Sản xuất và sử dụng chế phẩm sinh học trong nông nghiệp - Lương Đức Phẩm

LƯƠNG ĐỨC PHẨM

SHN XUHT VH sú DỤNG

GHÊ PHHM SINH HỘC

TRONG NÔNG NGHIỆP

LƯƠNG ĐỨC PHẨM

SẢN XUẤT VÀ SỬ DỤNG

CHÊ PHẨM SINH HỌC TRONG NÔNG NGHIỆP

LỜI NÓI ĐẨU

Với mục đích làm tăng năng suất cây trồng, vật nuỏi, tạo cho một nền sản xuất nông nghiệp sạch và bền vững, các chế phẩm sinh học ngày càng được quan tâm và đưa vào sử dụng trong trồng trọt, chăn nuỏi và nuôi trổng thủy sản. Nội dung của vấn đề này là sử dụng các vi sinh vật có ích hoặc những hoạt chất sinh học do chúng tạo ra giúp cho các đối tượng nông nghiệp nâng cao được khả năng đổng hóa và trao đổi chất, nâng cao tính đề kháng với bệnh tật, tạo ra những điều kiện sống của cây trồng vả vật nuôi hài hòa với thiên nhiên. Ngoài ra, có thể sử dụng các hợp chất hữu cơ tự nhiên làm chế phẩm cân đối dinh dưỡng hoặc làm phân bón hữu cơ thân thiện với mỏi trường.

Quyển sách gồm hai phần: Các chế phẩm sinh /i ọ c. dùng trong

trồng trọtvà Các ch ế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi, nuôi trồng

thủy sản.

Trên cơ sồ là các bài giảng chuyên đề của các lớp cao học sinh học cùng với 2 quyển sách của tác giả về một phần của vấn đề này được biên soạn lại. Đối tượng của sách phục vụ cho những ai quan tâm đến việc sử dụng các chế phẩm sinh học, đặc biệt là từ vi sinh vật, vào sản xuất nông nghiệp. Sách cũng giúp cho sinh viên những năm cuối và học viên cao học các trường cao đẳng Và đại học thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm, Công nghệ sau thu hoạch của các trường nông nghiệp cũng như kinh tế có liên quan.

Việc sử dụng các chế phẩm sinh học trong nông nghiệp hiện nay rất đa dạng và phong phú nên sách chưa thể đáp ứng hết được nhu cầu của các bạn đọc. Tác giả và Nhà xuất bản hoan nghênh các ý kiến đóng góp bổ sung của bạn đọc. iviọi ý kiến đóng góp xin gửi về cỏng ty c ổ phần sách Đại học - Dạy nghề, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, 25 Hàn Thuyên, Hà Nội, ĐT (043) 8264974 .

Xin chân thành cám ơn.

Tác giả

PGS. TS. Lương Đức Phẩm

Phần thứ nhất

CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC

DÙNG TRONG TRỔNG TRỌT

Chương 1

PHÂN BÓN VI SINH VẬT

Có lẽ th u ậ t ngữ "p h ân bón vi sin h v ậ t” d ù n g ở đây ch ư a đ ú n g với ý n g h ĩa thực của lĩnh vực này. Đ ây là các c h ế p h ẩm vi sin h v ậ t (gồm các tế bào sổng có hoặc không có c h ấ t m ang) dù n g làm p h â n bón cho cây và làm tă n g độ p h ì của đ ấ t cũng n h ư cung eâ'p cho cây trồ n g các c h ấ t d in h dưỡng dễ tiê u hoá kích th íc h sin h trư ởng.

Việc th u hoạch sin h khối thực vật h àn g năm lây đi của đ ấ t n h iều nitơ. Q uá trìn h bổ sung nitd xảy ra tro n g tự nhiên quá chậm không đáp ứng được n h u cầu sản x u ấ t ổn định trong trường hợp th â m canh nông nghiộp. Sự th iếu h ụ t đó bấy lâu nay được bù dắp bàng cách bón p h ân đạm loại p h ân hoá học cho cây trồng. Vi ộc làm này dã góp phần tăn g náng s u ấ t cho cây trồng, song cũng đê lại cho đ ấ t n h iều h ậ u quả: đ ấ t bị chua dần, độ rắ n cơ lý tă n g dần,... làm cho đ ấ t bạc m àu và điều nguy hiếm hơn là các ch ất dư thừ a của phân hoá học tích tụ lại ở trong đâ't hoặc thải vào nguồn nước làm cho dất, nước bị ô nhiễm , ản h hưởng xấu tới hệ sinh th ái và môi trường sổng.

Vi sin h v ậ t dóng vai trò q u a n trọ n g tro n g viộc chuyổn hoá v ậ t c h ấ t ở tro n g đ ấ t và ản h hương r ấ t lớn đến h ấp th u dinh dưổng ỏ thự c v ật. Các nhóm vi sin h v ậ t có vai trò lớn tro n g v ấn đề n ày là: các vi sin h v ậ t sông tự do tro n g đ ấ t và sông cộng sin h với cây họ Đ ậu có k h ả n ă n g cô" đ ịn h đạm của không khí. C h ú n g được ch ú ý đến r ấ t sớm và từ ch ú n g được s ả n x u ấ t ra các ch ế p h ẩm làm p h â n bón để làm tă n g nguồn dạm tiê u hoá cho cây trồ n g . N goài ra , người ta còn chú ý đến nh ó m vi k h u ẩ n p h â n giải hợp c h ấ t phospho h ữ u cơ, vô cơ, nhóm vi nấm , nhóm vi sin h số n g hội sin h ồ lá, ở biểu bì thự c vật, nhóm tảo lam , nhóm tảo sống vối bèo hoa d â ư ,... đều có th ể dù n g đế sản x u ấ t p h â n bón vi sin h v ậ t h ay là p h â n bón sin h học.

Các loại p h â n bón sin h học h iện nay được d ù n g tro n g trồ n g trọ t gồm các loại: ~ P h â n vi sin h cô' đ ịn h N* (thư ờ ng gọi là p h â n đạm s in h học) được sản x u ấ t từ các ví k h u ẩ n n ô t s ầ n sông cộng sin h với cây họ Đ ậu, các vi k h u ẩ n n à y sông tự do tro n g đ ấ t và sông hội sin h với các loại cây trồng. Loại p h â n n à y có th ể kể cả bèo hoa dâu, tảo lam (vi k h u ẩ n lam ).

- P h â n lâ n vi sin h được c h ế biến từ sin h khối của các loài vi s in h v ậ t (vi k h u ẩ n , xạ k h u ẩ n , n ấ m sợi) sống ở tro n g đ ấ t hội sin h với cây trồ n g , ch ủ yếu ở v ù n g rễ. Có h ai loại p h â n lâ n vi sin h : p h â n giải các hợp c h ấ t phospho (P) h ữ u cơ và p h â n giải hợp c h ấ t phospho vô cơ.

- P h â n vi sin h v ậ t biểu sin h được c h ế từ sin h khối vi s in h v ậ t b iểu sin h sông hội sin h với cây trồ n g ỏ b iểu bì th â n , lá.

VI SINH VẬT NO 3

1.1. PHÂN VI SINH CÔ ĐỊNH NITƠ PHÂN TỬ (N2) TỪ KHÔNG KHÍ (tên thường gọi: phân vi sinh vật cố định đạm, phân đạm vi sinh hay phân đạm sinh học)

Nitơ tro n g tự n h iê n tồ n tạ i ở các d ạn g k hác n h a u , từ d ạ n g p h â n tử (N2) tro n g k h ô n g k h í đến các d ạ n g hợp c h ấ t phức tạ p (p ro tein , a x it nucleic, k itin ,...) tro n g cơ th ể người và động, th ự c v ật. K hi cơ th ể sin h v ậ t c h ế t đi, các hợp c h ấ t h ữ u cơ này vùi tro n g đ ấ t và được các vi sin h v ậ t hoại sin h dị dưỡng p h â n huỷ, được

gọi là k h o á n g hoá. Q u á tr ì n h k h o á n g hoá các hợp c h ấ t h ữ u cơ, tro n g đó có các hợp c h ấ t nitơ là vô cù n g q u a n trọ n g tro n g đời sông của to à n th ể s in h v ậ t tr ê n T rá i Đ ấ t và đặc b iệ t tro n g bảo vệ môi trư ờ n g (p h ần này sẽ được đề cập tới ở chương 2).

Các k h â u của vòng tu ầ n h o àn đều có sự th a m gia của vi sin h v ậ t (h ìn h 1.1). K hoáng h o á hợp c h ấ t ch ứ a n itơ là m ột k h â u q u a n trọ n g củ a vòng tu ầ n h o à n nitơ tro n g tự n h ic n (h ìn h 1.1 và 1.2).

Hình 1.1. Sơ đổ vòng tuẩn hoàn nitơ trong tự nhiên

Hình 1.2. Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên

1. Vi sinh vật cố định N^; 2. Vi sinh vật cộng sinh cố định N2; 3. Protein thực vật và vi sinh vật; 4. 8. Proteoliz (phân huỷ protein); 5. sản phẩm phân huỷ; 6. Amôn hoá; 7. Mùn; 9. Protein động vật; 10. Nitrai hoá' 11 Phản nitraí hoá; 12. Khử đổng hoá; 13. Rửa trôi.

