* :لوئسم هدنسیون نارهت -قحت زکرم ی تاق می بورک سانش ی تسنا ی وت ا روتساپ ی نار -رتکاب هورگ ی سانش ی -:نفلت 66405535 -021 ، E-mail: [email protected]
زاس هناسمه
ی
،
هب
ی
هن
زاس
ی
ارش
ی
ط
ب
ی
نا
لخت و
ی
ص
مد
ی
ن
لاتاک
ی
کت
ی
سکوت
ی
ن
ندآ
ی
تلا
س
ی
زلاک
سوترپ لاتدروب
ی
س
زا
ی
ک
وس
ی
ه
موب
ی
ا
ی
نار
ناه
ی
ه
مشاه
ی
هزج
1هف ،
ی
هم
نابغاب
ی
نارآ
ی
2تسمداب دازرف ،
ی
3غارچهاش هتشرف ،
ی
3 * 1 م هورگ ی بورک ی ژولو ی ، ملاسا دازآ هاگشناد ی ، مارو دحاو ی ن پ ی اوش مارو ، ی ،ن ا ی ؛نار 2 تنژ هورگ ی ک ب و ی ژولونکتو ی ، ملاسا دازآ هاگشناد ی ، مارو دحاو ی ن پ ی ،اوش مارو ی ،ن ا ی ؛نار 3 رتکاب هورگ ی سانش ی ، زکرم قحت ی تاق می بورک سانش ی تسنا ی وت ا روتساپ ی ،نار ا ،نارهت ی نار . :تفایرد خیرات 21 / 12 / 93 خیرات شریذپ : 4 / 7 / 94 :همدقم هفرس هایس (Pertussis, Whooping cough)کی کی نآ لماع هک تسا یسفنت ًارصحنم یرامیب نودب ،یریمخت ریغ ،یزاوه ،یفنم مرگ ،لیسابوکوک مان هب روپسا سیسوترپ لاتدروب (Bordetella pertussis) یم دشاب ( 1 ، 2 ) لاس رد یرتکاب نیا . 1906 طسوت ، ت ناسنا و دش ییاسانش وکناژ و تدروب یعیبط نابزیم اهن تسا نآ ( 3 ). یرامیب نیا هدش رشتنم ناهج مامت رد هک رد کی اب و کیمدنا یرامیب کی مکارتم یاه تیعمج لکیس 5 -3 دشاب یم زین کیمدیپا تروص هب لاس ؛ نینچمه اب یریگشیپ لباق یاه یرامیب زج هفرس هایس هکنیا دوجو اب هج تشادهب نامزاس تاشرازگ یط ،دشاب یم نسکاو ینا لاس رد 2003 ، 17 رسارس رد هفرس هایس هب لاتبا دروم نویلیم دیدرگ شرازگ ناهج ه دادعت نیا زا هک 279000 نآ دروم ثعاب ریم و گرم تسا هدش ( 4 ، 5 .) :هدیکچ
:فده و هنيمز
زلاکيس تلايندآ نيسکوت ( Adenylate cyclas Toxin= ACT ) ی سنلاوریو یاه روتکاف زا یک اب یروزيلاتاک نيمد کی یاراد هک تسا سيسوترپ لاتدروب کينژونومیا و یحشرت 400 ديسا آ مان هب ،هنيم AC رد ، هيحان N -یم دوخ لانيمرت تشگزاب لباق ريغ کیرحت اب نيمد نیا .دشاب cAMP یمهم شقن تویراکوی لولس رد ک یم افیا هفرس هايس یراميب داجیا رد یاهوراد رد و هدوب یلولس یسانش تسیز رازبا کی ناونع هب و دن یناطرس دض زين تسا هتفرگ رارق هدافتسا دروم ؛ اذل زا فده نیا ،هعلاطم هب یبايتسد نايب زا ییلااب حان هي AC هب روظنم تهج رد نآ کينژ یتنآ صاوخ یسررب رد نآ زا هدافتسا يهت ای و تنوجدا ،نسکاو ی ه یاه تيک صيخشت یم ی دشاب .:یسررب شور
