1384.pdf

Ra _{p i d l y} r e_{p l i} c a t i n_g , c y t o p at h i c

{

r r

/

cp e ' ^

)

v a r i a nt s o f h e _p a t i t i s A v i r u s

(

H A V

)

i s o l a t e _d f r om _p e r s i s t en _{t l y} i n f e c t e d B S- _C- _{1 c e l l s h a v e n ume r o u s mu t} a t

i

o n s f r o m t he s e _qu e nc _e o f t he c e l l c u l t u r e - a d a_{p t} ed H M 1 7 5 s t r a i n H A V t ha t se r v e

d

t o i n i t i at e t h e _p e r s i s t e n t i n f e c t

i

o n

(

Lemo n e t a l . , J . V i r o l . 6 5 : 2 0 5 6- 2 0 6 5 , 1 9 9 1

)

. T o d e t e r m

i

n e w h i c h o f t h e mu t a t

i

o n s

i

n on e s uc h r r

/

c_p e ^ v i r u s _, H M 1 7 5

/

1 8 f , a r e r e s p o n s i b l e f o r e n h an c e d r e_{p l i} c a t i o n i n BS- _C- _{1 c e l l s} , a s e r i e s o f c h i me r i c v i r u s c D N A s w a s c o n s t r u c _t e d i n wh i c h HM 1 7 5

/

1 8 f v i r u s _ge n om i c s e _{g m}en t s w e r e _{p l} a c e d w i t h i n t h e b a c _{k g}r o u n d o f an i n f e c t i o u s c D N A o f a r e l a t e d r r

/

c_p e ' v i r u s , H A V

/

7

(

H M 1 7 5

/

P 3 5

)

. T

h

e r e_{p l i} c a t i o n c a_p a c i t y o f c h i me r i c v i r u s e s r e s c u e d f r o m t h e s e c DN A s w a s a s s e s s e d i n B S- _C- _{1 c e l l s} b y t h e s i z e o f r e_{p l i} ca _{t i} o n f o c

i

i n r a d i o i mmu n o f o c u s as s a _y s . C h i me r i c v i r u s e s c o n t a i n i n _g t h e mu t a t e d P 2 r e _{g i} o n o f H M 1 7 5

/

1 8 f v

i

r u s p r odu c ed r ep l i c a t i o n f o c i t h a t w e r e l a r _g e r t h a n H A V

/

7 v i r u s , bu t n o t a s l a r _ge a s HM 1 7 5

/

1 8 f v i r u s . T h i s e n h a n c e me n t i n r e _{p l}

i

c a t

i

o n r e_qu

i

r ed mu t a t

i

o n s i n b ot h t h e 2 B a nd 2 C _p r _{o t ei} n c od i n_g r e _{g i} o n s , s u g ge s t i n g t h a t t he s e p r o t e i n s a c t c o o _p e r a t

i

ve

l

_y a nd r ema i n c l o s e l y a s s o c i a t e d d u r i n _g r e

_{p l i}

c a t

i

o n . Mu t at

i

o n s

i

n t h e 5 ' n o n t r a n s l a t e d R N A

(

5 ' N T R

)

a nd P 3 _p r o t e i n s h a d n o i n d e_p e n de n t e f f e c t o n v i r _a l r e _{p l i} c a t i o n , bu t mu t a t i o n s i n bo t h o f t h e s e g e no m i c r e g i o n s a c t e

d

c o o _p e r a t

i

v e l y w i t h mu t at i o n s i n P 2 _p r ot e

i

_{n s} t o en

h

an c e v

i

r a l r e _p

l i

c at

i

o n a n

d

r e n de r t

h

e v

i

r u s c ap a b l e o f

c o n v e n t i o n a l _{p l} a _qu e f o r ma t i o n . C y t op a t h i c e f f e c t s a s s o c i a t ed w i t h H

A

V r e _{p l i} c a t i o n a r e t h u s c o r r e l a t e d w i t h v i r a l r e _{p l i} c a t i o n ca_p a c i t y , a n d do n ot ap p e a r t o b e t h e r e s u l t o f a n_y s i n _{g l} e mut a t i o n . Fu l l e xp r e s s i o n o f t h e r r

/

c_p e '^ p h e no t y p e r e _qu i r e d mu t a t i o n s w i t h i n t h e 5 'N TR , P 2 a nd P 3 s e _{g m}e n t s o f t h e H M 1 7 5

_/

1 8 f v

i

r u s _ge n o me . T he s e r e s u l t s s u g ge s t n o v e l i nt e r a ct i o ns b e t w e e n t he 5 ' NTR a n d P 2 pr o t e i n s o f t he HA V _ge n ome du r i n _g v i r a l r e _{p l i} c a t i o n , a n d pr o v

i

d e u s e f u l n ew i n f e c t i o u s c D N A c l o n e s f o r f u r t he r mo l e c u l a r s t ud i e s o f H A V .

Hep a _{t i t i} s A , o n e o f t h e o l d e s t d

i

s e a se s k n o w n t o hu ma n , r ema i n s an _{i m p} o r t a n t _p u b l i c h e a l t h _p r o b l e m i n t h e Un i t e d S t a t e s a n d i n t he wo r l d . I t i s c ommo n c a s e s o f a c u t e v i r a l h e_p a t i t i s , w i t h a bo u t 2 2 , 0 0 0 c a s e s p e r y e a r , r e p o r t e d t o pu

b

l i c he a l t h a u t h o r i t i e s w i t h i n t h e Un i t e d S t a t e s

(

L emo n an d S h a_{p i} r o , 1 9 9 4

)

. T h e an n ua l t r e a t me n t c o s t s i n t he U S A a r e e s t i ma t e d t o b e mo r e t h a n U S

$

2 0 0 m i l l

i

o n

(

Ha d l e r , 1 9 9 1

)

. He _p a t i t i s A v i r u s

₍

HA V

₎

, t h e e t i o l o g

i

c a ge nt f o r h e_p a

_{t i}

t i s A , w a s f

i

r s t i de n t i f

i

e d b y u s i n_g i mmu n e e l e c t r o n m i c r o s c o_{p y}

(

l E M

)

b y F e i n s t o n e e t a l . i n 1 9 7 3 .

A

l t ho u g h e a r l y c l a s s i f i e d a s en t e r o v

i

r u s t y p e 7 2 _, HA V i s n o w c l a s s i f i e d a s a u n _{i q}ue _g en u s He_p a t o vi r u s w i t h i n t h e f a m i l y o f P

i

c o r na v

i

d a e du e t o i t s u n

i

_qu e f e a t u r e s

₍

Fr a n c k i e t a l . 1 9 9 1

)

. H A V i s a n o n e n v e l op e d a n d i c o s ah e d r a l s h ap e d p a r t

i

c l e w i t h a d

i

ame t e r o f 2 7 nm . T h e p a r t i c l e ha s a s e d i men t a t i o n c o n s t a nt o f 1 5 5 S an d a b uo _y a n t d e n s i t y o f 1 . 3 3 g

/

c rn -^ i n C sC l . T he HA V p a r t i c l e c o nt a i n s 6 0 c o p i e s o f t hr e e ma

j

o r c a _p s

i d

_p r o t e

i

n s , V P l , V P 2, a n

d

V P

S

(

Co u l ep

i

s et a l . 1 9 7 8

)

a n d ma y b e a sma l l

f

o u r t

h

c ap s

i d

p r o t ei n V P 4 . H A V c o n t a i n s a

_p

o s i t i v e- s e n se RN A _g e n ome o f - _{7 5 0}

₀

_{n u c l e o t i d e s} , w

i

t h a sma

l

l _p r o t e i n

(

V P g

)

l i n ke d a t t he 5 ' - e nd a nd a p o l ya d e n _{y l} a t e d t r a c t _p r e s e n t a t 3 ' - en

d

. T

h

e 5 ' no n t r an s l a t e d r e _{g i} o n

(

5 ' N T R

)

h a s 7 3 5 n u c l e o t

i

de s a nd c o n t a i n s 1 0 t o 1 2 A U G t r i p l e t s _p r i or t o t h e i n i t

i

a t i o n c o do n wh i c

h

b e _{g i} n s a s i n _{g l} e l a r _ge o_p e n r e a d

i

n _g f r a me

(

O R E

)

(

Na

_j

a r i a n e t a l . 1 9 8 5

)

. HA V 5 'N TR _{c o} n t _a i n _{s a} h i g h l y _{o r} d e_{r e} d s e c o n d a r _y s t r u ct u r e

₍

Br o w n e t a l . 1 9 9 1

)

an d a n i n t e r n a l r i b o s o me e n t r _y s i t e

₍

_Br ow n e t a l . 1 9 9 4

)

. A l t ho u _{g h} s e v e r a l h i g he r _p r

i

mat e s_p e c i e s s u c h as C h i m p an z e e , O l d an d N e w Wo r l d mo n k e y s , a n d Ma r mo s e t s a r e s u s c e _{p t i b l} e t o human H A V , huma n s s e em t o b e t h e o n l y n a t u r a l h o s t r e_{p l i} c a t e s i n h e _pa t o c _{y t} e h uma n H A V

(

Ba l a _ya n , 1 9 9 2

)

. Th e r e i s n o e v i de n c e o f a n _{t i g} en i c v a r i a_{b i l i t y} amo n_g HA V s t r a i n s an d a l s o no an _{t i g}en i c c r o s s - r e a c t i v _{i t y} w i t h o t he r h e_p a t i t i s v i r u s e s . Po l yc l o n a

l

a n t i

b

o

d

i e s c an ne u t r a l i z e a l l g en o _{t y p} e s o f H A V

(

L emo n e t a

l

. 1 9 8 7

)