T ro n g k h í q u y ển có tối 78,16 % nitơ p h â n tử. Ước tín h cột k h í q u y ển trù m lên l h a đ ấ t có tối 8 triệ u tấ n nitơ, n h ư n g cây trồ n g k h ô n g th ể đồng hoá trự c tiếp được.

H ằng nàm , cây trồ n g lấy đi từ đ ấ t h àn g triộu tấ n nitơ. B ằn g cách bón p h â n (phân chuồng, p h â n hoá học) con người mới trả lại cho đ ấ t được k h o ả n g trê n 40% sô" đó, còn lại là do vi sin h v ậ t p h â n huỷ các xác động, thực v ậ t vùi tro n g d ấ t và cố’ đ ịn h nitơ. Ngoài ra, do sấm sét biên nitơ p h ân tử (N2) th à n h n itr a t (N O :í) theo m ư a rơi xuống đât. Chi’ tín h riêng vi k h u ẩ n nôt sần cộng sinh với cây họ Đ ậu h ằ n g năm làm giàu nitơ cho đ ấ t 1 0 0 - 2 0 0kg cho 1 ha, vi sinh v ậ t sông tự do cố đ ịn h nitơ - 5kg/ha và k h o ản g 3 - 30kg/ha hợp ch ất ni tơ từ không k h í được rơi xuông đ ấ t theo các tr ậ n m ưa.

T rong đòi sống h ằ n g ngày của con người, xác động, th ự c v ậ t có ch ứ a p ro tein , a x it nucleic, lip o pro tein, k itin ,,.. được th ả i ra ở d ạn g rác th ả i hoặc ở tro n g nước với số lượng vô cùng lớn. V ấn đề p h â n giải các hợp c h ấ t chứ a n itơ tro n g xác động, th ự c v ậ t cũng vô cùng cấp bách. Sự p h â n giải này sẽ tạo ra các hợp c h ấ t cho cây trồ n g dễ tiôu hoá và còn có tá c d ụ n g làm sạch môi trư ờ n g sông của ỉoài người.

1.1.1. Cố định nitd phân tử của không khí

Nitơ là ng u y ên tố d in h dưõng q u an trọ n g không th ể th iế u được đối với cây trồng, m à ngay cả đôi với vi sin h vật. N guồn dự trữ nitơ tro n g tự n h iê n r ấ t lón, chỉ tín h ric n g tro n g k h ôn g khí, nitơ chiếm k h o ản g 78,16% thổ tích c ủ a k h ô n g khí. Người ta ước tín h rằ n g tro n g b ầ u không k h í bao trù m lên l h a đ ấ t đai ch ứ a k h o ả n g 8 triệ u tấ n nitơ, lượng n itơ này có th ể cung cấp d in h dưỡng cho cây trồ n g h à n g chục triộ u năm , song thực v ậ t không thổ đồng hoá dược loại nitơ này ở d ạ n g p h â n tủ (N 2).

T rong cơ th ể các loại sin h v ậ t trê n T rá i D ất ch ứ a k h o ả n g 1 0 - 2 5 .109 tấ n nitơ. T rong các trầ m tích chứa k h o ả n g 4.1015 tỷ tấ n nitơ. N h ư n g t ấ t cả nguồn nitơ trê n , cây trồ n g đều không tự đồng hoá được, m à p h ả i nhờ vi s in h v ật. T h ô n g q u a h o ạt động sống củ a các loài vi sin h v ật, nitơ nằm tro n g các d ạ n g k h ác n h a u được ch u y ển hoá th à n h dễ tiê u cho cây trồ n g sử dụng.

H ằng năm , cây trồng lấy đi từ đ ất h àn g trăm triệ u tấ n nitơ. B ằng cách bón phân, con người trả lại cho đ ấ t được khoảng > 40%, lượng th iếu h ụ t còn lại cơ bản được bổ sung bằng nitơ do hoạt động sông của vi sinh vật. Vi sinh v ậ t biến nitơ p h ân tử (N2) của không k h í th à n h nitơ dễ tiêu hoá ở dạng am ôn để cây trồng có thổ dồng hoá được.

Vậy q u á trìn h cố đ ịn h nitơ p h â n tử là quá trìn h đồng hoá n itơ củ a k h ô n g k h í th à n h nitơ am ôn dưới tá c d ụ n g của m ột số vi sin h v ậ t có h o ạ t tín h n itro g cn a za .

Q uá tr ìn h cô' đ ịn h nitơ được Iie llrig el và U n frac tìm ra n ă m 1886. Q uá trìn h này xảy ra nhờ các vi sin h v ậ t sống tự do tro n g đ ấ t và sống cộng s in h ồ rẽ cây họ Đ ậu tạo th à n h n ố t s ầ n - th ư ờ n g gọi là vi k h u ẩ n nôt sần. Các vi k h u ẩ n n ày đểu có h o ạ t tín h n itro g en a za .

1.1.2. Cơ chế của quá trình cố định nỉtơ phân tử

Các vi sin h v ậ t có h o ạ t tín h enzym n itro g en a za p h á đ ứ t mối liên k ế t ba củ a p h â n tử nitơ (N = N) tương đôi. dễ dàng trong điều kiện bình thường về n h iệ t độ và áp suất. T rong k h i đó tro n g công n g h iệp hoá học, m uôn sả n x u ấ t được p h â n bón hoá học p h ải có trìn h độ công n g h ệ và tr a n g th iế t bị cao để tạo r a được n h iộ t dộ 400 - 500°c và áp s u ấ t 200 - l.OOOatm và n h ữ n g c h ấ t xúc tác đ ắ t tiền.

Q uá tr ìn h cố đ ịn h nitơ p h â n tử là q u á tr ìn h k h ử N2 th à n h N H3 nhò enzym n itro g e n a z a và n ă n g lượng s in h học ở d ạn g ATP:

N., + A H , + A TP _{“ AH* la chất cho electron}| N- ur0tgT a / |— ---> N H , + A + A D P

N àm 1992, các n h à k h o a học đã h o àn th iệ n qu á tr ìn h n à y và được tr ìn h b ày sơ g iản n h ư sau :

N = N N H = N H -> H2N ~N H2 -► N H3

N2 + 6e + 12ATP + 12H20 - Nitrogenaza > 2NHj+ + 12ADp + 12p + 4H +

Các hợp chất khử Mg2+ Feredoxin Flavodoxin JvJitrogenaza ATP ADP C2H2 n h3 H2 C2H4 Protein 1 Fe Protein 2 Fe Nitrogenaza Protein 1 ATP Feredoxin khử N2 1 /

L . . . Ẩ ____

Feredoxin oxy hoá

N H 3 Coíatơ khử Chu trình axít xitric Glucozo, saccarozo, axit hữu cơ Hỉnh 1.3. Quá trình cô định nitơ phân tử

N itro g en aza đ ã được ch iết x u ấ t ra từ Azotobacter vinelandii - m ột loài vi k h u ẩ n cố' định nitơ sông tự do tro n g đất. N itrogenaza bao gồm h a i th à n h p h ầ n k h ác n h au , m ột th à n h p h ần gồm pro tein và Fe; m ột th à n h p h ần gồm p ro tein v à Fe, Mo. E lectron của các ch ất khử sẽ đi vào th à n h p h ần th ứ n h ấ t của n itro g en aza (p h ần có chứa pro tein và sắt), sau đó được chuyển san g th à n h p h ần th ứ hai, qua đó electron được h o ạ t hoá có th ể p h ản ứng với N 2. N2 cũng đi qua 2 th à n h p h ẫn của n itro g en aza và được h o ạ t hoá, H ydro được h o ạt hoá nhờ các enzym của hệ thông hydrogenaza. N ăn g lượng dù n g tro n g quá trìn h này là ATP cua tê bào. Cuôi cùng, NH3 dược h ìn h th à n h . Có th ể tóm tắ t trong sơ đồ sau (thể hiện ỏ h ìn h 1.3) và mô h ìn h hoá th ể hiện ỏ h ìn h 1.4:

Feredoxin dạng oxy hoá Electron N,

i

t

Q uá trìn h cô đ ịn h nitơ là m ột quá tr ìn h k h ử liên tụ c N2 qu a d iim it và h y d ra g in tới N H :Ỉ: ATP a ) Feredoxin - H z Feredoxin Feredoxin - H 2 Feredoxin << 2NH, b) N=N + 6H ADP + Pi 2NH,

/

/

\

a) Vòng tròn nhỏ chỉ azoferedoxin; vòng tròn to chỉ molybdoferredoxin; H+ và Mo chỉ chất khử molybdoferedoxin b) Hoạt tính nitrogenaza có thể được xác định; nhờ hoạt tính khửaxetylen (C2H2 hoặc C2H4)

Enzym n itro g e n a z a ngoài tác d ụ n g k h ử N2 th à n h N H3 còn có k h ả n ă n g xúc tác cho việc k h ử m ột số c h ấ t khác. Ví dụ: nó có th ể k h ử ax ety len th à n h ety len . P h ả n ứng k h ử ax ety len ngày n ay được d ù n g để xác định h o ạ t tín h n itro g e n a z a (h ìn h 1.4b).

