Localisation aberrante de la connexine 43 dans le cancer du testicule

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I

~ CANCER DU TESTICULE Andrologie (2001), 11, n ~ 2, 56-62

L o c a l i s a t i o n a b e r r a n t e d e la c o n n e x i n e

43 d a n s le c a n c e r d u t e s t i c u l e .

C. ROGER1, B. MOGRABI1, D. CHEVALLIER1, J. MICHIELS2, D.

S E G R E T A I N 1 ,

G. P O I N T I S 1 , P. F]~NICHEL1

I I N S E R M E M I 00-09, IFR 50, Facultd de Mddecine, 2Laboratoire d'Anatomo-pathologie, H6pital de L'Archet, Nice

RESUME

I. I N T R O D U C T I O N

La c o m m u n i c a t i o n i n t e r c e l l u l a i r e via les j o n c t i o n s gap (GJIC, p o u r ~ Gap J o n c t i o n I n t e r c e l l u l a r C o m m u n i c a t i o n -) est u n mode u b i q u i t a i r e de dialogue e n t r e les cellules. Il p a r t i c i p e a u contr61e de la prolif6ration cel- l u l a i r e . Des t r o u b l e s de l ' e x p r e s s i o n des connexines (Cx), les prot6ines t r a n s m e m b r a - n a i r e s constitutives de ces c a n a u x intercellulaires, ont souvent 6t6 associ6s au p h 6 n o t y p e malin. Dans le tube s6minif6re, la Cx43 est exprim6e m a j o r i t a i r e m e n t p a r les cellules de Sertoli et les cellules g e r m i n a l e s basales. L'expression de la Cx43 a 6t6 6tudi6e dans u n e s6rie de 4 c a n c e r s du testicule compre- n a n t u n e prolif6ration s 6 m i n o m a t e u s e exclu- sive, ~ u n stade T1-2 NO M0. Les t r a n s c r i t s et

la

prot6ine analys6s p a r RT-PCR et Western blot, ont 6t6 retrouv6s dans t o u s l e s cas, h la taille a t t e n d u e . La p r o t 6 i n e 6tudi6e p a r i m m u n o f l u o r e s c e n c e i n d i r e c t e 6tait d61ocali- s6e au sein d u cytoplasme, n o n exprim6e ~ la m e m b r a n e , e x c l u a n t sa p a r t i c i p a t i o n ~ u n e 6ventuelle GJIC. La signification de cette localisation a b e r r a n t e de la Cx43 est discut6e dans le c a d r e des relations GJIC/tumorigen6- s e .

Dans la plupart des esp~ces et quelque soit l'organe, les cellules orient6es vers la m6me fonction, sont capables de coordonner leur action, en 6changeant des informations via des jonctions communicantes ou ~, jonctions gap ,. Ces s t r u c t u r e s m e m b r a n a i r e s sp6cialis6es, p e r m e t t e n t le passage direct, de cytoplasme cytoplasme, de mol6cules de signalisation de faible poids mol6culaire (<lkDa), telles que le calcium, I'AMP cyclique, le GMP cyclique ou l'IP3, connues pour participer au contrSle du cycle cellulaire. La communication jonctionnelle intercellulaire par gap (GJIC, pour - Gap Jonction intercellular Communication , ) j o u e ainsi u n r61e de synchronisation particuli~re- m e n t important au sein du myocarde, du myo- mbtre, du systbme nerveux central ou des glandes endocrines. Elle intervient 6galement dans le contr61e de la croissance et de la diff6- rentiation cellulaires. Des perturbations de cette communication ont souvent 6t6 retrou- v6es dans les processus de prolif6ration maligne [9, 34].

Mots cl$s : cancer testiculaire, sdminome, commu- nication jonctionnelle intercellulaire par gap, sup-

presseur tumoral, connexine 43. Correspondance : P. Fdnichel, I N S E R M EM1 00-09,