. T he t r a n sm i s s

i

o n o f H A V

i

s a l mo s t a l w a _ys

b

_{y t h} e f e c a l - _{o r a l r o u t e} , su c h a s f e c a l c on t am

i

n a t i o n o f w a t e r o r f o o d s o u r c e s

(

De i n ha r d t _, 1 9 9 2

₎

. A f t e r e x_p o su r e , t h e r e i s a n i n c ub a t

i

o n p e r

i

o d o f a _{p p} r o x i ma t e l y 2 8 d a _y s , w i t h a r a n ge o f 1 5 - _{4 5 d} a _y s . On c e t he v

i

r u s r e a c he s t he l i v e r , i t r e p l i c a t e s i n he p a t o c y t e s a n

d

i

s r e l e a s e d

i

nt o t he b

l

o o ds t r eam . Me a n wh

i l

e , t

h

e v

i

r u s

i

s s he d i n t h e f e c e s b y _p a s s a _ge t h r o u _{g h} t he b i l i a r _y t r a c t

(

Gu s t a n d Fe i n s t o n e , 1 9 8 8

)

. T h e o n s e t o f i l l n e s s i s o f t e n a br up t . T h e s _{y m p t} o ms a r e ma r k ed b y da r k ur i ne ,

j

a u n d i c e , ma l a i s e , f ev e r , n a u s e a an d vom i t

i

n g

(

Ko f f , 1 9 9 2

)

. S i n c e n o sp e c i f i c t r e a t me n t e x i st s f o r he _p a t i t i s A , p r e v e n t i o n i s t he mo s t e f f e c t

i

v e a_{p p} r o a c

h

a _ga

i

n s

t

t

h i

s

d i

s e a s e . Howe v e r _, H A V

i

s o n e o f t he mo s t r e s i st an t v i r u s e s t o e n vi r o nme n t a l c o n

d i

t

i

o n . L

i

k e ot h er

p

i c o r n a v i r u s e s , H A V

i

s r e s i s t an t t o e t he r _, a l c o h o l , a c i d , a nd ma ny d e t e r ge n t s . I n a d d i t i o n , t h e

p T h e f i r s t r e_p o r t o f s u c c e s s f u l _p r o _p a _ga _{t i} o n o f H A V i n c e l l c u l t ur e w a s _{b y} Pr o v o s t a n d H i l l ema n

(

1 9 7 9

)

. The r e _{p l i} c a t i o n c _yc l e o f H_AV i s n o t c l e a r _ye t , bu t i t i s t ho u g h t t o _b e s i m i l a r _t o t ha t o f o t h e r _{p i} c o r n a v i r u s e s . A l t h ou g h w

i

l d- t

y

p e H A V h a s a c ha r a ct e r i ca _{l l y} s l o w a n d n o n c _{y t} o _p a t h i c r e _{p l i} c a t i o n c _yc l e i n c u l t u r e d c e l l s _, w i t h s e r i a l _p a s s a _ge t he v i r u s b e c o me s _p r o _gr e s s i v e l y a _d a_{p t} e d t o _gr o w t h i n c e l l c u l t u r e

(

Pr o v o s t a nd H i l l ema n _, 1 9 7 9; B i n n e t a l . 1 9 8 4 ; J a n s e n e t a i . 1 9 8 8 ; Co h e n e t a l . 1 9 8 7a

)

. Ce l l c u l t u r e -a da _{p t} e d v a r i a n t s o f H A V h a v e a l o w e r _p a r t i c l e - t o -

i

n f e c t i v i t y r a t i o i n cu l t u r e d c e l l s a nd

_p

r odu c e l a r _ge r e_{p l i} c a t i o n f o c i a f t e r 1 4 d a _y s _gr o w t h i n r a d i oi mmu n o f oc u s a s s a _y s _{, b}u t c o n t i n u e t o i n i t i a t e _p e r s i s t e n t , ge n e r a l l y n o n c y t op a t h i c i n f e c t i on s

₍

J an s e n e t a l . 1 9 8 8

)

. Un de r o n e - _{s t e} p gr o w t h c o nd i t i o n s , t h e s e c e l l c u l t ur e - _{a d a} p t e d v i r u s e s ma _y s t i l l r e_qu

i

r e s e v e r a

l

d a _ys o r l o n _ge r t o r ea c h ma x

i

mum v

i

r u s y

i

e l

d

s . Be c au s e ce l l - _c u l t u r e a

d

a_{p t} e

d

v a r i a n t s o f H A V ar e o f t e n a t t e n u a t e d w i t h r e s _p e c t t o t he i r a b i l i t y t o i n du c e a c u t e h e_p a t o c e l l u l a r i n

_j

u r _y i n s u s c e _{p t i b l} e _pr i ma t e s

₍

Pr o v os t e t a l . 1 9 8 2 ; Ka r r o n e t al . 1 9 8 8 ; Ta y l o r e t a

l

. 1 9 9 3

)

, a n u nd e r s _t a n d

i

n _g o f t h e mo l e c u l a r me ch a n

i

sm

(

s

)

u n

d

er l y i n

_g

c el l c u l t ur e a d a_{p t} a t i o n c o u l d b e u s e f u l i n _{t h}e r a t i o n a l d e s i gn o f n o v e l a t

t

e n u a t e

d

H A V v a c c

i

n e c a n

d i d

a t e s .

To w a r _d t h i s en _{d , t h} e _ge no me s o f s e v e _{r a} l i n d e_p e n de n_{t l y} i s o l a t e d c e l l c u l t u r e - a da _{p t} e d v a r i an t s o f t he H M 1 7 5 s t r a

i

n o f H AV h a v e b e e n c om p l e t e l y s e _qu e nc e d a nd c o m p a r e d w i t h t h e s e _qu e n c e o f w i l d -t y p e

₍

3r _{d m}a r mo s e t _pa s s a _g e

)

v i r u s . Fr o m t h e w i l d- t y p e s e _qu e n c e

₍

Co h e n e t a l . 1 9 8 7 c

)

_, t h e s e i s o l a t e s h a v e b e en sh o w n t o c o n t a i n a t o t a l o f 1 9 mu t at

i

o n s

(

H M 1 7 5

/

P 1 6, a n i s o l a t e s t u d

i

e d a t t h e 1 6 t h c e l l c u l t u r e p a s s a _g e l ev e l

)

(

Ja n s e n e t a l . 1 9 8 8

)

, 2 5 mu t a t i o n s

(

H M 1 7 5

/

P 3 5

)

(

Coh e n e t a l . 1 9 8 7a

)

, o r 4 2 mu t a t i o n s

(

H M 1 7 5

/

P 5 9

₎

(

Ro ss e t a l . 1 9 8 9

)

. Ea ch o f t h e s e t hr e e i n d e_p e nd en t i s o l a t e s sh a r e s c o mmo n mu t a t i o n s i n t h e 5 ' n o n t r a n s l a t e d r e _{g i} o n

₍

5 ' N T R

₎

an d i n t h e P 2 a n d P 3 r e _{g i} o n s o f t he _ge n ome . Exp e r i me n t s w i t h ch i m_{e r} i _c i n f _{e c} t i o u _s cD N A c l o n e s i n _{d i} c a t e t h a t m u t a t i o n s i n bo t h t he 5 ' N TR a nd P 2 r e _{g i} o n

(

2 B a n d 2 C _p r o _t e i n s

₎

c o n t r i bu t e t o t h e ab i l i t _y o f t h e v i r us t o _gr o w i n c e l l s o f A f r i c a n _g r e e n mo n k e _y k

i d

n e_y

l i

n e a

_g

e

(

Da

_y

e t a

l

. 1 9 9

2

; E me r s o n e t a

l

. 1 9 9 3

)

. F i gu r e 1 sho ws t h e _g en om i c o r _gan i z a t

i

o n a n d i t s r e l a t i v e _p r o t e i n s o f

h

e _p at

i

t

i

s A v i r u s . An

d

e r s o n

(

1 9 8 7

)

an

d

Cr ome a n s

(

1 9 8 7 ; 1 9 8 9

)

d emo ns t r a t e d a u n

i

_qu e r e _{p l}

i

c a t i o n _{p h} e no _{t y p} e f o r H M 1 7 5 v a r

i

a n t s t

h

a t w e r e r e s c ue d f r o m c e l

l

c u

l

t u r e s w h

i

c h

h

a

d

b

ee n _p e r s

i

st e n t

l y

i n f e c t e d w i t h c e l l c u l t u r e - ad a_{p t} e d H A V . T h i s p he n o t y p e i s ch a r a c t e r i z e d _{b y} a r e l a t i v e _{l y} r a _{p i d} r e _{p l i} c a t i o n c _y cl e ,

i

n c

l

u

d i

n _g t h e _p r o du c t i o n o f ma cr o s c o _{p i} c f o c

i

o f v

i

r a l r e_{p l i} c at i o n

d

e mo ns t r ab l e

i

n r a d i o i mmu no f o c u s a s s a _y s ca r r i ed

m i m l i _{y i} l d d o n e - s t e _{p g}r o w t h c o n d i t i o n s

(

Cr ome a n s e t a l . 1 9 8 9; L emo n e t a l . 1 9 9 1

)

. I n a d d i t i o n _, t he s e HM 1 7 5 v _{a r}

i

a n t _s f _o r m vi _s i b l _e p l a _qu e s wh e n i n f e c t e d c e l l s ma i n t a i n e d u n d e r a _g a r o s e o v e r l a _y s a r e s t a i n e d w i t h v i t a l d y e s s u ch a s n e u t r a l r e d _,

d

e s _p

i

t e

_{t h}

e ab s e n c e o f ho s t c e l

l

met ab o l

i

c s hu t o f f . We h av e c h ar a c t e r i z e d t he s e v i r u s e s a s r r

_/

c_p e ^

(

_p o s i t i v e f or r a_{p i d} r e_{p l}

i

c a t

i

o n a n d c _{y t} o _p a t h i c e f f e c t

)