Về lý th u y ế t, để k h ử m ột N2 cần 6 electron (tức cần ít n h ấ t 12ATP; 4A TP/ 1 cặp e), còn k h ử 1 p h â n tử C2H2 chỉ cần 2 electron. C ăn cứ vào lư ợng C2H4 sin h ra m à xác đ ịn h được lượng nitơ cô' đ ịn h được của vi sin h v ậ t cố* đ ịn h m tơ.

Hệ n itro g e n a z a b ấ t h o ạ t tro n g môi trư ò n g có oxy p h â n tử, ỏ n h iệ t độ

0°c.

n h ư N ostoc, A n a b a e n a th ì q u á trìn h cô" đ ịn h nitơ lại diễn r a tro n g tê bào dị h ìn h , nơi chỉ có PS] h o ạ t động (h ìn h 1.5a), q u an g hợp không giải phóng oxy p h â n tử.

Dị bào nang Tê b^ ° sinh dưỡng

7

Ánh sáng CƠ2 Ánh sáng C 0 2

Hình 1.5a. Nitơ phân tử được cố định tại dị bào nang (heterocyst)

Vòng tròn: tế bào sinh dưỡng (nơi quang hợp có PS,|, PS, cùng hoạt động); Hình chữ nhật: dị bào nang, nơi chỉ có PS| hoạt động.

Còn đốí với vi s in h v ậ t sống hiếu k h í cô" đ ịn h n itơ th ì v a i trò củ a h ệ h y d ro g en aza r ấ t q u a n trọ n g , nó b iến ngay oxy dư th ừ a sa u hô h ấ p th à n h H 20 (h ìn h 1.5b).

Chất hữu cơ

Hình 1.5b. Sự cố định nitơ ồ tế bào vi sinh vật hiếu khí

Nhò có vi s in h v ậ t cô' đ ịn h n itơ đã đóng k ín chu tr ìn h n itơ tro n g tự n h iê n (h ìn h

1.1 và 1.2).

A zotobacter là loại vi k h u ẩ n h iế u khí, song quá trìn h cô" đ ịn h nitơ lại là m ột qu á

trìn h k h ử ỏ đ iều k iện k h ô n g có oxy. H ai điều kiện trá i ngược n h a u được th o ả m ãn đốỉ vói m ột tế bào là do A zo to b a cter có n h iều m àng lipoprotein. B ên ngoài m àn g là n h ữ n g m en hô h ấ p h o ạ t động, sử d ụ n g oxy để h ìn h th à n h ATP và làm cho oxy không th ấ m vào p h ía tro n g m àng, nơi đó có n itro g en aza tiến h à n h cố' định ni tơ ở điều k iện kỵ khí.

N H ;ì được h ìn h th à n h đến m ột mức độ nào đó sẽ kìm h ã m sự h o ạ t động của n itro g e n a z a , nó c h ín h là yếu tô' điều hòa h o ạ t tín h củ a enzym .

Ó vi k h u ẩ n cố' đ ịn h n itơ sống cộng sin h vói cây họ Đ ậu, cơ c h ế cố' đ ịn h nitơ có p h ầ n nào phứ c tạ p hơn vì nó có liên q u a n tới th ự c vật. V ai trò của th ự c v ậ t ở đây c h ín h là sự h ìn h th à n h leghem oglobin, c h ấ t này đóng vai trò tro n g chuỗi ch u y ển e lectro n từ q u á tr ìn h q u a n g hợp của cây vào n itro g e n a z a c ủ a vi k h u ẩ n . Enzym n itro g e n a z a củ a vi k h u â n n ô t s ầ n sông cộng sin h với cây họ Đ ậu cũ n g có câu trú c giống n h ư n itro g e n a z a của vi k h u ẩ n cộng sin h nitơ sông tự do tro n g đ ấ t.

Mổì q u an h ệ giữa thự c v ậ t và vi k h u ẩ n tro n g quá tr ìn h cô đ ịn h n itơ cộng sin h có th ể biếu diền bởi sơ đồ sau:

N2

I

Quá trin,h ____ ► Leahemoalobin ____ ► Nitrogenaza ____ Quá trình sinh năng quang hợp của cây 9 của vi khuẩn lượng của VI khuẩn

t

NH3

Tuy n h iên gần đây, có m ột sô" tác giả cho rằn g , q u á tr ìn h cô" đ ịn h nitơ p h â n tử xáv ra (1 tế bào th ự c v ậ t chứ không xảy ra ỏ tê bào vi k h u ẩ n . N h ữ n g tác giả n ày dựa vào kôt q u ả th í ng h iệm d ù n g ng u y ên tô" phóng xạ N15 th ấ y nó x u ấ t h iện ch ủ yếu ở m àng t ế bào th ự c v ậ t tro n g k h i x u ấ t h iện r ấ t ít ở tế bào vi k h u ẩ n .

1.1.3. Vi sinh vật cố định nitơ

N hiều loài vi sin h v ậ t có k h ả n ă n g cố đ ịn h nitơ p h â n tử . C h ú n g bao gồm 3 nhóm chính: nhóm vi k h u ẩ n cô" định ni tơ cộng sinh, nhóm vi k h u ẩ n cố định nitơ sống tự do và nhóm vi tảo cỏ" định nitơ. Ngày nay người ta đã biết tối 40 loài tảo lam (vi k h u ẩ n lam) có k h ả n á n g cô" đ ịn h nitơ, l h a lú a nước có tảo lam có th ể cô" đ ịn h được 30 - 3 5kg N2

tro n g m ột ĩiăm . Ở đây, ch ú n g ta chỉ n g h iê n cứu kỹ 2 nhóm đầu. a ) Vi k h u ẩ n c ố đ ị n h n i t ơ c ộ n g s i n h v ớ i c â y h ọ Đ ậ u

- Đặc điểm chung:

+ Vi k h u ẩ n cô" đ ịn h nitơ cộng sin h với cây họ Đ ậu còn gọi là vi k h u ẩ n n ố t sần. C h ú n g h ìn h th à n h n h ữ n g nốt sần ở rễ cây, đôi k h i ở cả th â n cây p h ầ n gần với đ ấ t và cư trú tro n g dó. T ại nốt sần , vi k h u ẩ n tiế n h à n h qu á tr ìn h cô" đ ịn h nitơ, sả n p h ẩ m cố đ ịn h được m ột p h ầ n sử dụ n g cho vi k h u ẩ n và m ột p h ầ n sử d ụ n g cho cây. N h ữ n g sản p h ẩm q u a n g hợp của cây cũ n g m ột p h ầ n được cu n g cấp cho vi k h u ẩ n . C h ín h vì th ế mà q u a n hệ giữa vi k h u ẩ n và cây là q u a n hệ cộng sin h h a i b ên cù n g có lợi.

N ăm 1888, B eijerinck đã p h â n lập được vi k h u ẩ n n ố t sần . N ăm 1889, vi k h u ẩ n nôt sần được đ ặ t tê n là R h izo b iu m . Lúc đầu, người ta d ự a vào cây đ ậ u và vi k h u ẩ n cộng sin h để đ ặ t tê n loài cho chúng. Ví dụ: loài R h izo b iu m ỉe g u m in o su ru m cộng sin h với cây đ ậu H à L an, loài R h izo b iu m trifo lli cộng sin h với cây cỏ b a lá. G ần đây người ta chia vi k h u ẩ n n ố t sần th à n h h ai nhóm , nhóm sin h trư ỏ n g n h a n h và nhóm sin h trư ơng ch ậm dựa vào thòi g ian x u ấ t h iệ n k h u ẩ n lạc trê n môi trư ờ n g nuôi cấy. N hóm sin h trư ở n g n h a n h th ì k h u ẩ n lạc x u ấ t h iện sa u 3 - 5 ngày, có đường k ín h 2 - 4m m thuộc chi R h izo b iu m . N hóm sin h trư ơ n g chậm , k h u ẩ n lạc x u ấ t h iệ n s a u 5 - 7 ngày nuôi cấy, có đường k ín h k h ô n g qu á lm m thuộc chi B r a n d ir h iz o b iu m .

.T rong quá tr ìn h nuôi cấy, vi k h u ẩ n n ố t sầ n th ư ờ n g có sự th a y đổi h ìn h th á i. Lúc còn non, đa sô" các loài có h ìn h que, có k h ả n ă n g di động b ằ n g đơn m ao, ch ù m m ao hoặc chu m ao tù y từ n g loài. S a u đó trơ th à n h d ạn g giả k h u ẩ n th ể (bacteroid) có h ìn h que p h â n n h á n h , m ấ t k h ả n ă n g di động. 0 d ạn g này, vi k h u ẩ n n ố t s ầ n p h ìn h to có h ìn h côn, h ìn h chùy, h ìn h chữ X, V,... và có k h ả n ă n g cố' đ ịn h ni tơ. K hi già, d ạn g h ìn h que p h â n n h á n h p h â n c ắt tạo th à n h d ạn g h ìn h eốu nhỏ.