IFR 50, Facultd de Mgdecine, 28 avenue de Valombrose , 06107 Nice Cedex 2

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II. COMMUNICATION JONCTIONNELLE INTERCELLULAIRE PAR GAP ET

CONNEXINES

Les jonctions communicantes 6tablissent de v6ritables canaux intercellulaires regroup6s sous forme de plaques jonctionnelles membranaires. La jonction gap est form6e par le cou- plage de deux h6mi-canaux, ou connexons, situ6s de part et d'autre des deux membranes. Les connexons sont compos6s de six connexines (Cx) identiques ou diff6rentes for- m a n t ainsi un homo- ou h6t6ro-hexam6re. Selon la composition du connexon en Cx, la perm6abilit6 du canal peut varier. Les Cx repr6sentent une famille de plus de quinze pro- t6ines t r a n s m e m b r a n a i r e s cod6es p a r des g6nes diff6rents [4] et caract6ris6es par leurs poids mol6culaires (Cx43, Cx de 43kDa). Une Cx est compos6e de quatre domaines trans- membranaires, deux boucles extracellulaires et une boucle intracellulaire et des domaines amino- et carboxy-terminaux intracytoplasmiques (Figure 1). L'extr6mit6 C-terminale poss6de des sites de phosphorylation qui sont impliqu6s dans l'ouverture ou la fermeture rapide du canal par l'interm6diaire de kinases [18, 19].

Les Cx pr6sentent une r6gulation tissu-speci- fique. La Cx43 est exprim6e ubiquitairement et est la repr6sentante de cette famille, la plus 6tudi6e h ce jour. Elle joue un r61e essentiel, en particulier, au niveau du myocarde comme le d6montrent les troubles h la naissance des souris knock-out Cx43-/-, qui meurent de malfor- mations cardiaques [27]. Elle est exprim6e 6galement au niveau du foie [3], du follicule ovarien [8], du myom6tre off, sous l'effet des estrog6nes, elle coordonne les contractions ut6- rines. De plus, elle est majoritairement expri- m6e dans le testicule de rongeur [28, 1] et le testicule humain [32].

III. COMMUNICATION JONCTIONNEL. LE INTERCELLULAIRE PAR GAP

ET CANCER

Des perturbations de la communication jonctionnelle ont souvent 6t6 observ6es au sein de

cellules transform6es ou canc6reuses, entre elles, ou avec les cellules saines avoisinantes [9, 21, 5]. Ces troubles de la GJIC peuvent 6tre lids soit h une alt4ration de l'expression du g6ne de certaines Cx, soit h des modifications post-traductionnelles, comme des anomalies de l'6tat de phosphorylation [11, 29], ou des troubles du trafic des Cx qui ne sont alors plus localis6es ~ la membrane mais d61ocalis6es dans le cytoplasme [16]. Diff6rents promoteurs tumoraux comme le TPA sont capables d'indui- re 6galement ces anomalies [17, 26]. Les Cx sont aussi les cibles potentielles de diff6rents oncog6nes (src, ras, gay, neu) conduisant h la fermeture des canaux par hyperphosphoryla- tion du domaine C-terminal [13, 14]. P a r ailleurs, dans les diff6rents mod61es cellulaires malins off une anomalie de la GJ]C a 6t6 mise en 6vidence, la r6expression voire la surexpression de certaines Cx par t r a n s f e r t de g~nes, conduit soit h u n ralentissement soit une normalisation de la prolif6ration cellulaire in vitro [30] et in vivo [9]. Ces observations sugg6rent que les Cx peuvent ~tre consid6r6es comme de v6ritables suppresseurs tumoraux [22].

IV. LA SPERMATOGENESE, U N P R O C E S S U S CONTROLI~

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Domaine extracellulaire

Connexine

Connexine

Domaine

transmembranaire

N-ter Domaine

intracellulaire

phosphorylation

C-ter

Connexon

Membrane A

Espace intercelhflaire

Membrane B

Connexon

Jonction Gap

Figure 1 : Reprdsentation des connexines et de la jonction Gap.

m6iose, par l'interm~diaire des Cx 43 et 37 exprim6es au niveau des cellules de la granu- losa ~quivalentes des cellules de Sertoli, et de l'ovocyte [30, 22]. De plus, l'observation des tubes s~minif~res de souris transg~niques homozygotes mfiles, pour lesquelles la r~gion codante de la Cx43 a 6t~ remplac~e respective- ment par les r~gions codantes de la Cx32 et la Cx40, a permis de constater une alt6ration de la spermatogen~se identique au syndrome des cellules de Sertoli isol6es [25]. L'ensemble de ces donn~es tendent ~ d6montrer le r61e pri- mordial de la Cx43 dans les processus de d6ve- loppement des cellules germinales, aussi bien chez le mille que chez la femelle.

A c e jour, cinq Cx ont ~t6 caract~ris~es dans le testicule de rongeur (Cx 26, 32, 33, 37 et 43). La Cx43 est la plus repr~sent6e ; elle est pr6- sente ~ la fois dans le compartiment intersti- tiel au niveau des cellules de Leydig et dans le tube s~minif'ere au niveau des cellules de Sertoli et des cellules germinales basales, sper-

matogonies et spermatocytes de premier ordre [2]. Elle est exprim~e ~ l'identique dans le testicule h u m a i n normal [Defamie et coll., soumis pour publication]. Son expression varie au cours des stades de la spermatogen~se [2] et des anomalies ont 6t6 retrouv~es en cas d'alt~- rations de la spermatogen~se [1, 2].