_, an d r e c en _{t l y} r e _p o r t e d t h e ne a r _{l y} c o _{m p l} e t e n u c l e o t i de s e _que n c e s o f 3 c l o n a l l y d

i

s t i n c t r r

/

c_p e ^ H M 1 7 5 v a r i an t s r e c o v e r e d f r om a s i n _{g l} e

p

e r s i s t e n _{t l y} i n f e c t e d c e l l cu l t u r e

(

L emo n e t a l . 1 9 9 1

)

. We f o u n d t h a t t he _g e n om i c s e _qu e n c es o f e a c h o f t h e s e v

i

r us c l o n e s c o n t a i n 3 1 t o 4 2 mu t a t

i

o n s f r om t h a t o f H M 1 7 5

/

P 1 6

(

J a n s en e t a l , 1 9 8 8

)

_, a vi r u s w h i c h i s c l o s e l y r e l a t e

d

b

y p a s s a _ge

h

i s t o r _y t o t h e v i r u s w h i c h s e r v e d t o i n i t i a t e t he o r _{i g i} n a l _p e r s i s t en t i n f e c t i o n

(

F i g . 2

)

. Wh i l e t h e P I

(

c a_p s i

d

_p r o t e i n - c o

d i

n_g

)

s e_{g m}e nt s

(

Ru e c ke r t a n d W i mme r , 1 9 8 4

)

o f t h e _ge n o me s o f t h e s e 3 c l o n a l r r

/

c_p e ^ i s o l a t e s c o n t a

i

n d i s t i n c _{t l y} d i f f e r e n t mu t a t i on s , s e g me n t s w i t h i n t he 5 ' n o n t r a n s l a t e d RN A

(

5 ' N T R

)

, P2 , P 3 an d 3 ' _{N T R} r eg

i

o n s of e a ch o f t h e s e v i r u s e s s ha r e

i

n c o mmo n a n um b e r o f

i d

e nt

i

c a

l

mut a t i o n s _, i n cl u

d i

n _g man _y w i t h i n t h e _p o

l

_{y p} r o t e

i

n c od i n _g r e _g

i

o n w

h i

c h a r e s i l e n t

(

Le mo n e t a l . 1 9 9 1

)

. T h e s e f

i

n d i n gs h a ve s u_{g g}e s t ed t ha t t he s e v i r us _ge no me s m

i

g h t

b

e t

h

e p r o du c t s o f r e c omb i na t i o n e ve n t s du r i n _g p e r s i s t e n _t i n f e c t i o n , an d t ha t t he s ha r e d mu t a t i o n s w e r e p o s

i

t i v e l y

s e l e c t e d f o r t h e i r a

b

i l i t y t o c o n t r i bu t e t o en ha n c e d f i t n e s s o f t h e v

i

r a l R N A i n _p e r s i s t e n _{t l y} i n f e c t e d B S- _C- ₁ c e l l s . He r e , w e de s c r i b e t h e c o n s t r u c t i o n o f a s e r i e s o f i n f e c t i o u s c h i me r i c v i r u s c D N A s co nt a i n

i

n _g s e _{g m}en t s o f a n r r

/

c_p e '_^ v a r i a n t

(

H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s

₎

₍

L emo n e t al . 1 9 9 1

)

w i t h i n t h e b a c _{k g}r o u n d o f a c e l l cu l t ur e - a d a_{p t} e d b u t r r

/

c_p e ~ H M 1 7 5 v a r i an t

(

H A V

/

7 , r ep r e s en t i n g t h e s e qu e n c e o f H M 1 7 5

/

P 3 5 v i r u s

)

(

Co h e n e t a l . 1 9 8 7 b

)

(

F i g . 2

)

. T he s e e xp e r i me n t s d emo n s t r a t e t he i n v o l veme n t o f mu _{l t i p l} e _gen o m i c r e _{g i} o ns i n d e t e r m i n i n _g t he r r

/

c_p e ' ^ p he n o t y p e , a n d h av e r e s u l t e d i n t h e c on s t r u c _{t i} o n o f s e v e r a l n ew i n f e c t i o u s c D N A c l o n e s w h i ch g en e r a t e v i r u s w i t h s _{i g}n i f i c a n t

l

_y e nh a n c e d c a_p a c _{i t y} f o r gr ow t h i n c e l l cu l t u r e .

H A V

/

7

(

H M 1 7 5

/

P 3 5

)

v i r u s i s a c e l l -c u l t u r e a d a_{p t} e _{d ,} r r

/

c_p e ~ v a r i a n t o f t h e HM 1 7 5 s t r a i n o f H A V w h i ch w a s r e s c u e d f r om c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h f u l l - _{l en} g t h R N A de r i ve d f r om t he i n f e c t i o u s c l o n e _{p G 3}

/

7

(

Co h e n e t a l . 1 9 8 7 b ; Da y e t a l . 1 9 9 2

)

(

s e e b e l o w

)

. H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s

(

" cl o n e B "

)

i s a r r

/

c

_p

e^ v a r i an t t h at wa s c l o n a l l y i s o l a t e d f r om a _g a r o s e o ve r l y i n _g r e_{p l i} c a t

i

o n f o c i o f v i r _u s r e c o v e r e d f r om a _p e r s i s t en _{t l y} i n f e c t e d c e l l c u l t u r e

₍

Lemo n e t a l . 1 9 9 1

)

. Th e s e v i r u s e s r e_p r e s e n t i n d e_p e n de n t i s o l a t e s o f t h e HM 1 7 5 s t r a i n o f HA V

(

F

i

_g . 2

)

. T h e ge n ome o f t h e H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s c o n t a i n s a t o t a l o f 3 1 mu t a t

i

o n s f r om t h at o f H M 1 7 5

/

P 1 6, wh

i

c h i s c l o s e_{l y} r e l a t e d _t o t h e v i r u s w h i ch i n i t i a t e d t he _p e r s i s _t e n t i n f e c t

i

o n f r om wh i ch H M 1 7 5

/

1 8 f w as d e r i v e d

(

Ja n s e n e t a l . 1 9 8 8 ; L emo n e t a l . 1 9 9 1

)

(

F i g . 2 _, T a

b

l e 1

)

. H M 1 7 5

/

1 8 f h a s 4 4 mu t a t

i

o n s f r om t h e w

i

l d -t y p e

₍

3r _d ma r mo s e t _p as s a _ge

)

H M 1 7 5 v

i

r u s a n

d

4 6 mu t at i o n s f r om t h e s e _qu e n c e o f H A V

/

7 v i r u s

(

T a

b l

e 1

)

(

Co he n e t ai . 1 9 8 7a ; Coh e n e t al . 1 9 8 7c ; Le mo n e t a l . 1 9 9 1

)

. Ce l l s He _p a t

i

t i s A v i r u s e s w e r e _p r o _pa _g a t e d i n c on t i n u o u s l y c u l t ur e

d

A f r

i

can _gr e e n mo n k e _y k

i d

n e

_y

(

B S- C- 1

)

c e

l l

s

(

_p a s s a _ge 9 0- _{1 1 0}

)

, a s p r e v i o us l y de s c r i be d

(

B i n n e t a l . 1 9 8 4

)

. R N A t r a n s f e c t i o n s w e r e c a r r i e_d o u t i n a f e t a l R h e s u s k i dn e _y c e l l l i n e

(

F R

h

K- ₄

₎

.

1 0 C h i me r i c i n f e ct i o u s c DN A c o n s t r u c t s c DN

A

s e _{g m}e n t s r e_p r e s en t i n _g t h e 5 ' NT R , P 2 , P 3 a nd 3 ' NTR r e _{g i} o n s o f t h e H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s _ge n ome w e r e a_{m p l i f i} e d f r om v i r a l R N A b y a c o mb i n a t i o n o f r e v e r s e - t r an s c r

i

_{p t}

i

o n a n d po l yme r a s e c h a i n r e a c t i o n

(

R T

/

PCR

)

. T he o l i go n uc l e o t i de p r i me r s u s e d i n t he s e r e a c t

i

o n s a r e sh o w n i n T ab l e 2a . Ea ch c o n t a

i

n e d a u n i que r e s t r i c t i o n s i t e n e a r t h e 5 ' t e r m i n us wh i ch f a c i l i t a t e d t he i n s er _{t i} o n o f t h e am p l i f i ed cDNA s e _{g m}e n t i n t o _{p l} a s m

i

d v e ct o r s . A s t h e s e qu e n ce a t t h e ex t r eme 5 ' t e r m i n u s

(

n t s 1- _{2 9}

₎

o f t h e H M 1 7

5

/

1 8 f v i r u s i s no t kn o w n

(

L emo n a t a l . 1 9 9 1

)

, t h e s e qu en c e o f t h e 5 ' N T R u_p s t r e am _pr i me r w a s b a s e d o n t h a _t o f t h e r e l a t e d H M 1 7 5

/

P 1 6 v

i

r u s

(

wh i c h c o n t a i n s t w o mu t a t i o n s f r o m w i l d -t y p e i n t h i s r e _g

i

o n

)

(

J an s e n e t a l . 1 9 8 8

)

. T he 5 ' N TR cD NA s e _{g m}e n t w a s r e s t r i c t e d a t i f

i

nd l l l a n

d

Xjba l s i t e s a n

d

i n s e r t e d i n t o t h e v e c t o r _{p G E M 3}

(

Pr o me _ga

₎

_{t o y i} e l d t he _{p l} a s m

i d

_{p S} ' P C R , S

i

m

i

l a r _{l y ,} t h e P 2 H M 1 7 5

/

1 8 f cD N A s e _{g m}e n t w a s r e s t r i ct e d a t Sa

d

an d £ c oR I s i t e s a nd i n s e r _t e d i n t o _{p G E M 3}z f

(

-

₎

₍

_{Pr ome} g a

₎

t o _y

i

e l d t h e _{p l} a sm i d _{p P 2 P C R} . T h e 3 ' N T R H M 1 7 5

/

1 8 f c D N A s e _{g m}e n t w a s r e st r

i

ct e

d

a t Ec oR l a nd Sai l s

i

t e s a n

d

i n s e r t e d

i

n t o t h e v e c t o r M 1

3

_{m p l}

8

t o _y

i

e

l d

t h

e

_{p l}

a sm

i d

p M F-

1

. p G 3

/

7 c o n t a i n s t h e HA V s e _qu en ce o f _{p H A V}

/

7

i

n t h e v e c t o r p GEM 3

(

Co h e n e t a i . 1 9 8 7 b ; Da y e t a i . 1 9 9 2

)