Vi k h u ẩ n n ô t s ầ n th u ộ c loại h iếu khí, ư a pH tru n g tín h hoặc hơi kiềm , th íc h hợp với n h iệ t độ 28 - 30°c, độ ẩm 60 - 80%. C húng có k h ả n ă n g đồng hó a các nguồn cacbon k h á c n h a u n h ư các loại đường đơn, đường kép, a x it h ữ u cơ, glyxerin,... Đối với ngu ồ n nitơ, k h i cộng sin h với cây đậu, vi k h u ẩ n n ố t sầ n có k h ả n ă n g sử d ụ n g nitơ k h ô n g khí. K hi sông tiề m sin h tro n g đ ấ t hoặc được nuôi cấy tr ê n môi trư ờng, c h ú n g m ấ t k h ả n ă n g cô" đ ịn h nitơ . Lúc đó, ch ú n g đồng hóa các n g u ồ n nitơ s ẵ n có, n h ấ t là các nguồn am ô n và n itr a t. C h ú n g có th ể đồng hó a tố t các loại a x it am in , m ột sô" có th ê đồng h ó a p ep to n . N goài n g u ồ n d in h dưỡng cacbon và nitơ, vi k h u ẩ n n ố t s ầ n còn c ần các loại c h ấ t k h o á n g , tro n g đó q u a n trọ n g n h ấ t là phospho, K hi n u ô i vi k h u ẩ n n ố t s ầ n ỏ m ôi trư ờ n g có s ẵ n đ ạ m lâ u ngày, ch ú n g sẽ m ấ t k h ả n ă n g xâm n h iễm và h ìn h th à n h n ố t sần . Đó là điều cần chú ý tro n g việc giữ giống vi k h u ẩ n n ố t sần.

+ Sự h ìn h th à n h n ố t sầ n và q u an hệ cộng sinh của vi k h u ẩ n n ố t sần với cây bộ Đậu: Q u a n hệ cộng s in h giữa vi k h u ẩ n n ô t sầ n và cây bộ Đ ậu tạ o th à n h m ột th ể sin h lý h o à n ch ỉn h . Chỉ tro n g q u a n hệ cộng sin h này, ch ú n g mới có k h ả n ă n g sử d ụ n g nitơ củ a k h ô n g k h í. K hi tá c h ra , cả cây đ ậu và vi k h u ẩ n đều k h ô n g th ể sử d ụ n g n itơ tự do, k h ô n g p h ả i t ấ t cả các cây th u ộ c bộ Đ ậ u đều có k h ả n ă n g cộng s in h với vi k h u ẩ n n ố t sần m à chỉ k h o ả n g 9% tro n g chúng.

K hả n ă n g h ìn h th à n h n ô t s ầ n ở cây đ ậu khô n g n h ữ n g p h ụ th u ộ c vào vi k h u ẩ n có tro n g đ ấ t m à còn p h ụ th u ộ c vào các điều k iện ngoại c ản h k h á c n h a u . Ví d ụ về độ ẩm , c h ú n g th íc h ứ n g với độ ẩm từ 40 - 80%, tro n g đó độ ẩm tối th íc h là 60 - 70%. Tuy n h iê n , cũ n g có n h ữ n g trư ờ n g hợp ngoại lệ, ví d ụ n h ư cây đ iề n th a n h có th ể h ìn h th à n h n o t s ầ n tro n g điều k iện n g ập nưốc.

Độ th o á n g k h í củ a đ ấ t cũng ả n h hư ỏng đến sự h ìn h th à n h và c h ấ t lượng not sần . T hông thư ờ ng, n ố t s ầ n chỉ h ìn h th à n h ở p h ầ n rễ nông, p h ầ n rễ sâ u r ấ t ít nốt sần. N gu y ên n h â n là do tín h h iếu k h í của vi k h u ẩ n n ố t sần , th iế u oxy sẽ làm giảm cường độ tra o đổi n ă n g lượng v à k h ả n ă n g xâm n h ậ p vào rễ cây. Đổi với cây, th iế u oxy cũng làm giảm sự h ìn h th à n h sắc tô" leghem oglobin. N h ữ n g not sầ n h ữ u h iệ u có m àu hồng c h ín h là m à u của sắc tô" này.

N h iệ t độ th íc h hợp n h ấ t vói h o ạ t động của vi k h u ẩ n n ố t s ầ n là 24°c, dưới 10°c n ố t s ầ n v ẫn có th ể h ìn h th à n h n h ư n g h iệ u qu ả cô" đ ịn h n itơ giảm , ở n h iệ t độ 36°c, cây đ ậu p h á t triể n tố t n h ư n g cường độ cô" đ ịn h nitơ lại kém .

pH môi trư ờ n g cũ n g ả n h hưở ng đến sự h ìn h th à n h và c h ấ t lượng n ố t sần . Có loại chỉ h ìn h th à n h n ô t s ầ n ở pH = 6 ,8 - 7,4 có loại có k h ả n ă n g h ìn h th à n h n ố t sần ở pH rộ n g hơn, từ 4,6 - 7,5.

Tính đặc h iệu là m ộ t đặc điểm q u an trọ n g tro n g q u an hệ cộng sin h với m ột hoặc vài loài vi k h u ẩ n n ố t s ầ n chỉ có k h ả n ă n g cộng sin h với m ột hoặc vài loài đậu. C ũng có m ột số' loại vi k h u ẩ n có k h ả n ă n g h ìn h th à n h nốt s ầ n ở cây đ ậ u không đặc h iệ u với nó n h ư n g số' lượng n ố t s ầ n ít và có k h ả n ăn g cô' đ ịnh n itơ kém . T uy nhiên, đặc tín h n ày giúp cho vi k h u ẩ n n ô t s ầ n có th ể tồ n tạ i ỏ n hữ ng nơi không có cây đ ậu đặc h iệu đối với nó. T ín h đặc h iệ u giữa vi k h u ẩ n và cây đậu được q u y ết đ ịn h bởi hệ gen củ a chúng. Bởi vậy, người ta có th ể cải biến tín h đặc hiệu b ằn g các tác n h â n đột biến, hoặc có th ể d ù n g kỹ th u ậ t di tru y ề n để cải b iến hệ gen quy đ ịn h tín h đặc h iệ u cộng sin h .

Q uá trìn h h ìn h th à n h n ố t sần được b ắ t đ ầu từ sự xâm n h ậ p củ a vi k h u ẩ n vào rễ cây. Vi k h u ẩ n th ư ờ n g xâm n h ậ p vào rễ cây qu a các lông h ú t hoặc v ế t th ư ơ n g ở vỏ rễ cốy. Cây đ ậu th ư ờ n g tiế t ra n h ữ n g c h ấ t kích th íc h sin h trư ỏ n g củ a vi k h u ẩ n n ố t s ầ n tương ứng, đó là các hợp c h ấ t cacbonhydrat, các a x it am in ,... M uốn xâm n h iễ m tốt, m ậ t dộ của vi k h u ẩ n tro n g v ù n g rễ p h ải đ ạ t tới 1 01 tế bào tro n g 1 gam đ ất. N ếu xử lý với h ạ t đ ậu th ì mỗi h ạ t đ ậ u loại nhỏ cần 500 — 1 .0 0 0 tế bào vi k h u ẩ n , h ạ t đ ậ u loại to cần k h o ả n g 70.000 t ế bào.

Khi m ậ t độ vi k h u ẩ n p h á t triể n tới m ột mức độ n h ấ t đ ịn h , nó sẽ kích th íc h cây đ ậu tiê t ra enzym p o ly g a la cto ru n az a có tác d ụ n g p h â n giải th à n h lông h ú t để vi k h u ẩ n qu a đó xâm n h ậ p vào. Đ ưòng vi k h u ẩ n xâm n h ậ p được tạ o th à n h do tốc độ p h á t triể n của vi k h u ẩ n (sin h trư ở n g đến đâu, xâm n h ậ p đ ến đấy) h ìn h th à n h m ột "dãy xâm n hập" được bao q u a n h bởi m ột lớp n h ầ y do các c h ấ t của vi k h u ẩ n tiế t ra tro n g q u á trìn h p h á t triể n . Ớ giai đoạn này, p h ả n ứ ng c ủ a cây đốĩ với vi k h u ẩ n tương tự n h ư đối với v ậ t ký sin h . Bối vậy, tốc độ tiế n s â u vào n h u mô củ a dãy xâm n h ậ p r ấ t chậm do p h á t triể n của cây (chỉ k h o ản g 5 - 8|am/giờ). K hông p h ả i t ấ t cả các dãy xâm n h ập đểu tiế n tới n h u mô rễ m à chỉ m ột sô" tro n g chúng. C h ín h vì th ế , để h ìn h th à n h n ô t sần cần m ậ t độ vi k h u ẩ n lớn.