هعطق ،یبرجت هعلاطم نیا رد AC ، شنکاو طسوت PCR ريثکت و روتکو رد pET28a و نولک رد یرتکاب E.coli BL21(DE3) ، و نايب ،نايب طیارش یزاس هنيهب زا سپ زيلانآ نيئتورپ لژ طسوت SDS PAGE و ماجنا تلاب نرتسو سپس و صيلخت نآ یور رب یفارگوتامورک نوتس (NI-NTA) .تفریذپ تروص:اه هتفای
هعطق AC ینايب روتکو رد تيقفوم اب pET28a طسوت هدنوش اقلا ینايب متسيس تحت و هدش نولک IPTG تظلغ اب 5 / 0 زا سپ ،رلاوم یليم 4 یامد رد تعاس 37 یهدزاب اب نايب رثکادح تيلباق دناوت یم هجرد 25 رتيل رب مرگ یليم و صولخ 95 .دشاب هتشاد ار %ن
:یريگ هجيت
اهنت یاقلا اب داد ناشن هعلاطم نیا 5 / 0 رلاوم یليم IPTG یروزيلاتاک نيمد یلااب نايب ناوت یم ، نيئتورپ ACT ، و یقيقحت یاهدربراک رثکا یارب نازيم نیا هک دوب اراد ار صولخ نازيم رثکادح اب یصيخشت تسا بسانم . و هژا یاه :یديلک هنيهب ،یزاس هناسمه مد ،نايب یزاس سيسوترپ لاتدروب ،زلاکيس تلايندآ یکيتيلاتاک ني .یکی سنلاوریو یاهروتکاف زا و یرورض زئاح تیمها لاتدروب سیسوترپ ، یسکوت ن تلایندآ زلاکیس ( ACT ) تسا هک طسوت راب نیلوا Confer و Eaton هب یحشرت مس ناونع یرتکاب نیا دش هتخانش ( 6 نیا .) یلوکلوم نزو اب نیسکوت KDa 200 کی یاراد ، ریجنز ی ه یدیتپپ یلپ 1706 هک تسا یدیسا ونیمآ مان هب یروزیلاتاک هیحان کی زا لکشتم AC اب ، 400 تمسق رد دیسا ونیمآ N -یحان کی و لانیمرت ی ه نیزیلومه صخشم RTX اب 1306 تمسق رد دیسا ونیمآ C هب یروزیلاتاک شخب دورو هک دشاب یم لانیمرت دنک یم لیهست ار لولس لخاد ( 7 ) یحان . ی ه یروزیلاتاک لماش دوخ 2 شخب :تسا شخب KDa 18 لماش ، هنیمآ دیسا 224 -1 شیازفا لوئسم و cAMP و لولس شخب کی KDa 25 هنیمآ دیسا لماش ، 399 -225 هک اک هب لاصتا لوئسم نیلودومل نابزیم لولس دشاب یم نیا . شتیلاعف یارب هک نیلودوملاک هب لاصتا زا سپ هیحان ریغ لیدبت ثعاب دوخ یمیزنآ تیلاعف اب ،تسا یرورض تشگزاب لباق ATP هب cAMP ( دوش یم 2 ، 8 ) ؛ نینچمه ناملپمک هطساو اب زوتیسوگاف راهم ثعاب نیئتورپ نیا داجیا رد یمهم شقن ور نیا زا و هدش هفرس هایس یرامیب ( دراد 9 .) ACT ، سیزوتپوپآ یاقلا لیلد هب تیلاعف اب هک نیمد AC رد یمهم یدربراک شقن ،دریگ یم تروص یناطرس دض یاهوراد کیتوتپوپآ تارثا شیازفا ( دراد فلتخم 12 -10 نیمد نیا .) ناونع هب دناوت یم رارق هدافتسا دروم زین یلولس یسانش تسیز رازبا کی ب ،دریگب یاه نیئتورپ هب ندش ژویف اب هک بیترت نیا