. T h i s p l a sm i d w a s mo d i f i e d b y r emo vi n_g t h e r e s i du a l Sa

d

a n

d

Ec oR l s i t e s i n t

h

e mu _{l t i p l} e c l o n

i

n _g s i t e o f t h e _{p G E M 3} v e c t or s e _qu e n c e _, y

i

e l

d i

n _g t h e _{p l} a sm

i d

_{p G}

3

/

7 d . Us

i

n g u n

i

qu e r e s t r i c t

i

o n s

i

t es w i t h i n _{p G 3}

/

7 o r _{p G 3}

/

7 d , a s e r i e s o f ch i me r i c p l a sm i

d

s w a s

c o n s t r uc t e d i n wh i c h c D N A r e _p r e s e n t i n_g t he 5 'N T R _, P 2 _, a n d 3 ' N T R s e _{g m}en t s o f t h e H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s _ge n o me

(

f r o m _{p S}' PC R, p P2 PCR an d _{p M}F - 1

)

r e _{p l} a c e d t he co r r e s _po n d i n _g s e _{g m}e n t i n t h e f u l l - l en _{g t h} i n f e c t i o u s c l o ne , a s sh ow n F i g . 3 . T he 5 ' N T R s e _{g m}e n t c on t a i n e d t h e s e _qu e n c e f r o m n t 0

(

H i n d l l l

)

t o 7 4 4

(

Xj

b

a l

)

_p o s

i

t

i

o n s i n t h e H M 1 7 5 v i r u s

(

f o r c o n s i s t e n c_y , a l l ma _{p p}o s i t i o n s a r e t h o s e o f t h e w i l d- _{t y p e v i r u s}

₎

₍

_{Co h en e t} a l . 1 9 8 7c

)

/ t he P 2 s e g me n t c o n t a

i

n ed s e qu e nc e f r o m n t 2 9 9 3

(

5a c l

)

t o 4 9 7 7

(

E c oR l

)

, a nd t h e 3 ' N T R c o nt a i n e d t h e s e _qu e n c e f r om nt 7 0 0 3

(

X h o l

)

t o t h e e n d o f t h e _p o _{l y}

(

A

₎

t r a c t

{ H

a e l l o r Sp h l

)

. p G 3

/

7 - ₅ ' . I S f d w a s c on st r u _c t _e d b y d i g e s t

i

n g p S ' P C R a n d p G 3

/

7 d w i t h Xjba l a n d Sa

d

an d l

i

_ga t

i

n g t h e sma l l f r a _{g m}e nt o f

_p

G 3

/

7 d an d t h e l a r _g e f r a _{g m}e n t o f _{p S} ' P C R . T h_e r e s u l t

i

n _g c l o ne w a s d i ge s t e d w i t h Aa _{t l l} a nd Sa

d

an d t h e l a r ge f r a _{g m}e n t _{l i g}a t e d w i t h t he l a r _g e Aa t l l

/

Sa

d

f r a _{g m}e n t o f p G 3

/

7 d . p G 3

/

7 - _{P 2} . 1 8 f d c o nt a i n s t h e sma l l Sa c I

/

£ coR I f r a g me nt o f _{p P 2 P C R}

i

n s e r t e d i n _{p G 3}

/

7 d . p G 3

/

7 - ₃ ' . 1 8 f w a s c o n s t r u c t e d b y P C R a m p l i f i c a t i o n o f t h e H A V s e _qu e n c e b e t w e e n t he X h o l s i t e a n d t h e 3 ' en d o f t he _ge n o me _p r e s en t i n _{p M F}- 1, a nd i n s e r t i o n o f t h i s s e _qu en c e i n t o X h o l

/

Sp h l s i t e s o f p G 3

/

7 . T h

i

s c l o n e c o n t a

i

n s a

3

' p o _{l y}

(

A

)

t r a c t w

h

i ch

i

s

2

0 n t s i n l e n _{g t h} . Fo l l o w i n g d i ge s t i o n w i t h S p h l , t h i s a nd o t he r c D N A c l o n e s c o nt a i n i n _g t h e 3 ' e n d o f H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s y

i

e l d R N A t r a n sc r

i

_{p t} s w i t h o n e a d d i t i o n a l n u c l e o t i de do wn s t r e am o f t h e _p o l y

(

A

)

s e _qu e n c e . A d d i t

i

o n a l ch i me r i c c o n s t r u c t s , p G 3

/

7- 5 ' _{P 2} . 1 8 f d a nd p G 3

/

7 - ₅ ' P 2- ₃ ' . 1 8 f

(

F

i

g . 3

)

w e r e c o n s t r u c t ed i n a s i m i l a r ma n n e r .

12

C h i me r i c _{p l} a sm i d s c o n t a i n i n _g c D N A r e_p r e s e n t i n _g t h e P 3 r e_{g i} o n o f H M 1 7 5

/

1 8 f vi r u s w e r e c o n s t r uc t e d a s f o l l o ws . T h e R T

/

P

C

R a _{m p l i f i} e

d

H M 1 7 5

/

1 8 f P 3 c D N A s e

_g

me n t w a s d

_i

_g e s t e d w

i

t

h

Ec o R l a n d X h o l , t h e n i ns e r t e d d i r e c t l

y

i n t o t h e P 3 r e g i o n o f p G 3

/

7- ₅ ' P2 - ₃ ' . 1 8 f t _o y i e l d * _{p G 3}

/

7- 5 ' P 2P3- ₃ ' . 1 8 f . Su b s e qu en t DNA se _qu en c i n _g o f t h i s _{p l} a s m i d _d emo n s t r at e d t h e p r e s en c e o

f

t wo u n a n t i c i p a t e d mu t a t i o_{n s} i n t he P

3

r e _g

i

o n

(

C- _{5 0 9 0 t o T} , a n

d

C- 6 9 5 8 t o T

)

. T h e s e w e r _e c _{o r r e c} t ed b y P CR _s

i

t e-

d i

_{r e} c t _e

d

mu t a

_g

e n e s i s f o l

l

ow i n _g d

i

g e s t i o n o f * _{p G 3}

/

7- 5 ' P 2 P 3- 3 ' . 1 8 f b

y

E c oR l a n d Sp h l a n d i n s e r t i o n o f t he sma l

l

f r a g me n t i nt o p G E M

3

t o _{y i} e l

d

t h e _{p l} a sm i d * _{p P 3}- 3 ' H A V . T h e c o r r e c t ed p r odu ct , p P 3 - ₃ ' H A V , w a s sh o w n t o c o n t a

i

n t h e p r e v i o u s l y d e t e r m i n e d P 3 s e_qu en c e o f t h e H M 1 7 5

/

1

8

f v i r u s

(

L emo n e t al . 1 9 9 1

₎

. T h e f u l l - l en g t h ch i me r i c _p

l

a sm i d s _{p G 3}

/

7 - P 3 . 1 8

f

d / p G 3

/

7- 5 ' P 3- 3 ' . I S f

d

, p G 3

/

7 -P 2 -P 3 . 1 8 f

d

_, p G 3

/

7 - ₅ ' P 2 P 3 . 1 8 f d a nd p G 3

/

7- 5 ' P 2 P 3- 3 ' . 1 8 f

(

F

i

g .

3 )

w er e c o n s t r u c t ed

i

n a f as h

i

o n s i m i

l

a r t o t h a t de s c r i b e d ab o v e _{b y}

i

n s e r t i o n o

f

t h e smal l Ec oR l

/

X h o l o r E c o R l

/

S

_p

h l f r a_g

m

en t s o f _p P 3- ₃ ' H A V i n t o p r e v

i

o u s l y c o n s t r u c t e d c

l

o n e s . A d

d

i t i o n al P 2 r e _{g i} o n c h i me r a s c o n t a i n e d o n l y t he ^ A B o r 2 C _p r o t e i n c o

d i

n

_g

r e _{g i} o n s o f t h e H M 1 7 5

/

I 8 f v i r u s . cD N A s e _g

m

e n t s r e_p r e s en t i n _g t h e 2 A B a nd 2 C r e _{g i} o n s we r e P C R a_{m p l}

i

f

i

e

d

f

r om t

h

e D

N

A o f

_{p G}

3

/

7- _P

₂

. 1 8 f

d

. T he o _{l i g}o n u c l e o t i de _p r i me r s u s e d i n t h e s e r e a ct i o n s a r e s hown i n Tab l e 2 b . B e ca u s e n o su i t a

b

l e r e s t r i c t i o n s i t e s ex

i

s t

b

e t we e n t h e 2 A B a n d 2 C c o d

i

n_g r e_g

i

o n s o f H A V , p r i me r s S L

A

-3 9 9 8 X a n d S L

A

+ 4 0 1 2 X w e r e

d

e s

i

_gn e

d

t

o

_p

l a c e a u n

i q

u e Ec oR V

r e s t r i c t i o n s i t e b e t w e e n t he 2 AB an d 2 C c od i n_g r e _{g i} o n s b y c r e a t i o n o f a s i n _{g l} e s i l e n t mu t a t i o n a t _p o s i t i o n 4 0 2 2

(

T t o C

)

. T h e am p l

i

f i e d 2 AB cD N A s e g men t wa s r e s t r i c t e d a t S_a

d

a n d Ec o RI s i t e s a nd i n s e r t e d i n t o t h e v e c t o r _{p G E M 3}z f