Khi tới lớp n h u mô, vi k h u ẩ n kích th ích t ế bào n h u mô p h á t tr iể n th à n h v ù n g mô p h ân sin h . Từ v ù n g mô p h â n sinh, tế bào p h â n chia r ấ t m ạ n h và h ìn h th à n h 3 loại tô bào ch u y ên hóa: v ỏ n ố t sầ n là lớp t ế bào n ằm dưới lốp vỏ rễ bao bọc q u a n h nốt sần. Mô gồm n h ữ n g t ế bào k h ô n g chứ a vi k h u ẩ n xen kẽ với các t ế bào k h ô n g n h iễm vi k h u ẩ n và n h ữ n g t ế bào n h iễm vi k h u ẩ n . N h ữ n g t ế bào ch ứ a vi k h u ẩ n có kích thước ìớn hơn t ế bào k h ô n g chứ a vi k h u ẩ n tối 8 lần; có n h ữ n g mô ch ứ a vi k h u ẩ n , toàn bộ các tế bào đều bị n h iễm vi k h u ẩ n . Loại t ế bào ch u y ên hóa th ứ b a là các m ạch

d ẫ n từ hệ rễ vào n ố t sần . Đ ây ch ín h là con đường d ẫ n tru y ề n các s ả n p h ẩ m của q u á

trìn h cô' đ ịn h n itơ cho cây và các sả n p h ẩm q u an g hợp của cây cho n ố t s ầ n (h ìn h 1.6). Tại các t ế bào chứa vi k h u ẩ n , vi k h u ẩ n n ố t sầ n xâm n h ậ p vào t ế bào c h ấ t và tạ i đây ch ú n g p h â n c ắ t r ấ t n h a n h . Từ d ạn g h ìn h que sẽ c h u y ển s a n g d ạ n g h ìn h que p h ân n h á n h gọi là d ạ n g giả k h u ẩ n th ể (bacterioide). C h ín h ở d ạ n g giả k h u ẩ n th ể này, vi k h u ẩ n b ắ t đ ầ u tiế n h à n h q u á tr ìn h cô' đ ịn h nitơ. Thời k ỳ cây r a hoa là thời kỳ n o t sần h ìn h th à n h n h iề u n h ấ t và có h iệ u qu ả cô" đ ịn h n itơ m ạ n h n h ấ t. H iệu qu ả cố định nitơ th ư ờ n g th ể h iệ n ở n h ữ n g n ố t sầ n có kích thước lốn và có m à u hồ n g của

leghem ogỉobin. ở n h ữ n g cây đ ậu có đời sông n g ắn từ 1 n ă m trở xuống, đến giai đoạn cuối cù n g của th ò i kỳ p h á t triể n , m àu hồng của sắc tô' ỉeghem oglobin c h u y ển th à n h m àu lục. Lúc đó k ế t th ú c q u á trìn h cố đ ịn h nitơ, d ạn g giả k h u ẩ n th ể p h â n c ắ t th à n h n h ử n g t ế bào h ìn h cầu, K hi cây đ ậu chết, vi k h u ẩ n n ô t s ầ n sống tiề m sin h tro n g đ ấ t chờ đến vụ đ ậu n ă m sau . T u y n h iên , có m ột vài cây họ Đ ậ u n h ư cây đ iền th à n h h ạ t trò n k h ô n g th ấ y x u ấ t h iện d ạ n g giả k h u ẩ n (h ìn h 1.6).

ở n h ữ n g cây đ ậ u 1 n ă m và n h ữ n g cây đ ậ u lâ u n ă m (th â n gỗ) cũ n g có sự k h ác n h a u về tín h c h ấ t nô't sần . Ở cây lạc, cây đ ậu tương, n ố t s ầ n h ữ u h iệ u (có k h ả n ăn g cố' đ ịn h nitơ) th ư ò n g có m à u hồng, kích thước lớn, th ư ờ n g n ằ m tr ê n rễ c h ín h tro n g khi nôt s ầ n vô h iệ u có m àu lục, kích thước nhỏ, thư òng n ằ m tr ê n rễ p h ụ . T uy n h iê n ở

m ột sô' cây đ ậ u lâ u n ă m lại k h ô n g th eo quy lu ậ t đó. Ví d ụ n h ư cây keo ta i tượng d ù n g đê trồ n g rừ n g , n ố t s ầ n h ữ u h iệ u có cả ỏ rễ p h ụ và không có m à u hồng.

Hình 1.6. Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh ở rễ cây họ Đậu

A) Rễ cây họ Đậu với nốt sần; B) Lát cắt của nốt sần; C) Tế bào thực vật chứa đầy Rhizobium ; D) Vỉ khuẩn có thể giả khuẩn (Bacterioides); E ) Vi khuẩn xâm nhập qua đầu lông hút và phát triển thành đường xâm nhập vào rễ.

M ột số loài xạ k h u ẩ n , địa y, tổ hợp vi k h u ẩ n lam với q u y ế t th ự c v ậ t cũ n g có k h ả n ă n g cô" đ ịn h nitơ.

N gày nay, ngưòi t a tìm th ấ y 40 loài vi k h u ẩ n lam có k h ả n ă n g cô' đ ịn h đạm (íS ch leg eỉ, 1993), h ằ n g n ă m tro n g các ru ộ n g lú a nưóc, vi k h u ẩ n la m có k h ả n ă n g cô"

địn h 30 - 50kg n itơ trê n I h a . Vi k h u ẩ n lam cô" đ ịn h đ ạ m gồm n h ữ n g cơ th ể đơn bào n h ư Gỉoeocapsa, tạ o sợi k h ô n g có tế bào lạ n h ư O sciỉỉatoria, tạo sợi có t ế bào lạ (dị bào n a n g — h etero cy st) n h ư A n a b a en a , C alothix, N ostoc,...

Vi k h u ẩ n sông tự do cô" đ ịn h đạm gồm n h iề u nhóm (b ản g 1.1):

Bảng 1.1. Các vỉ khuẩn cố định đạm sống tự do xếp theo nhóm sinh lý

Hô hấp hiếu khí bắt buộc Hô hấp kỵ khí bắt buộc Có th ể quang hợp

Azotobacter chroococum - Các vi khuẩn khử lưu huỳnh: - Không thải oxy:

A. vinelandi _{Desufovibrio Chromatium} Azom onas agilis Desulfotomaculum Rhodospirillum Alcaligenes latus _{“ Các cơ thể sinh metan: Rhodopseudomonas} Xanthobacter autotrophicus _{Metanobacterium} R hodobacter Beijenrinckia indica _{Metanosarcine Heliobacter} Derxia gummona _{-C á c vi khuẩn lên men kỵ khí} Chlorobium Azospirillum lipoferum _{Clostridium - Thải oxy:}

Vài loài Methylotrophs _{Hầu hết các vi khuẩn lam.} Kỵ khí không bắt buộc:

Klebsiella pneumoneae Bacillus polimyxa

Nhờ phươ ng p h á p nuôi in vitro , sử dụng ng u y ên tủ đ á n h d ấ u N15 người ta p h á t h iệ n k h ả n ă n g cô" đ ịn h đạm ỏ n h iều loại vi k h u ẩ n : A zo to b a cter, C lo strid iu m , các vi k h u ẩ n q u a n g hợp, vi k h u ẩ n k h ử su n fat,...

Đốĩ với các v ù n g đ ấ t chư a ở V iệt N am n h â n d â n ta th ư ờ n g bón vôi, b iệ n p h áp này làm pH trơ về tru n g tín h , n ân g cao k h ả n à n g tạ o th à n h n ố t sần , cũ n g n h ư sự p h á t triể n n h a n h chóng của các vi k h u ẩ n sống tự do cố đ ịn h đạm .

- Azotobacter:

A zotobacter (được p h á t h iện từ n ăm 1901 do B eijerinck) là m ột loại vi k h u ẩ n

h iếu khí, không sin h bào tử, có k h ả n ă n g cô' đ ịn h nitơ p h â n tử, sông tự do tro n g đ ất. K hi nuôi cây A zotobacter tro n g môi trư ờng n h â n tạo, ch ú n g b iể u h iệ n đặc tín h đa hình: k h i còn non ch ú n g có d ạn g trự c k h u ẩ n h ìn h que, có tiê n m ao, có k h ả n ă n g di động. K hi già, A zo to b a cter có k h ả n ă n g di động, t ế bào ch u y ển th à n h d ạ n g h ìn h cầu, xung q u a n h được bao bọc bởi m ột lớp nhầy. M ột sô" loại A zo to b a cter có k h ả n ă n g h ĩn h th à n h n a n g xác vỡ, t ế bào lại sin h trưởng, p h á t tr iể n .,N a n g xác là m ột h ìn h thứ c tồn tạ i của A zo to b a cter, nó khô n g p h ải là bào tử. M ột n a n g xác có th ể bao bọc m ột số t ế bào bên tro n g . K h u ẩ n lạc của A zotobacter lúc non còn có m à u tr ắ n g đục. K hi già ch u y ển th à n h m àu lục hoặc m àu nâu.

T rong đ ất, n h ấ t là đ ấ t lú a, thư ờ ng có phổ b iến n h ữ n g lo ài A zo to b a cter sau:

* A zotobacter chroococcum: có k h ả n ă n g di động lức còn non, k h i già có k h ả n ă n g h ìn h th à n h n a n g xác. K h u ẩ n lạc lúc già có sắc tô" m àu nau> hoặc m à u đen, không k h u ếch tá n vào môi trư ờng.

* A zotobacter beijerinckii: khô n g có k h ả n ă n g di động, có k h ả n ă n g h ìn h th à n h n a n g xác. K h u ẩ n lạc lúc già có m àu v àn g hoặc m à u n â u sán g , sác tô" k h ô n g k h u ếch tá n vào môi trư ờng.

• A zo to b a cter v in e la n d ii: có k h ả n à n g di động và h ìn h th à n h n a n g xác. K h u ẩ n lạc m à u h u ỳ n h q u a n g , sắc tô" k h u ế ch tá n vào môi trường.