ه هب یرتکاب زا نیئتورپ لاقتنا ثعاب دناوت یم رگید رگشرازگ کی ناونع هبو هدش تویراکوی یاه لولس ( دنک شقن یافیا یباختنا 13 ) . ACT ینیئتورپ ًاریخا یگژیو نیا نتشاد لیلد هب و تسا کینژونومیا هب ینامرد نسکاو یازجا زا یکی ناونع رد ،لاکیورس زاف رد و هتفرگ رارق هدافتسا دروم نژاو یاهروموت نامرد دشاب یم ینیلاب ییامزآ تسار لوا ( 14 ) ؛ هب نینچمه ًاریخا لااب یتنوجدا صاوخ لیلد زا هدافتسا هب ،روتکاف نیا و هفرس هایس رلاولسآ نسکاو تخاس رد دیدناک ناونع ( تسا هدش حرطم رگید یاه یرامیب نینچمه 15 ) زا . یفرط تیریدم زکرم زا هدش هئارا تاشرازگ ساسا رب ششوپ دوجو اب یرامیب نازیم رامآ ناریا رد اه یرامیب دودح ،نویسانیسکاو 99 % شیازفا ریخا یاه لاس رد دوجو ای اه نسکاو یتیفیک یب زا یشان دناوت یم هک هتفای دشاب مسیفروم یلپ یاه شوس ( 16 .) ور نیا زا رد هک روط نامه ، دش هراشا لااب ، رد زلاکیس تلایندآ یکیتیلاتاک نیمد شقن لیلد هب رد ،یکشزپ رد نآ یدربراک شقن و ییاز یرامیب لاس هیحان نیا هعلاطم تهج ار نادنمشناد هجوت ریخا یاه تسا هدرک بلج دوخ هب نآ نایب و گنینولک و ( 17 ، 18 ) ، یا نایب طیارش یزاس هنیهب رب ینبم یشرازگ نونکات یلو ن و ناریا رد نیمد اهنت .تسا هتفرگن تروص اهروشک ریاس زا هک بیکرتون نیسکوت سیسوترپ دیلوت طیارش رگید سیسوترپ لاتدروب تیمها زئاح و سنلاوریو یاهروتکاف ،هفرس هایس رلاولسآ نسکاو رد هدافتسا تهج ،دشاب یم ( تسا هدش یزاس هنیهب ناریا رد 19 ) ، اذل فده ماجنا زا نیا هعلاطم جارختسا هعطق AC نژ ACT زا کی یوس ی ه و بسانم روتکو رد نآ نولک و ناریا یموب یزاس هنیهب روظنم هب یرتکاب رد نایب رثکادح هب یسرتسد تهج ،نایب ،یرت عیسو یاه حرط رد نآ زا هدافتسا دیلوت تهج رد نآ کینژ یتنآ صاوخ یسررب نوچمه ی و تنوجدا ناونع هب نآ رثا یسررب ،نسکاو یهت ا ی ه ینامز عوضوم نیا تیمها .دشاب یم یصیخشت یاه تیک رب نسکاو هیهت میوش روآدای هک دوش یم رت صخشم یوس هیلع ی ه عونت رطاخ هب مسیناگراورکیم نیا یموب رتلااب ییاراک یاراد ،فلتخم قطانم رد هیوس نیا یکیتنژ .دوب دهاوخ یناریا تیعمج رد شور یسررب : علاطم کی قیقحت نیا ادتبا .دشاب یم یبرجت ه جارختسا و یرتکاب تشک تهج DNA ،یموزومورک هیوس عیاش سیسوترپ لاتدروب زا سپ هک ناریا رد هفرس هایس هب کوکشم نارامیب سکنرافوزان زا یریگ هنومن تاشیامزآ سپس و تشک و یزیمآ گنر اب و دش هیهت