(

-

₎

_{t o} y i e _{l d t h} e _p l a sm i d p 2 A B . 1 8 f m . T he 2 C HM 1 7 5

/

1 8 f c DNA s e g men t w a s r e s t r i c t ed a t E c o R I a n d Bam H I s i t e s a nd i n s e r t e d i n t o t h e v e c t o r _{p G E M 3}z f

₍

-

₎

t o _{y i} e l d t h e _{p l} a s m i d _{p 2 C 1 8 f m} . T he p l a s m i d _p P2 . 1 8 f m w a s su b s e qu e n_{t l y} c r e a _t e d b y l

i

_ga _t

i

o n o f t he l a r _ge E c dR l

/

E c oRV f r a _{g m}e n_t o f _{p 2 A}B . 1 8 f m a n d t h e sma l l EcoR l

/

E c oR V f r a _gmen t o f

_p

2 C . 1 8 f m . T h e f u l l -l e n _{g t h} c o n s t r u c t p G 3

/

7

- P 2 . 1 8 f

d

m w a s c o n st r u c t e

d

b

y r ep

l

a c

i

n g t h e P 2 r e g

i

o n o f p G 3

/

7- P 2 . 1 8 f d w i t h t he P 2 r e g i o n o f t he _{p l} a s_{m i d p P 2} . 1 8 f m. T hu s , t h e s e que n c e o f p G 3

/

7 - _{P 2} . 1 8 f d m i s i d e n t i c a l t o p G 3

/

7 -P 2 . 1 8 f d e x c ep t f o r t he s i l en t mu t a t i o n cr e a t e d f o r t h e Ec oRV s

i

t e a t _p o s i t i o n 4 0 2 2 a nd a s e c o n d s

i

l e n t mu t a t i o n o c c u r r i n _g a dv en t

i

t

i

o u s _{l y} a t _p o s i t i o n 3 8 9 9

(

T t o C

)

. p G 3

/

7 d m, w h i ch c o n t a

i

n s a s

i

m

i

l a r l

_y

e n

_g

i n e er e

d

EcoR V s

i

t e w i t h i n t h e b a c k gr o u nd o f t h e f u l l - _l e n _{g t h} H A V

/

7 v

i

r u s s e _qu e n c e , w a s c on s _t r u c t e

d

i n a n i

d

en t i c a l f a s h i o n _{b y} i n s e r t i o n o f P C R am p l i f i e d H A V

/

7 2 AB a nd 2 C c D NA s e _{g m}e n t s i n t o _{p G 3}

_/

7 d . F

i

n a_{l l y} , p G 3

/

7 - _{2 A B} . 1 8 f

d

a n

d

p G 3

/

7 -2 C . 1 8 f d w e r e c o n s t r u c t ed b y r e_{p l} a c

i

n _{g t h} e

2

A B

(

2 9 9 3 t o 4 0 1 9

)

o r 2 C

(

4 0 2 0 t o 4 9 7 7

)

r e _{g i} o n s o f _{p G 3}

/

7

d

m w

i

t

h

t

h

e

2

A B o r

2

C o f H M 1 7 5

/

1 8 f v

i

r u s _, ob t a i ne d f r o m p G 3

/

7- P 2 . 1 8 f d m f o l l o wi n g d i ge s t i o n w i t h Sa c l

/

Ec o RV or Ec oRV

/

Ec oR l . p G 3

/

7 - _{2 A B C} . I S f d m, w h

i

c

h

c o nt a

i

n s t h e e n t i r e P 2 r e g i on o f H M 1 7 5

/

1 8 f , w a s r e c o n s t r u c t e d f r om t h e s e t wo _{p l} a sm i d s a s d e s c r i b e d i n Re su l t s .

14

A l

l

P C R -am p l i f i e _d cDNA s e _gme nt s we r e s e _qu e n c e d a s D NA t o de t e r m i n e w he t h e r an _y a d d i t i o n a l mut a t i o n s w e r e i n t r o du c e d du r i n_g t h e am p l i f i c at i o n _p r o c e s s . I n a d

d i

t

i

o n _, t h e c o n s t r u c t i o n o f c h i me r i c _{p l} a sm i d s w a s v a l i d a t e d _{b y} D NA s e _qu en c i n _g a t s e l e c t e d s _{i t} e s o f r e_{p l} a c eme n t s . R N A t r a n s c r i p t i o n a n d t r a n s f e c t i o n r e a c t i o n s RN

A

t r a n s c r i p t i o n a n d l

i

_p o s o me - me d i a t e d t r a n s f e c t i o n o f F R h K- 4 c e l l s w a s c a r r

i

e d o ut a s d e s c r i b e d _p r e v i o u s _{l y}

(

S h a f f e r e t a l . 1 9 9 4

)

. Br i e f l y , p l a sm i d D N A w as

d i

ge s t e d w i t h _{S p h} l

(

p l a sm i d s c o n t a i n i n _g t h e H M 1 7 5

/

1 8 f 3 ' N T R s e _{g m}e n t

)

o r Ha e l l

(

_{p l} a sm i d s c o n t a i n i n_g t h e H M 1 7 5

/

_{p 3 5} 3 ' NTR s e _{g m}e n t

)

. S P 6 RN A _po _{l y m}e r a s e

(

Pr ome _ga

)

t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n a 2 0 _|i l vo l u me , w i t h 1 . 5

|

xg o f d i g e st e d D N A a n

d

1 . 2 5 mM r

i b

o n u c l e o s

i

de t r i p h o s p h a t e s , f o r 9 0 m i n a t 3 7 ° C . T h e qu a l i t y o f t he t r a ns c r

i

p t i o n p r odu c t s w as a s s e ss e d

b

_y el ec

t

r o_{p h}o r _{e s} i s o f s a _{m p l} e _p r odu ct i n 0 . 1 % s od

i

u m do d e c y l s u l f a t e

(

S D S

)

a _ga r o s e _ge l s . T he p r odu c t s o f t r an s c r i p t i o n r e a c t i o ns w i t h d i f f e r e n t c h i me r i c _{p l} a sm i ds c o n t a i n ed a_{p p} r o x i ma t e l y t h e s a me _qu an t i t y o f f u l l - l e n _{g t h} 7 . 5 k b R N A . T r a n s f e c t i o n s w e r e c a r r i e

d

o u t i n 6 0 mm d i ame t e r c e l l c u l t ur e d i sh e s c o nt a

i

n i n _g F R h K- _{4 c e l l mo n o l a} y e r s w h i ch w e r e a

_{p p}

r o x

i

ma

t

e

l y

8 0

%

c o n f l u e nt . Ce l l s w e r e w a sh e d t w i c e an d f e

d

w i t h 3 m l o f s e r u m- f r e e me _{d i u}m . T h e t r a n s c r

i

p t i o n r e a c t i o n m i x t ur e w a s a d d e d t o 3 0 _|al o f _{L i p} o f e c t i n

(

B e t h e sd a Re s e a r c h L ab o r a t o r

i

e s

)

,

d i

l u t e

d

t o 1 0 0

n

l a c co r d i n g t o t h e ma n u

f

a c

t

u r er ' s

i

n st r u c t

i

o n s , a n

d

a

d d

e

d

s

l

o w

l y

t

o t he c e l l s .

A f t e r o v e r n _{i g h t} i n c ub a t i o n , c u l t u r e s we r e f e d w i t h 3 m l me d i um c o n t a i n i n_g 2 0 % f e t a l b o v i n e s e r um , a n d i n c u ba t e d f o r a n o t h e r 2 4 h r . T he me d i um w as r ep l a c e d w i t h f r es

h

me

d i

um co n t a i n i n _g 2 % f e t a l b o v i n e s e r u m a nd _{p l} a c e d a t 3 5 . 5 ° C f o r 1 2 da _y s . V i r u s s t o c ks w e r e ha r v e s t e d 1 4 da _y s a f t e r t r a n s f e ct i o n b y me c ha n i c a l l y r emo v

i

n_g c e l l s i n t o 3 m l me d i um . T h e c e l l s u s_p e n s i o n w a s s u b

_j

e c t ed t o 3 f r e e z e - t h a w c _y c l e s , a b r i e f s o n i c a _{t i} on , a nd c l a r i f i c a t i o n b y l o w -s_p e e d c e n t r i f u _g a t i o n f o l l o w e d

b

_y a n e _qu a l vo l ume c h l o r o f o r m e x t r a c t i o n . A l i qu ot s o f v i r u s w e r e s _t o r e

d

a t - 7 0 °C. An al y s i s o f v i r a l r e_{p l i} c a t i o n ef f i c i e n c_y T h e e f f

i

c i en c _y o f v i r u s r e _{p l i} c a t i o n

i

n B S- _C- _{1 c e l l} s w a s as s e s s e d b y r ad i o i m mu n o f o c u s a s s a _y c a r r i e d o u t i n B S- _C- ₁ c e l l s

(

Le mo n e t a l . 1 9 8 3

)

. Br i e f l y _, v i r u s s t o c ks we r e

i

n o c u l a t e

d

o n t o 6 0 mm d i amet e r c e l l c u

l

t u r e

d i

s

h

e s co nt a i n i n _g n e a r l y c o n f l u en t ce l l mo no l a

_y

e r s . A f t e r 2 h o f v

i

r a

l

a

d

s or

_p

t i o n , c e l l s w e r e o v e r l a i d w

i

t h 5 m l me d

i

um c o nt a i n i n _g 0 . 5 % a ga r o s e a nd p l a c ed i n a 5 % C O 2 e n v i r o nme n t at 3 5 . 5 ° C f o r 1 t o 2 w e e k s

₍

d e_p e nd

i

n_g o n v i r a l _gr o w t h p r o _p e r _{t i} e s

₎

. T h e o v e r l ay w a s ge n t l y r emo v e

d

a nd t h e c e l l s w e r e f

i

x e

d

w

i

t h

8

0

%

a c e

t

o n e a n

d

st a

i

n e d w i t h r a d i o

i

o d i n a t e _d hioman _p o l yc l o n a l a n t i - HA V I _{g G}. Fo c i o f v i r a l r e p l i c a t i o n w e r e v i su a l i z e d b y a u t o r a d i o _gr a _{p h y} .