• A zo to b a cter a g illis: có k h ả n ă n g di động, k h ô n g tạo th à n h n a n g xác, k h u ẩ n lạc m à u v àn g lục h u ỳ n h q u a n g , sắc tó k h u ếch tá n vào môi trư ờng.

A zo to b a cter có k h ả n ă n g đồng hóa n h iề u loại đường k h á c n h a u , n h ấ t là các sản

p h ẩ m p h â n giải củ a xenlulozơ. Bỏi vậy, đ ấ t có bón p h â n x an h , rơm rạ , rác rưởi râ't

tố t cho sự p h á t tr iể n c ủ a A zo to b a cter. Sự p h á t triể n và k h ả n ă n g cô" đ ịn h n itơ của A zo to b a cter p h ụ th u ộ c r ấ t n h iề u vào h àm lượng phospho dễ tiê u tro n g môi trư ờng.

N goài ra , c an x i và các n g u y ê n tô" vi lượng n h ư B, Mo, Fe, M n cũ n g r ấ t c ần th iế t đối với A zo to b a cter. M ột v ài n g u y ên tô" phóng xạ có tá c d ụ n g k ích th íc h s in h trư ở n g đối với A zotobacter.

A zo to b a cter th íc h hợp n h ấ t vói pH = 7,2 - 8,2, song c h ú n g có 'thể p h á t triể n được pH - 4,5 - 9,0. C h ú n g th íc h hợp với n h iệ t độ 25 - 30°c.

A zo to b a cter đã được n g h iên cứu để c h ế tạo p h â n vi sin h v ậ t bón cho lúa, ở m ột sổ"

nơi ch ú n g th ể h iệ n h iệ u q u ả tố t n h ư n g k h ô n g phổ b iến b ằ n g p h â n vi k h u ẩ n n ô t sầ n n itra g in . C h ế p h ẩ m c h ế tạ o từ A zotobacter được gọi là a zo to b a c terin .

- C lo strid iu m :

C lo strid iu m được p h á t h iệ n từ n ăm 1893, là m ột loài vi k h u ẩ n kỵ k h í sông tự do

tro n g đ ấ t. K hác với Azotobacter, nó có k h ả n ă n g h ìn h th à n h bào tử. L oài phổ biến n h ấ t tro n g đ ấ t là C lo strid iu m p a s te u r ia n u m có h ìn h con thoi do bào tử h ìn h th à n h lớn hơn kích th ư ớ c-tế bào.

C lo strid iu m có k h ả n ă n g đồng hó a n h iề u nguồn cacbon k h á c n h a u n h ư các loại

đưòng, rượu, tin h bột,... Nó th u ộ c loại k ỵ k h í n ê n các s ả n p h ẩ m tra o đổi c h ấ t của nó th ư ờ n g là các loại a x it h ữ u cơ, b u ta n o l, etan o l, axeton,... Đó là các s ả n p h ẩ m chưa được oxy hóa h o à n to àn .

p, K là 2 nguyên tô" r ấ t cần th iế t cho sự p h á t triể n và cố đ ịn h nitơ của C lostridium . N goài ra , các n g u y ê n tô' vi lượng n h ư Mo, Co, Cu, M n cũ n g r ấ t cần th iế t đốì với

C lo strid iu m .

C lo strid iu m có k h ả n ă n g p h á t triể n ỏ pH - 4,7 - 8,5. B ào tử củ a ch ú n g có th ể

chịu đựng được n h iệ t độ cao, có th ể sông được 1 giồ ở n h iệ t độ 80°c. M ột sô" loài còn có th ể chịu được n h iệ t độ 1Ọ0°C tro n g 30 p h ú t.

Ngoài n h ữ n g giông vi s in h v ậ t cố' đ ịn h nitơ p h â n tử nói trê n , còn vô số' n h ữ n g giông k h ác đ ều có k h ả n ă n g cố' đ ịn h nitơ p h â n tử, ch ú n g có n h iề u ý n g h ĩa tro n g sản x u ấ t nông, lâm , n gư n g h iệp .

- Vi k h u ẩ n :

• Nhóm vi k h u ẩ n cố' định nitơ p h ân tử hiếu khí: A zotom onas insolita; Azotom onas

fLuorescens; Pseudom onas azotogenis; A zospirillum ,...

• Nhóm vi k h u ẩ n cô' định nitơ p h ân tử kỵ k h í q u ang hợp: R h o d o sp ỉriỉỉu m ru b ru m ;

C h ro m a tỉu m sp; R h o d o m ic rib iu m sp,...

• N hóm vi k h u ẩ n cô' đ ịn h n itơ p h â n tử kỵ k h í k h ô n g q u a n g hợp: D esulfovibrio

• Xạ khuấn: Một sô loài thuộc giống: Streptomyces, Actinom yces; F rankia; Nocardia;

A ctinopolyspora; A ctin o syn o em a

• N ấm : R hod o to ru ỉa ,'.,

• Vi k h u ẩ n lam : Glococapsa sp; L yngbyaps; P lectonem a; B o y rya n u m ; A nabaerta

azollae; A n a b a e n a a m b ỉg u a ; A n a b a e n a cycadae; A n a b a e n a cylin d rica l A n a b a e n a fa r tilis im a

Vi k h u ẩ n có k h ả n ăn g cô" định nitơ sông trâ n bề m ặ t rễ và ãn s â u vào lớp tổ chức bề m ặt rễ của m ột sô" cây hòa th ảo n h ư lúa, ngô,... Đó là m ột loại vi k h u ẩ n có dạng xoắn được p h á t h iện từ n ăm 1974 thuộc chi A zo sp irillu m đ ã được n g h iên cứu nhiều trê n th ế giới, ở V iệt N am cũng ó r n h ữ n g nghiên cứu bước đ ầ u và ứ ng d ụ n g c h ế phẩm

A zospiriU um n h ằm m ục đích n ân g cao sản lượng của các cây hòa th ả o nói trên .

- Tảo đơn bào cũ n g có k h ả n ă n g cố’ đ ịn h nitơ. Ví d ụ n h ư tảo lam sống tự do và tảo lam sông cộng sin h tro n g bèo hoa dâu. Các loài n ày cũ n g đóng góp k h ô n g nhỏ vào quá trìn h cô" đ ịn h n itơ k h ô n g kh í.

b) N g u y ê n l iệ u s ả n s u ấ t

Để sản x u ấ t các c h ế p h ẩ m vi k h u ẩ n làm p h â n vi sin h cô" đ ịn h n itơ th ư ờ n g d ù n g các d ạn g đường đơn, đường đôi, tin h bột, cám mì, cám gạo,... có k h i d ù n g m a n n it (m anitol, m a n a n su g ar), glyxerol,... cùng n h ữ n g loại m uối k h o á n g th íc h hợp với từ n g ch ủ n g giống.

- M ột sô" tác giả đã sử d ụ n g nguồn cơ c h ấ t cacbon và N h ữ u cơ tro n g các môi trư ờ n g tổng hợp nuôi các vi k h u ẩ n cố đ ịn h nitơ n h ư sa u (b ản g 1.2).

Bảng 1.2. Môi trường tổng hợp với nguồn c và N dùng nuôi vi khuẩn cố định nỉtơ

Tên vỉ khuẩn Thành phẩn cơ bản của môi trưởng Tác giả

Pseudomonas Nước thủy phân đậu, thịt Bashan (1986)

Azospirillum 10g/I glyxerol

Bacillus 50g/l nước thủy phân tinh bột 20g/l casein

3,3g/l N aH P 0 4

Atkison & Mavitune (1993)

ị Rhizobium 20g/l nước chiết nấm men 10g/I manitol

Somasegara (1985)

- Sử d ụ n g các nguồn đường làm cơ c h ấ t th ư ờ n g d ù n g các môi trư ờ n g p hổ biến n h ư s a u (g/1):

1) Glưcozơ - lOg; K2H P 04 - 0,5g; M g S 0 4. 7H20 - 0,2g; N aC l - 0,lg ; cao n ấm m en hoặc nước ch iết cây đ ậ u tương ứng với vi k h u ẩ n - 0,4g; nước - 1 lít; pH = 6,5 - 7.

Môi trường này dùng nuôi cấy vi k h u ẩ n nốt sần, nếu d ù n g giữ giông th êm 15 - 20g/l th ạch .

2) Nước luộc đ ậu được bổ sung 1% saccarozd, thêm 1,5% th ạ ch dù n g để cấy chuyền hoặc h o ạ t hóa vi k h u ẩ n n ố t s ầ n trước k h i n h â n giông.