رد و هروا ،تکرح ،تارتیس لیبق زا یلیمکت تیاهن نیتولگآ رد سیسوترپ لاتدروب یاه مرس یتنآ طسوت نویسا وتیتسنا روتساپ ناریا ت أ دیی دش ، باختنا دیدرگ و هریخذ زا رد یرتکاب طیحم یلورسیلگ رد طیحم ناگر ول ( Difco ) تشک هداد دش ( 16 ). طیحم هب تدم 72 تعاس رد یامد 37 هجرد هبوکنا رد( دیدرگ مامت لحارم یوس ه سیسوترپ لاتدروب (B.pertussis ATCC 9797) هیهت هدش زا روتساپوتیتسنا ،ناریا شخب بورکیم یسانش هب ناونع هیوس لرتنک تبثم رد رظن هتفرگ )دش ؛ هب سپس زیل روظنم یرتکاب رفاب رد نآ نویسناپسوس ، PBS) = (Phosphate-buffered saline ت ه هی و رد ترواجم میزوزیل و زانیئتورپ K تفرگ رارق . زا سپ یا مامتا اب و زیل یرتکاب هلحرم ن ا جارختسا تیک زا هدافتس DNA ( Germany ، Roche ) لکترپ قبط ، DNA یرتکاب تیمک و تیفیک .دش جارختسا DNA رظن دروم اب هدافتسا زا زروفورتکلا نآ رب یور لژ زراگآ 8 / 0 % اب و هزادنا یریگ یلاگچ یرون رد لوط جوم یاه و رتمونان هب تسد ( دمآ 20 .) اب یلاوت هب هجوت طوبرم یمیزنآ هیحان هب ( N-terminal ) ینژ کناب رد دوجوم ،
(National Center for Biotechnology Information= NCBI)
یکیتامرفناویب یاهرازفا مرن زا هدافتسا اب و Emboss Antigenic ، Bcepred و ABCpred هلصاف یدیتوئلکون 1 ات 1200 لاعف یاراد نیمد ناونع هب ت یمیزنآ تی أ دیی .دیدرگ تیاهن رد رازفا مرن اب
CLC main work bench ، یاهرمیارپ )ناریا ،تسیز وپاکت تکرش( تشگرب و تفر لودج( دندش یحارط هرامش 1 .) لودج هرامش 1 : قيقحت نیا رد هدافتسا دروم یاهرمیارپ هدننکدودحم میزنآ هاگیاج عون رمیارپ دودحم میزنآ شرب هاگیاج یاراد هدننک NdeI ATACATATGCAGCAATCGCATCAGGC Primer Forward هدننک دودحم میزنآ شرب هاگیاج یاراد HindIII ATGAAAGCTTATCCTGGCGTTCCACTGCG Primer Reverse جارختسا زا سپ DNA زارمیلپ یا هریجنز شنکاو (PCR) میزنآ روضح رد pfu ( Lituania ، Fermentas ) هب نژ ریثکت روظنم روم ییاهن مجح رد رظن د 25 .تفرگ تروص رتیلورکیم لوصحم لک سپس PCR زراگآ لژ یور رب 7 / 0 زا سپو یراذگ راب % یور زا رظن دروم دناب، دیامرب مویدیتا اب لژ یزیمآ گنر لمعلاوتسد قبط و هدیرب لژ لژ زا جارختسا تیک ( Germany ، Roche ) نآ زا سپ .دیدرگ یزاس صلاخ لوصحم PCR دش صلاخ میزنآ اب ه Taq زارمیلپ ( Lituania ، Fermentas ) روضح رد dATP تدم هب 20 رد هقیقد 72 یتناس هجرد و تفرگ رارق دارگ زا سپ روتکو رد ندش راد هلابند (Sinaclon) pTG19-T vector یرتکاب رد بیکرتون هزاس .