1

6

H A

V

p l a _q u e a s s a_y Th e cy t o _p a t h i c e f f e c t

(

CP E

)

o f s e l e c t e d ch i me r i c v i r u s e s w a s d emon s t r a t e d _{b y} c o n v e n t i o n a l _{p l} a _qu e a s s a _y

₍

Le mo n e t a _l . 1 9 9 1

)

. T he c o n d i t i o n s o f i n f e c t

i

o n w e r e t h e s ame a s f o r t he r a d i o i mmu n o f o c u s a s s a _y ex c e _{p t} t h a t t h e a _gar o s e o v e r

l

a _y c o n t a

i

n e d 2 5 mM _{M g C l 2} . Fo l l o w i n g i n c u b a t i o n a t 3 5 . 5 ° C f o r 6- ₈

_d

_a y s , a s e c o n d 0 . 5 % a g ar o s e o v e r l a y c o nt a

i

n

i

n g 2

5

mM _{M g C l 2} an d 0 . 0 1 3 % n e ut r al r e d w a s a d d e d . V i s i b l e p l a qu e s w e r e c o u n t e d 6 t o 2 4 h r l a t e r . An al

_y

s i s o f v i r i o n R N A s e _qu e n c e To c o n f i r m t h e i de n _{t i t y} o f s e l e c t e d r r

/

c_p e '_^ v i r u s e s _, v

i

r

i

o n R N A w a s s e_qu e n c e

d

i n t h e P I r e _{g i} o n u s

i

n _g a n an t

i

_ge n -ca_{p t} u r e R T

/

P C R me t h o

d

_, f o l l o _{w e}

d

b

_y

d i

r e c t s e _que n c i n _g o f P C R p r o du c t s

₍

J a n s en e t a i , 1 9 9 0

)

. T h e ab s e n c e o f H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s mu t a t i o ns w i t h i n t he s e _qu en c e d r e _{g i} o n c o n f i r me d t h a _t t he s e v i r us e s w e r e d e r i v e d f r om i n f e c t i o u s cD N A c o n st r u c t s . T he n e _ga t i v e s en s e _p r i me r u s e d f o r s e _qu e n c

i

n _g w a s S L A- _{1 7 7 1}

(

5 ' - _{A T C T G A C A A A TA G A A G C C A}- ₃ '

)

.

RES UL T S Mu t a t i o n s i n t he P2 r e_{g i} o n c o n t r i bu t e t o t h e r a_{p i d} r e_{p l i} c a t i o n o f H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s H M 1 7 5

/

1 8 f v

i

r u s i s o n e o f 3 r r

/

c_p e ' ^ _{v i r} u s es wh i c h w e r e c l o n a l l y s e l e c t e d f r o m a v i r u s s t o c k h a r v e s t e d f r om B S- C- 1 c e l l s w h i c h h a d b e e n _p e r s i s t e n t l y i n f e c t e d w i t h a c e l l -cu l t u r e a d a_{p t} e d H A V f o r a _p e r i o d o f a _{p p} r o x i ma t e l y o n e _ye a r

(

Le mo n e t a l . 1 9 9 1

)

. Th e s e 3 v i r u s e s c o n t a i n n ume r o u s mu t a t i o n s t h r o u _{g h}o u t t h e _ge n ome f r om t he v

i

r u s wh

i

c h i n i t i at e

d

t h e _p e r s

i

st e n t i n f e c t i o n . A l t h o u g h e ac h v i r u s h a s u n _{i q}u e mu t a t i o n s w i t h i n t h e PI an d t he P 3

(

3 C P^ °

)

_g e no m i c r e _{g i} o n s , t he y e a c h sh a r e c o mmo n mu t a t i o ns i n t h e 5 ' N T R, 3 ' N T R, P 2 a n d P 3

(

3 A a n

d

3 D Po l

)

r e g i o n s . T he p r e s e n ce o f i d e n t i c a l mu t a t i o n s i n t he s e s e _{g m}e n t s o f a l l 3 r r

/

c_p e '_^ ge n ome s s u _{g g}e s t s t ha t t h e s e m u t a t i o n s ma _y b e _p a r t i c u l a r l y

i

_{m p} o r t a n t f or t

h

e r a_p

i d

r e_{p l}

i

c a t

i

o n _{p h}e n o t y p e

(

L emo n e t a l . 1 9 9 1

)

. To t e s t t h i s h y p o t h e s i s a n d t o d e t e r m i n e w h i ch g e n o m

i

c r e _{g i} o n

(

s

)

c o n t r i bu t e t o t h e r e_{p l i} c a t i o n _{p h} e n o t y p e o f r r

/

c_p e ' ^ _{v i} r u s , 3 c h i me r i c ge nome -l e n _{g t h} c D N

A

c o n s t r uc t s w e r e c r e a t e d b y r e_{p l} a c i n _g t h e 5 ' NTR, P 2 o r P 3 r e g i o n s o f H A V

/

7 v i r u s

_{( p}

G 3

/

7 c l o n e

)

w i t h c D N A de r i v e

d

f r om H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s, a s sh o w n i n _{F i g} . 3 an d d e s c r i b e d i n Ma t e r

i

a l s a n

d

Me t h o d s . V i r u s s t o c ks w e r e _p r e_p a r e d 1 4 da _y s a f t e r t r a n s f e c t i o n o f F R h K- 4 c e

l l

s w

i

t h R N A t r a n s c r

i

b ed f r om t h e s e c o n s t r uc t s . T h e r e_{p l}

i

c a t i o n ca_p a c i t y o f t he s e v

i

r u s e s w a s sub s e _qu e n t l y e x a m i n e

d

i n r a

d

i o i mmu no f o c u s a s s a_y s c ar r i e d o u t

i

n B S- C- 1

1

8 c e

l

l s . Pr e v i o us s t u d i _{e s} h a v _{e s}h own t h _a t t h _e si _z e o f H A V r e _{p l i} c a t i o n f o c i i n r a d i o i mmu no f o c u s a s s a _y s c o r r e l a t e s w e l l w i t h v i r a l r e_{p l i} c a t i o n u nde r o n e - s t e _{p g} r ow t h c o n d i t i o n s

₍

Da _y e t ai . 1 9 9 2 ; S h a f f e r e t a l . 1 9 9 4

)

. On l

_y

v e r _y sma l l o r i n a _{p p} a r en t r e _{p l i} c a t i o n f o c i w e r e p r e s e nt i n r a d

i

o i mmu no f o c u s a s s a _ys h a r v es t e d 1 w e e k f o l l ow i n _g i n f e c t i o n o f B S- _C- ₁ c e l l s w i t h v i r u s r e s c u e d f r om t he _{p G 3}

/

7 d , p G 3

/

7 - ₅ ' . 1 8 f d a nd p G 3

/

7- P 3 . 1 8 f d R N

A

s

(

F i g . 4 A

)

. T he _gr o wt h ch a r a c t e r i st i c s o f _{t h} e s e v

i

r u s es w e r e co _{n s}i s t e nt w i t h t h e r e_{p l i} c a t i o n _p r o_p e r t i e s o f HA V

/

7 v i r u s i n BS- _C - ₁ c e

l

l s . I n c o n t r a s t , r e p l i ca t i o n f o c i ge n e r a t e d b y v i r us r e s c u e d f r o m _{p G 3}

/

7- _P

₂

. 1 8 f d we r e c o ns i de r ab l y l a r ge r , bu t o n l y i n t e r me d i a t e i n s i z e

b

e t w e e n H A V

/

7

(

p G 3

/

7 d

)

a n d H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s e s

₍

F_{i g} . 4 A

)

. I n r a d i o i mmu no f o c u s a s s a ys h ar v e s t e d a t 2 we e ks _po s t i n f e ct i o n , a l l o f t h e r e s c u e d v i r u s e s _g e n e r a t e d r e a _{d i l y} v i s i b l e r e_{p l i} c a t

i

o n f o c i

(

F i g . 4 B

)

. P

2

. 1 8 f vi r u s

(

" P 2 . 1 8 f " r e _p r e s en t s t he v i r u s r e s c ue d f r o m _{p G 3}

/

7 -P 2 . 1 8 f R N A

)

f o c

i

we r e mu c

h

l a r g e r t h a n t ho s e o f H A V

/

7 v i r u s , b ut s ma l l e r t ha n t h o s e o f H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s . 5' . 1 8 f an d P 3 . 1 8 f f o c i w e r e s

i

m

i

l a r t o t ho s e o f H A V

/

7 v i r u s . T hu s , t h e HM 1 7 5

/

1 8 f v

i

r u s mu t a t

i

o n s p r e s e n t

i

n t h e P 2 r eg

i

o n c o n t r i bu t e t o t he en ha n c ed r ep l i c a t i o n o f t h i s r r

/

c_p e '_^ v i r u s i n B S- C- 1 c e l l s ,

b

ut a r e n o t s u f f i c

i

e n t f o r c om p l e t e e x_p r e s s

i

o n o f t h i s _p

h

en o t y p e . Mu t a t

i

o n s

i

n t

h

e

5

' a n

d

P 3 s e _{g m}e n t s h a ve no i n de _p end en t e f f e c t o n v

i

r a l r e _{p l i} c a t i o n .