3) Môi trường nuôi cấy chung cho các chủng vi k h u ẩ n cô định nitơ (g/1):

Saccarozơ (có th ổ th a y b ằ n g m a n n it) 15 15 (m anitol) 2 0 (m anitol)

K,HP(X, 0 ,2 0,5 0 ,2 M g S O ,.711*0 0 ,2 0 ,2 0 ,2 C aC l, 0 ,0 2 C a S 04 - 0 ,1 k 2s o4- o , i F e d * (p h a t h à n h d ư n g dịch 1 0%) 0,05 N aC l — 0 ,2 N aC l - 0 ,2 M uôi m o lip d en V ết C a C 03 - 5,0 C a C 0 3 - 5 Nước cho đủ 1 lít Nước đ ủ 1 lít Nước đủ 1 lít pH 7,2 pH 8,3 pH 8,3

Ba môi trư ờ n g n à y d ù n g cho vi k h u ẩ n cô đ ịn h N2 sông tự do. 1.1.4. Sản xuất phân vỉ sinh vật cố định nitơ

a ) S ơ đ ồ c ô n g n g h ệ ( n g u y ê n lý ) s ả n x u ấ t p h â n v i s i n h v ậ t c ố đ ị n h n i t ơ

S ản p h ẩ m của công n g h ệ s ả n x u ấ t p h â n bón vi sin h v ậ t cố’ đ ịn h n itơ là sin h khối các giông vi k h u ẩ n th u ầ n c h ủ n g có k h ả n ă n g cô' đ ịn h n itơ p h â n tử N2 từ k h ô n g k h í h ay là ctó k h ả n ă n g ch u y ển hóa n itơ p h â n tử th à n h N H :ì.

Công ng h ộ sả n x u ấ t sin h khôi vi k h u ẩ n về n g u y ên lý cũ n g tương tự n h ư các qu á trìn h len m en th u sin h khôi tro n g công nghiệp vi sin h vật. Q uy tr ìn h công n g h ệ được

thổ hiộn ơ sơ dồ n h ư sau :

b) G iố n g s ả n x u ấ t

Là giông th u ầ n c h ủ n g được p h â n lập và tu y ể n chọn từ n g u ồ n tự n h iê n , giữ giông tro n g th ạ c h n g h iê n g ỏ lạ n h tro n g phòng th í nghiệm . Trước k h i sử d ụ n g được cấy ch u y ền q u a ống có môi trư ờ n g th ạ c h để "đánh thức", sa u đó n h â n giông trước k h i đư a vào lên m en. Có th ể n h â n giống cấp I, cấp II,... để đảm bảo tiế p c h u y ền giống có th ể gấp 5 - 10 lầ n q u a mỗi lần.

Yêu cầu n h â n giông: dịch giông k h ô n g tạ p nhiễm , m ậ t độ từ vài tr ă m triệ u đến h à n g tỷ tô bào/m l, th ư ờ n g k ê t th ú c n h â n giống ở mỗi cấp tạ i thời điểm sin h khôi p h á t triể n ch ậm d ầ n khi sắp sử a vào p h a cân bằng.

Tùy thuộc vào giống th u ầ n ch ủng h iế u k h í hoặc kỵ k h í ta sẽ q u y ết đ ịn h nuôi cây ch ú ng theo phương p h áp lên m en bề m ặ t hoặc lên m en chìm . N uôi cấy bề m ặ t đốỉ với ví k h u ẩ n trê n môi trư ờ n g rắ n (hay b á n rá n , xốp) đòi hỏi độ ẩm 70 - 80% là khó th ô n g k h í (hiêu k h í kém ) và vi k h u ẩ n không có hệ sợi cơ c h ấ t n h ư vi n ấ m n ê n r ấ t khó p h á t

triôn. Nuôi cấy chìm cần nuôi ỏ th ù n g lên m en sục k h í tro n g điều k iện vô trù n g , n h â n giông cap I có th ể thực hiộn tro n g bình tam giác và được đ ặ t trô n m áv lắc.

c) L ê n m e n

Lên m en tro n g trư ờ n g hợp này là nuôi cây mở rộng vi k h u ẩ n để th u sin h khôi để

che tạo chê p h ẩm vi sin h cô" đ ịn h nitơ. Môi trư ờ n g lên m en th ư ờ n g ch ú trọ n g nguồn cacbon và nitơ. N guồn c là các loại đường hoặc m an ito l h a y glyxerol. N guồn N là nước c h iêt đậu, n ấ m m en h ay dịch th ủ y p h ân từ cây hoặc h ạ t đ ậu , th e m các nguồn muôi k h o á n g cần th iế t.

Nuôi cấy các giông th u ầ n ch ủng cô đ ịn h nitơ th ư ờ n g d ù n g p hư ơ ng p h áp len men chìm . Q uá tr ìn h lôn m en cần kiểm so át n h iộ t độ, pH, 02 hò a ta n . Đ ây là q u á trìn h len men m ột pha: p h a sin h trư ỏng. K ết th ú c lôn m en k h i sin h trư ố n g đ ạ t ỏ đ ầu pha cân bằng, s a u đó ly tâ m để n h ậ n sin h khối. Lên m en công n g h iệp ỏ các fe rn e n te r tới h à n g chục m ét khôi hoặc lớn hơn.

S inh khôi th u được đem trộ n với c h ấ t m an g (th ạ c h cao, đâ't s é t khô n g n g h iền nhỏ, đ ấ t p h ù sa khô, nhỏ, hoặc d iato m it, th a n b ù n khô,...) và rá c c h ấ t p h ụ gia, dem sấy khô với n h iệ t độ khô n g k h í nóng không qu á 45°c đế đảm bảo các t ế bào vi k h u ẩ n sông (qua sấy có th ể bị ch ết m ột tỷ ỉệ tế bào nào đó. M ục đích c àn g giảm tý lộ này càng tốt).

C hế p h ẩ m có th ể sử d ụ n g ỏ d ạn g lỏng, n h ư n g p h ải đóng gói kỹ và giữ vệ sinh, hoặc có thom c h ấ t bảo quản. Chô' p h ẩm d ạ n g lỏng th ư ờ n g k h ô n g giữ được lâu và cần được giữ ỏ điều k iện lạn h .

Các c h ế p h ẩm vi k h u ẩ n cố' đ ịn h nitơ có n h iề u tên gọi k h á c n h a u : A zotobacterin, R hizobin, Rizogin, F lav o b acterin , N itra g in , E n te ro b a c te rin . Phổ bicn hơn cả là A zotobacterin, N itra g in .

d ) A z o t o b a c t e r i n

A zo to b acterin là c h ế p h ẩ m p h â n bón ỉàm từ vi k h u ẩ n A zo to b a c te r sô n g tự do tro n g đ ấ t và tro n g v ù n g rễ củ a các cây cốc (lúa, ngô, m ạch , cao lương, kê,...), cây m ía hướng dương, ở v ù n g rễ củ a các cây n ày có r ấ t n h iề u vi s in h v ật. C h ú n g ta th ấ y có các loài th u ọ c gốc A zo to b a cter và A zo sp iro lliu m . C h ú n g có k h ả n ă n g cô" đ ịn h đ ạm (N J của k h ô n g k h í nhờ hệ enzym của b ả n th â n xúc tá c q u á tr ìn h c h u y ển nitơ từ k h í q u y ển th à n h n h ữ n g hợp c h ấ t cho cây có th ể tiê u hó a được, củ n g n h ư tạo ra các c h ấ t kích th íc h s in h trư ở n g th ự c v ậ t và tă n g cường cho cây h ấ p th u các c h ấ t d in h dưỡng khác,

M ột số’ c h ủ n g thuộc loài A zo to b a cter chrooccum có h o ạ t tín h cô' đ ịn h n itơ cao và được d ù n g sả n x u ấ t A zotobacterin. Đ ây là n h ữ n g ch ủ n g vi k h u ẩ n k h ô n g s in h bào tử hiếu khí. Tố bào tro n g thời kỳ p h â n chia thư òng kéo dài r a hoặc có h ìn h ovan. Kích thước tế bào là 2 - 5jiim. K hi già, xu n g q u a n h tế bào tạo th à n h m à n g n h ầy . H o ạt lực cô' đ ịn h nitơ của c h ú n g được tă n g lên k h i môi trư ờ n g có m ặ t m o lip d en (Mo). Do vậy, môi trư ờ n g nuôi cấy vi k h u ẩ n cần p h ả i bổ su n g k im loại n à y với tư cách là n g u y ên tô" vi lượng cần th iê t.

Nuôi ở n h iệ t độ th íc h hợp là 25 — 27°c trê n m áy lắc và k ê t th ú c k h i sin h k h ổ i đ ạ t được ỏ mức p h á t tr iể n ổn đ ịnh. T ách bỏ dịch nuôi cấy b ằ n g ly tâ m để th u sin h khôi.

Sinh khôi th ư được đem trộ n với đ ấ t hoặc th a n b ù n đã xử lý, th a n h trù n g . Cách xử lý đ ấ t và th a n b ù n n h ư sau: chọn đ ấ t n h iều m ùn, có th ể là đ ấ t p h ù sa. T h a n b ù n cần p h ải q u a p h â n h ủ y sơ bộ b ằ n g ax it clohydric rồi tru n g hòa đ ư a về tru n g tín h . N ghiền nhỏ n h ữ n g p h ầ n thô hoặc tạp c h ấ t lớn cần p h ải loại bỏ qua sàng. S au đó đ ấ t hoặc th a n b ù n được bổ su n g 1 - 2% vôi bột hoặc C a C 03 và 0,1% su p ep h o sp h a t, trộn đều, chia vào các ch ai hoặc b ìn h n ử a lít n ú t bằng n ú t bông. Đ ấ t hoặc th a n b ù n ỏ tro n g b ình cần được làm ẩm tới 40 — 60%. Đem h ấ p th a n h trù n g .