دش یزاس هناسمه E.coli DH5α ( ناریا روتساپ وتیتسنا ) دیدرگ مروفسنارت و روضح رد تشک زا سپ X-gal و نیلیس یپمآ ( USA ، Sigma ) و باختنا گنر دیفس یاه ینلک بیکرتون هزاس روضح pTG19-AC ،کمک هب PCR ، ت دروم یلاوت نییعت و یمیزنآ مضه أ تفرگ رارق دیی ؛ تهج سپس ریز هناسمه نژ یزاس AC رد ینایبروتکو pET28a ، طسوت رظن دروم هعطق ادتبا یاه میزنآ HindIII ( Lituania ، Fermentas ) ، Nde1 ( Lituania ، Fermentas ) ، بیکرتون هزاس زا pTG19-AC ینایبروتکو رد و یزاسادج pET28a ( USA ، Novagen ) طسوت هک 2 شرب رکذلا قوف میزنآ میزنآ روضح رد ،دوب هدش هداد T4 یزاس هناسمه ریز و دش بیکرتون هزاس pET28a-AC دیدرگ لصاح . نیا هزاس ینایب نابزیم رد E.coli BL21 (DE3) ( وتیتسنا ناریا روتساپ و مروفسنارت ) سپ بیکرتون یاه ینلک
یسیاماناک روضح رد تشک زا ن ( USA ، Sigma ) طسوت PCR دروم سناکس نیییعت و یمیزنآ مضه ، ت أ .تفرگ رارق دیی روظنم هب نآ زا سپ و نیئتورپ نایب یزاس هنیهب یاقلا ، زاس یواح ینلک ادتبا بیکرت ون ه pET28a-AC رد 5 طیحم زا رتیل یلیم LB ثارب ( Difco ) بش کی زا سپ نیسیاماناک یواح یامد رد نویسابوکنا 37 یتناس هجرد هداد تشک دارگ دش ؛ نازیم هب هزات طیحم نیا زا سپس 100 / 1 و دش قیقر یرون بذج هب ندیسر و نویسابوکنا لابند هب (OD) اب ربارب 6 / 0 جوم لوط رد 600 لولحم زا ،رتمونان
(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside= IPTG) ییاهن تظلغ اب 1 ورپ یاقلا تهج ،رلاوم یلیم یئت ن زا سپ و دش هدوزفا طیحم هب رظن دروم 3 تعاس تورپ نایب یسررب تهج ،لبق طیارش اب نویسابوکنا یئ ن لژ یور 12 % میدس ود لیسد تافلوس یلپ لیرکا دیما (SDS PAGE) دیدرگ زروفورتکلا . هنومن دروم رد ًلاماک تشک طیارش ،یفنم لرتنک هدش هتفگ تروص هب و دش ماجنا لااب رد اب اقلا هلحرم اهنت IPTG لماک روط هب نییتورپ نایب یزاس هنیهب روظنم هب .دیدرگ فذح تظلغ ،ینلک عون نوچ ییاهرتماراپ بیکرتون IPTG ، یسررب اقلا نامز تدم و دشر یامد نیرتهب ات دندش دندرگ نییعت یبرجت ظاحل زا نایب طیارش . ت روظنم هب أ زا هدش دیلوت بیکرتون نییتورپ دیی نیا هب .دش هدافتسا گنیتلاب نرتسو شور زا سپ هک بیترت لژ یور رب نیئتورپ روفورتکلا SDSPAGE 12 یاهدناب ،% ذغاک هب ینیئتورپ (Polyvinylidene difluoride= PVDF) لقتنم یاه هاگیاج ندرک هکولب زا سپ و دیدرگ اب یصاصتخا ریغ Skimmed Milk ( USA ، Sigma ) هب و تعاس کی تدم نآ زا سپ 3 اب وشتسش راب TBS-T ( NaCl 15 ،رلاوم یلیم Tris-HCL 10 ،رلاوم یلیم Tween 20 1 / 0 % رد ، 4 / 7 PH: ،) ذغاک PVDF رد دیتسیه هلابند دض لانولکونوم یداب یتنآ ترواجم ینی