V. E X P R E S S I O N D E L A C X 4 3 D A N S LE S E M I N O M E H U M A I N

Le cancer du testicule repr6sente le cancer le plus fr6quent de l'adulte jeune. En Europe, son incidence augmente de 2% par an (rapport du minist~re danois de l'environnement et de l'~nergie, Miljoprojekt 1995, NR290). 90% des cancers du testicule sont des s6minomes dont on distingue la forme pure (50 %). I1 s'agit alors d'une proliferation anarchique des seules cellules germinales indiff~renci~es.

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nous a amen6 ~ 6mettre l'hypoth6se qu'une perte partielle du contr61e sertolien de la sper- matogen6se via une alt6ration de la GJIC 6ta- blie entre Sertoli/germinale, pourrait ~tre l'origine, participer ou 5tre associ6e au processus de prolif6ration s6minomateuse.

Nous avons donc 6tudi6 l'6tat de la GJIC et plus particuli~rement l'expression de la Cx43 dans 4 s6minomes purs pr61ev6s chez des adultes jeunes ne pr6sentant pas d'invasion m6tastatique. A partir de tissus s6minoma- teux, congel4s ~ l'6tat frais, nous avons confir- m6 par RT-PCR, dans tous les cas, la pr6sence de transcrits de la Cx43 humaine, ~t la taille attendue de 1157 pb (Figure 2). L'analyse par Western-Blot, a r6v616 la pr6sence de la prot6i- ne ~ un poids mol6culaire de 43kDa et de ses diff4rentes formes phosphoryI6es (Figure 3). Par contre, par immunofluorescence indirecte, la prot6ine a 6t4 localis6e dans le cytoplasme et aucun signal n'a 6t6 retrouv6 au niveau membranaire (Figure 4). Afin de pr6ciser le trouble du trafic intracellulaire impliqu4 dans cette d61ocalisation (exocytose, endocytose, d6grada- tion), la co-localisation de la Cx43 avec des m a r q u e u r s des diff6rents c o m p a r t i m e n t s intracytoplasmiques, est a c t u e l l e m e n t en cours.

La Cx43 est donc exprim6e dans le s6minome aussi bien en terme de transcrits que de pro- t6ine, mais sa localisation est intracytoplas- mique et non membranaire, excluant donc sa participation ~ une GJIC fonctionnelle. Cette observation soul~ve au moins deux questions : quels sont les m6canismes de cette d61ocalisa- tion et est-elle la cons6quence de l'6tat trans- form6 de la cellule ? le trouble de l'adressage de la prot6ine ~ la membrane participe-t-il au processus n6oplasique ?

Le tableau 1 rapporte les cancers pour lesquels une anomalie d'expression de la Cx43 a 6t6 raise en 6vidence. Dans certains mod61es, on observe une inhibition partielle de la trans- cription, des modifications de l'6tat de phos-

phorylation de la prot6ine ou une d61ocalisa- tion de celle-ci. Une localisation aberrante a 6galement 6t6 caract6ris4e pour d'autres Cx dans des cellules tumorales [12].

I1 est possible d'envisager une mutation soma- tique portant sur une partie du g6ne codant pour un domaine impliqu6 dans l'adressage de la prot6ine ~ la membrane comme rapport6 par Krutovskikh [16]. Cependant, l'association Cancer/mutation des Cx de semble rare.

Une autre hypoth6se concernant cette d61ocali- sation cytoplasmique pourrait ~tre la pr6sence d'anomalies portant sur les prot6ines associ6es au transport membranaire. I1 est possible que certaines prot6ines, d6crites pour ~tre asso- ci6es ou participant au transport membranaire des Cx (Zonula Occludens 1, N-cadherine) [33 ;7], soient ici non exprim6es ou anormales. De plus, les diff6rents 6tats de phosphorylation des Cx observ6s dans les processus malins, pourraient 6tre /t l'origine d'une modification de leur conformation emp~chant ainsi toute liaison avec ces prot6ines associ6es.

Quant ~ la participation de la Cx43 en t a n t que facteur suppresseur tumoral, diff6rents tra- vaux sur des mod61es malins ont montr6 l'effet du r6tablissement de l'expression de la Cx43 et de la GJIC, sur la r4duction de la prolif6ration cellulaire [35]. Le r6tablissement de la GJIC, via la surexpression de la Cx43, jouerait un r61e direct sur le contr61e des diff6rentes phases du cycle cellulaire en modulant l'expression des cyclines A, D1 et D2 [15, 6].