Co o_p e r at i v e a c t i o n o f mu t a t i o n s i n t he 2B a n d 2 C _p r ot ei n s A l t h o u _{g h} t h e V P 1

/

2 A c l e a va _ge s i t e o f H

A

V r ema i n s u n de f

i

ne d , ep i t o p e map p i n g s t ud i e s

(

L emo n e t a l . _, u n_p ub l i s h e d d a t a

)

s u_{g g}e s t t ha t RN A e n c od

i

n _g t he c a r b o x _{y l} t e r m i n u s o f VPl i s _p r e s e n t w i t h i n t h e Sa c I

/

E c o R I f r a _g

m

e nt u s e d t o r e_{p l} a c e t h e P 2 r e _{g i} o n o f H A V

/

7 w i t h t h a t o

f

t h e H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s

(

F_{i g} . 5

)

. B o t h o f t h e s e v i r u s e s c o nt a i n _a s i n_{g l} e mu t a t i on f r o m t he w i l d -t y p e _ge n o me i n t h i s r e _{g i} o n : a G

l

u t o Va l s u

b

s t i t ut i o n a t V P l r e s i du e 2 7 3 i n H A V

/

7 , a n

d

Se r t o Pr o a t VP l r e s i du e 2 7 1 i n HM 1 7 5

/

1 8 f

(

Ta b l e 1

₎

. Ho w e v e r , i t i s u nl i ke l y t h a t t h i s l a t t e r mu t a t i o n c o nt r i bu t e s t o t he r a_p

i

d r e _{p l}

i

c at

i

o n _{p h} e no _{t y p} e , b ec a u s e

i

t wa s n ot p r e sen t

i

n o t h e r r r

/

c_p e ^ v i r u s e s r e c o v e r e d f r o m t he _p e r s i s t en _{t l y} i n f e c t e _d B S- C- 1 c e l l s

(

Le mo n e t a i . 1 9 9 1

)

. T he l o c a t i o n o f t h e 2 A

_/

2 B c l e a v a _g e sh o w n i n _{F i g} . 5 d i f f e r s f r o m t h a t p r o_p o se

d

b

_y Coh e n e t al .

(

Co h e n e t a

l

. 1 9 8 7c

)

, a nd i s

b

a s e

d

o n r e c e n t i d e nt i f i c a t i o n o f t h i s c l e a v a_ge s

i

t e i n H A V p r o t e i n s e x_p r e s s e

d

b

_y r e c o m

b i

n a n t v a c c

i

n

i

a v

i

r u se s

i

n e u ca r _y o t i c c e l l s

(A

. Ma r t i n , N . Es c r i o u , S . -F . C h a o , M. G i r a r d , S . M . L emon , an d C . W yc ho w s k i , Ma n u s c r i p t su b m i t t ed f o r _p ub l i c a t i o n

)

. T h e r e a r e no mut a t

i

o n s

i

n t

h

e 2 A

p

r o t e i n o f t h e r r

/

c_p e^ H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s

(

F_{i g} . 5

)

. Th u s , t h e gr ow t h e nh a n ceme n t n o t e d w i t h P 2 . 1 8 f v i r u s i s mo s t l i ke l y du e t o mu t a t

i

o n s w

i

t h

i

n t h e 2 B an

d

2 C _p r o t e

i

n s . To

d

et e r m

i

n e

h

o w t

h

e s e t w o

_p

r o t e i n s co n t r i bu t e t o t h e e n h an ce d r e_{p l i} c a t i o n p h e n ot y p e o f t he P 2 . 1 8 f v

i

r u s _, a d d i t i o n a l co n s t r u c t s w e r e c r e a t e d w h i c h c o n t a i n e d o n _{l y} t h e 2 A B o r 2 C c o d

i

n

g

r e g i o n s o f

2 0 t he HM 1 7 5

/

1 8 f vi r u s w i t h i n t h e IIA V

/

7 b a c _{k g}r _{o u n d}

₍

_{p l} a sm i d s p G 3

/

7- 2 AB . 1 8 f d m _a n d p G 3

/

7 - 2 C . 1 8 f d m

)

(

F i g . 5

)

. T h e s e c o n s t r u c t i on s w e r e f a c i l i t a t e d b y c r e a t i o n o f a s i l e nt mu t a t i o n a t n t 4 0 2 2 , wh i ch es t a

b

l i s h e

d

a u n

i

qu e Ec oR V s

i

t e b e t w e e n t he 2B an d 2C c o d i n_g r e _{g i} o ns

(

s e e Ma t e r i a l s a nd Me t h o ds

)

. I n c o n t r a s t t o P 2 . 1 8 f v i r u s _, n o r a d i o i i t vm u no f o c i w e r e vi s i b l e 1 w e e k a f t e r i n f e c t i o n o f B S- C- 1 c e l l s w i t h vi r u s e s r e s c u e

d

f r om t h e s e _{c D}N As i n F R h K- ₄ c e l l s

(

da t a n ot sh own

)

. B _y 2 w e e k s a f t e r i n f e c t i o n , sma l l r ep l i c a t i o n f o c i w e r e a_{p p} a r e n t , a s sh o w n

i

n F i g . 5 . T h e s

i

ze o f t he r ep l i c a t i o n f o ci f o r me d

b

y 2 A B . 1 8 f v i r u s ap p r o x i ma t e d t ha t o f t h e H A V

/

7 p a r e n t v

i

r u s _, w h i l e 2 C . 1 8 f r e p l i c a t i o n f o c i a p pe a r e d t o b e s _{i g}n i f i ca n _{t l y} sma l l e r . To c on f i r m t h a t n e i t h e r t h e s i l e nt mu t a t i on a t n t 4 0 2 2 wh i c h c r e a t e _d t h e u n _{i q}u e £ c oR V s i t e u s e d f o r c o n s t r u c t i o n o f t h e s e c l o n e _s n o r a n a dv e nt i t i o u s s i l e n t mu t a t

i

o n at 3 8 9 9 i n t h e a_{m p}

l

i f

i

e d 2 B s e _qu e n c e o f H M 1 7 5

/

1 8 f

(

s e e Me t h o

d

s

₎

w e r _e r e spo n s

i

_{b l} e f o r t h e sma

l

l r e_{p l}

i

c at

i

o n f o c u s _{p h} e n o _{t y p} e s o f t he 2 A

B

. 1 8 f an d 2 C . 1 8 f v

i

r u s e s , t h e 5 ' a nd 3 ' p r o x i ma l h a l ve s o f t h e _{p G 3}

/

7- 2 A B . 1 8 f d m a n d p G 3

/

7 -2 C . 1 8 f d m ge n ome s we r e f u s e d a t t h e Ec o R V s i t e t o c r e a t e a n ew c h i me r a _{, p G 3}

_/

7- _{2AB C} . 1 8 f d m

(

F i g . 5

)

. T h i s co n st r u c t co n t a i n e

d

t h e e n t

i

r e P 2 r e _{g i o n} o f H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s an d w a s i d en t i c a l t o p G 3

/

7- P2 . 1 8 f d

(

F i g . 4

)

e x c e p t f o r t h e t w o si l e n t mu t a t i o n s . V i r u s r e s c ue d f r om p G 3

/

7 - _{2 A B C} . 1 8 f d m

d

emo n s t r at ed r a

_{p i d}

_gr ow t

h

i

n B S- C- 1 c e l l s w i t h r e_{p l i} c a t i o n

f o c i s _{i g}n i f i c a n t l y l a r _ge r t ha n HA V

/

7 v i r u s a n_d s i m i l a r _t o t h o s e o b s e r v e d a t 1 w e e k w i t h t h e P2 . 1 8 f v i r u s

(

F i g . 5

)

. T h i s r e s u

l

t s u _{g g}e s t s t h a t mu t a t

i

o n s

i

n t he 2 B a n d 2 C p r o t ei n s o f _{H M 1 7 5}

/

_{1 8 f} v i r u s a c t c oo _p e r a t i ve _{l y t} o e nh a nc e v i r a l r e _{p l i} c a t i o n i n B _S- _C- 1 c e l l s , a n d t h a t t h e s e p r o t e i n s r ema i n c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h e a c h o t h e r du r i n _g r e_{p l i} ca t i on o f t h e v i r u s

(

s e e D

i

s cu s s i o n

)

.

M

u t a t i o n s i n t h e 5 ' NTR a nd P 3 r e_{g i} o n s c o o_pe r a t e w i t h P2 r e_{g i} o n

m

u t a t i o ns t o f a c i l i t a t e r e_{p l i} c at i o n S i n c e t he s i z e o f t h e r e_{p l i} ca t i o n f o c i _ge n e r a t e d b y P 2 . 1 8 f v i r u s we r e sma l l e r t h a n t h o s e g en e r a t e d b y HM 1 7 5

/

1 8 f v i r u s

(

F i g . 4

)

_, i t s e eme d l i ke l y t ha t mu t a t i o n s i n o t h e r r e g i o n s o f t

h

e _gen ome mus t a l so c o n t r

i

b u t e t o t h e r a_{p i d} r e_{p l i} c a t i o n _{p h} en o t y p e .