(Anti his tag) طسوت هرابود و تفرگ رارق BS-T 3 راب تفریذپ تروص وشتسش . زا سپ تدم هب نآ 2 تعاس ذغاک PVDF هدش هگژنوک هیوناث یداب یتنآ ترواجم رد اب HPR anti mous IgG/HRP) (Coat تقر اب 1000 / 1 اب وشتسش زا سپ و تفرگ رارق TBST ،هدش رکذ طیارش اب مز ات روبزم ذغاک یارتسبوس اب ترواجم رد دناب هدهاشم نا DAB (3,3'-diaminobenzidine) .تفرگ رارق نیئتورپ ینایب طیارش نیرتهب هب یسرتسد زا سپ ت و بیکرتون أ لژ یور رب نآ دیی SDS PAGE زیلانآ و سایقم رد نیئتورپ دیلوت ،تلاب نرتسو 500 رتیل یلیم یارب .تفریذپ تروص ،صیلخت تهج ،تشک طیحم خت تورپ صیل ینیدیتسیه هلابند دوجو هب هجوت اب نیئ زا یفارگوتامورک نوتس یور رب ندش تشرساو شور نیزر اب یلیامت Ni-NTA بیش ساسا رب PH قبط هروا .دیدرگ هدافتسا )نژایک( هدنزاس تکرش لمعلاروتسد اب لصاح بیکرتون نیئتورپ تظلغ دروفدارب شور لژ یوررب نآ تیفیکو یریگ هزادنا SDS PSGE 12 % ( تفرگ رارق یبایزرا دروم 20 .) ی اه هتفا : جارختسا زا سپ DNA یموزومورک لاتدروب سیسوترپ ، ریثکت یکیتیلاتاک هیحان نژ ACT ، مان هب AC ، شنکاو قیرط زا PCR میزنآ اب pfu یامد نیرت بسانم رد ، رظن دروم نژ هب اهرمیارپ لاصتا ( 65 )دارگ یتناس هجرد .تفرگ تروص جیتن ه PCR زراگآ لژ یور رب 1 رد % ریوصت ش هرام 1 -.تسا هدمآ فلا لوصحم نآ زا سپ PCR صیلخت تیک طسوت DNA یزاسادج لژ یور زا و دش روتکو رد ندش راد هلابند زا سپ pTG19/T کرتون روتکو .دیدرگ یزاس هناسمه ی ب pTG 19/T-AC لصاح اب یمیزنآ مضه طسوت 2 میزنآ HindIII و Nde1 ت دروم أ ی تفرگ رارق دی ( ریوصت ش هرام 1 -)ب ؛ رد و صیلخت لژ یور زا رظن دروم هعطق سپس روتکو pET28a روتکو .دیدرگ یزاس هناسمه ریز بیکرتون pET28a-AC رد تیقفوم اب لصاح یرتکاب Ecoli.BL21(DE3) و مروفسنارت نآ زا سپ ،یلاوت نییعت اب ینلک شور PCR و یمیزنآ مضه طسوت 2 هدش رکذ میزنآ دروم ت أ دیی تفرگ رارق ( ریوصت ش هرام 1 -.)ج