(5)

Sl

$3

F i g u r e 2 : A n a l y s e d e l'expression d e l a Cx 43 p a r R T - P C R d a n s le t e s t i c u l e h u m a i n e t d a n s 4 s ~ m i n o m e s h u m a i n s . C t r l : t e s t i c u l e h u m a i n ( 1 1 5 7 p b ) ; $ 1 - $ 4 : s ~ m i n o m e congel~ ~ l'~tat frais.

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F i g u r e 3 : A n a l y s e d e l a Cx 43 p a r Western B l o t d a n s le t e s t i c u l e h u m a i n e t d a n s le s~minome. D ~ p S t d e 15~ ~ g d e p r o t ~ i n e s . C t r l : Testicule h u m a i n ; S : S~minome. PO : f o r m e n o n - p h o s p h o r y l ~ e d e l a Cx 43. P 1 - P 2 : f o r m e s p h o s p h o r y l ~ e s d e l a Cx 43.

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orgalle cerveau sein prostate enCk:~tetre humain

ov3ire humain

tiasu ou li~n~e

C6 glioma cell

normal

carcinoma

normal

P C 3 LNCaP TSU-RI ALVA-31 normal FEEC HEC.1A RL-95-2. HOSE (normal) CaOV-3 OVCAR-3 SK-OV-3 SW626 ARN

faible mveau d'ARNm de la Cx43

exprim~

non expnrrm

present nd nd prOsent pr6sent present present

forte expression

pr6sente

presente

non presente

3 formes phosphoryk~es

non presente non presente forme non phosphoryl~e forme non phosphoryl~e 3 formes phosphoryk~s forme non phosphoryk~

non presente non presente

nd nd nd nd nd Iocalisation membrane membrane membmne nd nd nd nd fonctior~lite faible fonclionneUe fonctionnelle nd

non fonctionnelle

nd nd

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cellule normal nd nd nd nd

9erminale s(~linome p~sent pr6sente c~oplasrnique non fonctionnelle

T a b l e a u 1 : A n o m a l i e s d e l a Cx 43 d a n s les c a n c e r s . L e s d o n n $ e s c o n c e r n a n t les c e l l u l e s g e r m i n a l e s e t s ~ m i n o m a t e u s e s s o n t p r $ s e n t d e s d a n s ce t r a v a i l ( I N S E R M E M I 00-09).

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A B S T R A C T

A b e r r a n t l o c a l i z a t i o n o f c o n n e x i n 43 in testi- c u l a r c a n c e r

R O G E R C., M O G R A B I B, C H E V A L L I E R D, M I C H I E L S JF, S E G R E T A I N D, P O I N T I S G,

F E N I C H E L P

Most cells c a n c o m m u n i c a t e d i r e c t l y v i a g a p j u n c t i o n c h a n n e l s . Gap j u n c t i o n i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n (GJIC) p a r t i c i p a t e s i n t h e c o n t r o l of cell p r o l i f e r a t i o n . A b n o r m a l e x p r e s - s i o n o f c o n n e x i n s (Cx), t h e c o n s t i t u t i v e pro- t e i n s of g a p j u n c t i o n s , h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h a t r a n s f o r m e d p h e n o t y p e . In t h e s e m i n i - f e r o u s t u b u l e s , c o n n e x i n Cx43 is p r e d o m i - n a n t l y e x p r e s s e d b y Sertoli cell a n d g e r m i n a l cell m e m b r a n e s . We s t u d i e d Cx43 e x p r e s s i o n in f o u r t e s t i c u l a r c a n c e r s (pure s e m i n o m a ) . Cx43 m R N A a n d p r o t e i n c h a r a c t e r i z e d b y RT P C R a n d Western blot w e r e f o u n d to be simi- lar to c o n t r o l s ( n o r m a l testes) in e a c h case. H o w e v e r , i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t u d y o f Cx43 p r o t e i n i n d i c a t e d a c y t o p l a s m i c l o c a l i z a t i o n w i t h no m e m b r a n e e x p r e s s i o n , e x c l u d i n g t h e p a r t i c i p a t i o n o f Cx43 in GJIC. T h e s i g n i f i c a n - ce of t h i s a b e r r a n t l o c a l i z a t i o n w i l l b e d i s c u s - s e d in r e l a t i o n to c a r c i n o g e n e s i s .