahui suhu optimum kerja enzim dilakukan dengan

memvariasikan suhu yaitu 50; 55; 60; 65; 70; 75; dan 80oC. Selanjutnya

aktivitas enzim diukur dengan metode Mandels.

b. Penentuan KM dan Vmaks

Konstanta Michaelis-Menten (KM) dan laju reaksi maksimum (Vmaks) enzim

selulase ditentukan dengan memvariasikan konsentrasi substrat 0,1; 0,2; 0,4;