S inh kh ố i được c h ế th à n h dịch h u y ề n p h ù rồi lấy p ip e t vô tr ù n g h ú t c h u y ển vào đ ấ t hoặc th a n b ù n đ ã vô tr ù n g ở tro n g b ìn h . Mỗi b ìn h tà m giác 500m l chỉ cần cho vài giọt giông. L ắc đ ều v à n u ô i tiếp ở tủ ấm .

G iông vi k h u ẩ n có th ể nuôi trê n môi trư ò n g th ạ c h với th à n h p h ầ n d in h dưỡng n h ư đã giới th iộ u ỏ trê n . N h iệ t độ nuôi là 25 ~ 27°c vói thời g ian là 3 - 5 n g ày đến khi trê n m ặ t th ạ c h p h ủ đều m ột lớp khối nhầy.

D ùng nước vô tr ù n g để rử a cạo th u sin h khôi th à n h dịch h u y ề n p h ù giống. Lấy h u y ề n p h ù giông b ằ n g p ip e t vô trù n g nhỏ vào đ ấ t hoặc th a n b ù n vồ tr ù n g tro n g các b ìn h ta m giác, Lắc đ ều và để ở tủ ấm với n h iộ t độ th íc h hợp cho vi k h u ẩ n tiếp tục p h á t triể n .

S au k h i nuôi câ'y, mỗi gam c h ế p h ẩm khô n g ít hơn 50 triệ u t ế bào. Thời g ian bảo q u ả n đế sử d ụ n g vào k h o ả n g 2 - 3 th á n g .

Sử d ụ n g c h ế p h â m cho vào đ ấ t can h tác hoặc xử lý h ạ t giông b ằ n g cách n g âm h ạ t với dịch nước hòa với ch ế p h ẩm . Bón cho cây th eo liều sử d ụ n g là 3 — 6kg cho lh a gieo trồng.

A zo to b acterin th íc h hợp cho các loại cây cốc cho h ạ t, có th ể tă n g s ả n lượng được 9 - 18%. N goải ra , còn th ấ y h iệ u quả cho cây cà ch u a, củ cải đường, hoặc củ cải làm th ứ c ă n c h ă n nuôi, k h o a i tây .

e) N i t r a g i n

C h ế p h ẩ m n ày được c h ế từ vi k h u ẩ n nốt rễ của cây họ Đ ậu (đậu, lạc, điền th a n h ,...) và được d ù n g rộ n g rã i n h ấ t tro n g trồ n g trọ t. Vi k h u ẩ n n ố t rễ sống cộng sin h với cây ch ủ ỏ bộ rễ làm cho rễ có n h ữ n g nốt s ầ n và vi k h u ẩ n có h o ạ t tín h cố đ ịn h n itơ từ k h ồ n g kh í. T rong tự n h iê n ta th ấy , cây chủ nào, vi k h u ẩ n ấy. Đó là q u a n hệ đã được chọn lọc và tiế n hóa.

Vi k h u ẩ n n ô t rễ th u ộ c giông R h izo b iu m . Đ ây là loại trự c k h u ẩ n k h ô n g lớn, h iế u k h í, đôi k h i ch u y ển động, G ram âm (-), k h ô n g sin h bào tủ . C h ú n g có th ể mọc tố t ỏ môi trư ờ n g có nước c h iê t đ ậ u (nước luộc đậu) hoặc nước c h iế t các cây k h ác. N h iệ t độ th íc h hợp cho p h á t triể n của vi k h u ẩ n là 2 0 - 26°c, pH th íc h hợp là 7.

Đôi với từ n g loại cây họ Đ ậ u cần p h ả i có ch ế p h ẩ m N itra g in th íc h hợp để làm p h a n bón cho cây ây, được chê từ n h ữ n g c h ủ n g vi k h u ẩ n tư ơ n g ứng. N h ữ n g c h ủ n g n ay được tu y ê n chọn từ n ô t rê của cây chủ th eo đặc tín h cô đ ịn h nitơ, cường đô th â m vào bộ rễ của cây trồng.

Nước luộc đ ậu được bổ su n g 1,0% saccarozơ và 1,5% th ạ c h . Môi trư ờ n g ch ia vào các bình ta m giác, đậy n ú t bông sạch và h ấp th a n h trù n g . Chờ k h i m ặ t th ạ c h rá n lại th ì cấy giông.

C hủng giông để tu y ể n chọn đem n h â n tro n g môi trư ờ n g nước luộc đậu, rồi lấy p ip e t vô trù n g c h u y ển tiếp vào môi trư ờng th ạch . N uôi ở 2 0 - 2 5°c tro n g v ài ngày đôn khi vi k h u ẩ n mọc đều trô n bề m ặt th ạch , ch u y ển th à n h dịch h u y ề n p h ù rồi cấy chuyến tiếp sa n g đ ấ t hoặc th a n b ù n đã vô trù n g (cách làm tư ơ n g tự n h ư p h ầ n trê n - A zotobacterin).

Đố có m ột lượng lớn ch ế ph ẩm , người ta nuồi vi k h u ẩ n q u a n h â n giống ở b ìn h lắc rồi tiếp vào các b ìn h lôn m en: trước h ế t là chọn các c h ủ n g R h izo b iu m cấy vào môi trư ờ n g rỉ đường th ê m m uôi k h o á n g tro n g các b ìn h ta m giác, rồi đem lắc ở n h iệ t độ 2 0

- 25WC. S a u đó tiếp giông vào lên m en ở các b ìn h có k h u ấ y và sục khí. Nuôi đến khi sin h trư ở n g đ ạ t tới m ức tốì đ a th ì đem ly tâ m th u sin h khối. Đe làm giảm tỷ lệ nước tro n g sin h khốỉ ta th ê m c h ấ t độn ~ cao la n h khô và vô trù n g . S a u đó đem đi đông khô. S in h khôi có c h ấ t độn được làm đông lạ n h tới - 20°c - 4 0°c rồi cho sấy th ă n g hoa ở c h ân khô n g với áp s u ấ t d ư 12 - 13kPa (kilo P ascan ). T ro n g thời g ian sấy, n h iệ t độ không q u á 30°c, độ ẩm còn lại tro n g chế p h ẩm là 3 - 7%.

T rong qu á tr ìn h sấy, m ột sô" t ế bào vi k h u ẩ n bị ch ết hoặc m ấ t h o ạ t tín h (khoảng

2 0 - 25%). Đô giảm tỷ lệ n ày có th ể d ù n g các c h ấ t bảo vệ n h ư g e latin , đường, h u y ế t th a n h , rỉ đưòng,...

C h ế ph ârn n itr a g in c h ế th eo phương p h áp này là loại đông khô, giữ được thời gian dài v ẫn còn h o ạ t tín h và tiệ n sử dụng. Do vậy, chỉ c ầ n 500g c h ế p h ẩ m cho lh a gieo trồ n g và tiế t kiệm p h â n bón hóa học từ 30 - 200 lần.

N itra g in có h iệ u qu ả cao n h ấ t với cây đ ậu tương, đặc b iệ t là với đ ấ t mới trồ n g đ ậu hoặc d ấ t th ư ờ n g bị khô h ạn , ngập nước. C h ế p h ẩm n ày làm tă n g n ă n g s u ấ t rõ rộ t với các loại cây đ ậu , lạc.

Từ lâu người ta đã b iế t sử dụ n g vi k h u ẩ n n ố t s ầ n lấm p h â n bón cho cây đ ậu . Có th ể sản x u ấ t theo phươ ng p h á p đơn giản: Rễ cây họ Đ ậu r ử a sạc h có th ể n h ú n g q u a cồn 65(>c , rồi lấy dịch c h iết từ các n ố t sầ n (giã vỡ rồi n g âm với nước vô trù n g ) cấy vào môi trư ờ ng nước n ấ u đ ậu có th ê m 1% saccarozd và 1,5% th ạ ch . Môi trư ờ n g hấp th a n h trù n g , đổ ng u ộ i chò k h i m ặ t th ạ c h rắ n th ì cấy giống từ dịch ép nốt rễ. N uôi ở 25 - 28°c tro n g v ài ngày, vi k h u ẩ n mọc đều tr ê n m ặ t th ạ c h rồi g ạ t lớp vi k h u ẩ n cho vào nước vô Irù n g th à n h dịch h u y ề n p h ù rồi đem n g âm tẩ m với h ạ t đ ậ u giống trước khi trồ n g hoặc p h u n vào đ ấ t q u a n h chỗ gieo h ạ t. C ũng có th ể đem dịch h u y ền p h ù vi k h u ẩ n trộ n với đ ấ t k h ô hoặc th a n bùn khô cùng với saccarozơ, đem phơi ở á n h sán g bức xạ tới khô th à n h ch ế p h ẩ m d ù n g dần.

1.2. PHÂN LÂN VI SINH (PHÂN LÂN SINH HỌC)

P h â n lâ n vi sin h h ay p h â n lâ n sin h học là ch ế p h ẩ m các vi s in h v ậ t có k h ả n àn g p h â n giải các hợp c h ấ t phospho khó ta n th à n h d ạn g dễ ta n v à cây trồ n g có th ể đồng

hóa được.