A

l t ho u g h v i r u s e s w i t h ch i me r i c ge no me s c o n t a i n i n _g o n _{l y} t he 5 ' N T R o r P 3 s e _{g m}e nt s o f t he r r

/

c_p e^ H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s d i d n ot d emo n s t r at e en ha n c e d r e _{p l}

i

c a t i o n

(

F i g . 4 B

)

, i t r ema

i

n e

d

p o s s i b l e t h a t mu t a t i o n s i n t h e s e r e _{g i} o ns c o u l d e nh an c e v i r a l r e_{p l i} ca t i o n b

_y

c o op e r a t i n _g w

i

t h mu t at

i

o n s i n t h e P 2 o r o t he r r e _{g i} o n

₍

s

)

of t he _g en ome . T hu s _, a

d

d i t

i

o n a

l

c h

i

me r

i

c c o n s t r u c t s w e r e cr e a t e

d

wh

i

c h c o nt a i n t h e P 2 r e _{g i} o n mu t a t i o n s i n c o mb

i

n a t

i

o n w

i

t h mu t a t i o n s _p r e s e nt i n t h e 5 'N T R , P 3 , o r 3 ' NTR s e _{g m}e n t s o f t h e H M 1 7 5

/

1 8 f v

i

r u s _g e n ome

(

F

i

_g . 3

)

. A s

i

n t

h

e e x _p e r i me n t s d es c r i

b

e d ab o v e , v i r u s st o c ks we r e r e s c ue d f o l l o w i n _g R N A t r a ns f e c t i o n o f F R h K- 4 c e l l s a n d t he

2 2 r e_{p l i} c a t i o n c o m p e t e n c e o f e a c h - v i r u s w a s e v a l ua t ed b y r ad i o i mmu n o f o c u s a s s a _y i n B S- _C- ₁ c e l l s . Co n s t r u c t s _{p G 3}

/

7- 5 ' P 2 . 1 8 f d a n d p G 3

/

7 - 5 ' P 2- ₃ ' . 1 8 f

(

F i g . 3

)

w e r e c r e a t e d t o de t e r m i n e wh e t h e r mu t a t i o n s i n t h e no n c o d i n _g r e _{g i} o n s o f t h e ge n ome _p r omo t e v i r a l r e_{p l i} c a t i o n _{b y} a c t i n _g i n a c o o _pe r a t i v e f a sh i o n w i t h mut a t i o n s i n t he P 2 r e _{g i} o n . On e w e e k a f t e r i n f e c t

i

o n o f B S- C- 1 c e l l _s , 5 ' P 2 . 1 8 f a n

d

5 ' P 2- 3 ' . 1 8 f r ep l i c a t i o n f o c i w e r e _s i gn i f i ca n t l y l _{a r} g_{e r} t ha n P 2 . 1 8 f v i r u s f o c i _, bu t s t i l l s omew h at sma l l e r t h _an t ho s e _ge n e r a t e d

b

_y H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s

(

F i g . 6

)

. The 5 ' P 2 . 1 8 f a n

d

5 ' P 2- ₃ ' . 1 8 f r e p l i ca t i o n f o c i w e r e s

i

m

i

l a r

i

n s

i

z e . B e c a u s e t h e 5 ' N TR mut a t i o n s d i d n o t e n h an c e r e _{p l i} c at i o n o f t h e v i r u s i n t h e a b se nc e o f t he P 2 r e _{g i} o n mu t a t i on s

₍

F _{i g} . 4

)

, t h e s e r e su l t s i n d i c a t e t h a t mut a t

i

o n s

i

n t h e 5 ' N T R

(

bu t n o t t h e 3 ' N T R

)

o f H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s c o n t r i b u t e t o t h e r a _{p i d} r e_{p l}

i

ca t i o n _{p h} e n o t y p e b y a c t i n _g i n c o o _p e r a t

i

o n w i t h mu t a t i o n s i n t he P 2 r e _{g i} o n . To s i m i l a r l y e v a l u a t e t h e r o l e o f t h e P 3 r e g i o n mu t a t i o n s , w e c o n s t r u c t e d a c h i me r a c o n t a

i

n i n g b o t h t h e P 2 a n

d

P 3 s e _{g m}en t mu t a t

i

o n s o

f

H M 1 7 5

/

1 8

f

v

i

r u s

₍

_p

G 3

/

7 -P 2 -P 3 . 1 8 f d , F

i

g . 3

)

. T h e r e s u l t i n g P 2 P 3 . 1 8 f v i r us ge n e r a t e d r e_{p l}

i

c at i o n f o c

i

w h

i

ch we r e s u

b

s t a nt i a l

l

_y l a r _ge r t

h

a n P 2 . 1 8 f r e_{p l i} ca t i o n f o c i , bu t s t i l l sma l l e r t h a n t h o s e o f H M 1 7 5

/

1 8 f vi r u s 1 w e e k f o l l o w i n _g i n f e c t i o n o f B S- C- 1 c e l l s

(

F i g . 6

)

. T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t mu t at i o n s i n t h e P3 r e _{g i} o n a l s o a c t t o e n

h

a n c e v

i

r al r e_{p l}

i

c at

i

o n . Ho w e v e r , s

i

n c e t h e P 3 mu t a t i o n s b y t he ms e l ve s h a d n o e f f e ct o n v i r a l r e _{p l i} c a t

i

on

(

F i g . 4

)

, t h e y f a c i l

i

t a t e r e_{p l i} c at i o n o n _{l y} i n c o o _p e r a t

i

o n w i t h mu t a _t

i

o n s i n t h e P 2 r e

_g

i o n . I n c o n t r a s t t o t h e s e r e s u l t s , n o i n t e r a ct i o n w as n o t e d b e t we e n t h e 5 ' N T R a n d P3 r e _{g i} o n mu t a t i o n s . V i r u s r es c u _e d f r o m _p G 3

/

7- 5 ' P 3- ₃ ' . 1 8 f d i d n o t ge n e r a t e v i s i b l e r e p l i c a t i o n f o c i b y 1 w e e k a f t e r i n f e c t i o n

(

F i g . 4 A

)

_, w h

i

l e a t 2 w e e k s _, 5 ' P3- 3 ' . 1 8 f r _ep l i c at

i

o n f o c i w _e r e _s i m i l a r i n _s i _{z e} t o t h o _{s e} o f H A V

/

7

(

F i g . 4 B

)

. T hu _s , t h e c o mb i n a t i o n o f t he 5 ' NTR , 3 ' N TR a nd P 3 r e _{g i} o n mu t a t i on s d i d no t e n ha n c e t h e _g r ow t h o f HA V

/

7 vi r u s . Th e s e da t a f u r t h e r s up p or t t h e n ot i _o n t h_a t mu t a t i o n s i n t h e P2 r e _{g i} o n a r e n e c e s s ar _y f o r t he r a_{p i d} r e_{p l i} c a t i o n _{p h} e no t y p e . I n t he r a d i o i mmu n o f o c u s a s s a ys sh o w n i n _{F i g} . 6_, t h e r e w e r e n o d i f f e r e n c e s i n t h e s i z e s o f 5 ' P 2 . 1 8 f a n

d

5 ' _{P 2}- ₃ ' . 1 8 f r ep l i c a t i o n f o c i . T hu s , t he mu t a t i o n s i n t h e 3 ' N T R o f H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s do n ot a _{p p} e a r t o e nh a n c e r e_{p l i} c a t i o n . Mu t a t i o n s i n t h e 5 '_{N T R} , P 2 a nd P 3 r e g i o n s c o n f e r t he r ap i d r e_{p l i} c a t i o n _{p h} e n o _{t y p} e T h e d a t a _p r e s e n t e

d

a b o v e su

_g

_g e s t t h a t mu t a t

i

o n s

i

n t h e 5 ' N T R, P 2 a n d P 3 r e g i o n s o f t h e H M 1 7 5

/

1 8 f v i r u s ac t c o o p e r a t i v e l y t o f a c i l i t a t e r e_{p l i} ca t i o n o f t h e v i r u s . T h us , i n a n e f f o r t t o c o n s t r uc t a n i n f e c t i o u s c D N A c l o n e w i t h o p t i ma l r e_{p l i} c a t i o n _p r o _p e r t i e s , an d t o f u r t h e r e v a l u a t e t he po t e n t i a l r o l e o f t h e 3 'N T R mu t a t i o n s , t w o ad d i t i o n a l ch

i

me r i c p l a s m

i

d s w e r e c r e a t ed . p G 3

/

7 - ₅ ' P 2 P 3 . 1 8 f

d

c o n t a i n s t

h

e 5 ' N T R, P 2 a n

d

P 3 r e g i o n s o f t h e H M 1 7 5

/

1 8 f v

i

r u s

2 4 s e _que n c e , l e a v

i

ng E

A

V

/

1 v

i

r u s s e _qu en c e o n _{l y} i n t h e P I a n d 3 ' NT R s e _{g m}e n t s

₍

F i g . 3

)

. p G 3

/

7 - ₅ ' P 2 P 3- 3 ' . 1 8 f r e p r e s en t s t h e e n t i r e HM 1 7 5

/

1 8 f v i r u s s e _qu e nc e ex c e _{p t} f o r t he P I r e _{g i} o n w h

i

ch c or r e s_p o n

d

s t o H A V

/

7 . B y 1 w e e k a f t e r

i

n f e c t

i

o n o f B S- C- 1 c e l l s , v i r us e s r e s c u e d f r om b o t h o f t h e s e c o n s t r u ct s ge n e r a t e d v e r _y l a r _ge r e_{p l i} c a t i o n f o c i wh i c h a_{p p} r o x

i

ma t e d t h e s

i

z e o f t h e H M 1 7

5

/

1 8 f f o c

i

₍

F

i

_g . 7

)

. V i r u s e s r e s c u e d f r om t h e s e t wo c o n s t r u c t s t hu s a _{p p} e a r t o h a v e t h e s ame _gr o w t h c ha r a c t e r i s t i c s a s t h e HM 1 7 5

/

1 8 f v i r u s . The s i z e o f t h _e r e_{p l i} c a t i o n f o c i w a s no t i n f l u en c e

d

b y t he _p r e s e nc e o r ab se n c e o f t he 3 'N T R mu t a t i o n s f o u nd i n H M 1 7 5

/

1 8

f

v i r u s _, c on s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t s o f e a r l i e r e x _p e r i me n t s w h i c h s u _{g g} e s t e d t h a t t he mut a t i o n s i n t h e 3 ' N T R do n o t e n h a n c e v i r a l r e _{p l i} c a t i o n

(

F i g . 6

)

. To c o n f i r m t ha _{t t h}e s e r a _{p i d l y} r e_{p l i} c a t i n _g v i r us e s w e r e

i

n f a c t

d

e r

i

v e d f r om

i

n f ec t

i

o u s c D N A a n

d

n o t s

i

m p l y H M 1 7 5

/

1 8

f

v

i

r u s c o n t am

i

n an t s , p a r t

i

a l P I s e g me nt R N A s e _qu en c e s o f t h e P 2 P 3 . 1 8 f _, 5 ' P 2 P 3 . 1 8 f a nd 5 ' P 2 P 3- ₃ ' . 1 8 f v i r u s e s w e r e de t e r m

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