فلا ب ج ریوصت هرامش 1 : هيحان گنينولک یژتارتسا AC )فلا نژ ریثکت AC شور هب PCR ؛ نوتس 1 : هیوس تبثم لرتنک هنومن سیسوترپ لاتدروب 9797 B.pertussis ATCC ( زا هدش هیهت ساپ وتیتسنا یسانش بورکیم شخب )ناریا روت ، نوتس 2 : هتفای ریثکت نژ AC رد bp 1200 ، نوتس 3 رگناشن : kb 1 (Fermentas) ، نوتس 4 یفنم لرتنک : ؛ )ب بیکرتون روتکو یمیزنآ مضه pTG19/T-AC یاه میزنآ طسوت HindIII و NdeI نوتس . 1 : رگناشن Kb 1 ، نوتس 2 : بیکرتون روتکو pTG19/T-AC طسوت هتفای شرب HindIII و NdeI ؛ بیکرتون روتکو یمیزنآ مضه )ج pET28a-AC طسوت یاه میزنآ HindIII و NdeI . نوتس 1 : رگناشن Kb 1 ، نوتس 2 : بیکرتون روتکو pET28a-AC ، نوتس 3 اب هتفای شرب بیکرتون روتکو : HindIII و NdeI ، نوتس 4 ینلک : PCR بیکرتون روتکو زا PET28a-AC ، نوتس 5 روتکو : pET28a اب هدروخ شرب HindIII و NdeI . ینلک ،زین نایب طیارش یزاس هنیهب روظنم هب شیب نایب یاراد هک یباختنا دوب یرت ، تشک طیحم رد LB یامد رد عیام 37 و دش هداد تشک هجرد زا سپ نایب نیرتهب هب یسرتسد روظنم هب یفاک دشر هب ندیسر فلتخم یاه تظلغ IPTG ( 2 / 0 ، 5 / 0 ، 8 / 0 و 1 و اقلا )رلاوم یلیم لژ یور رب SDS PAGE 12 دروم % ( تفرگ رارق یسررب ریوصت ش هرام 2 صخشم هک )فلا دش ، تظلغ نیرتهب 5 / 0 رلاوم یلیم رد لاح .تسا هدوب هنیهب تظلغ اب رظن دروم ینولک یزاس هنیهب زا ،دعب هلحرم 5 / رلاوم یلیم فلتخم یاه نامز رد ، ( 2 ، 3 ، 4 و 5 )تعاس ( تفرگ رارق یسررب دروم زین وصت ری ش هرام 2 -)ب ؛ ،فلتخم یاهامد رد ینلک سپس 30 ، 35 ، 37 و 38 هجرد یتناس دش یسررب دارگ ( ریوصت ش هرام 2 جیاتن نیا .)ج دشر ندیسر زا سپ نیئتورپ نایب هک دوب نآ رگنایامن اب یرون بذج هب یرتک 6 / 0 جوم لوط رد 600 اب رتمونان یاقلا 5 / 0 رلاوم یلیم IPTG یامد رد نویسابوکنا و 37 تدم هب دارگ یتناس هجرد 4 نازیم رثکادح هب تعاس .دسر یم دوخ دروم زین تلاب نرتسو زیلانآ رد جیاتن نیا تأ ( تفرگ رارق دیی ریوصت ش هرام 2 -)د . اب یندیتسیه هلابند دوجو لیلد هب بیکرتون نیئتورپ اب یلیامت یفارگوتامورک شور Ni-NTA بیش ساسا رب PH ( دیدرگ صیلخت هروا 15 نامه .) ( رد هک روط ریوصت ش هرام 2 نیئتورپ نیا صیلخت ،دوش یم هدهاشم )ه لژ یرتموتیسناد( Lab works, software SDS PAGE
) دودح ات هلحرم کی رد 95 نازیم نیا هک دشاب یم نکمم % بسانم یصیخشت و یقیقحت یاهدربراک رثکا یارب صیلخت bp 1000 bp 1200 bp 1500 4 3 2 1 2 1 bp 1200 bp 1200 5 4 3 2 1
ادنا شور هب هدش ماجنا یاه یریگ هزادنا .تسا رد یریگ هز OD280 اب هک تسا نآ رگنایامن ،یجنس نیئتورپ تیک و نازیم هب هدش صیلخت نیئتورپ ناکما متسیس نیا زا هدافتسا 25 رتیل رب مرگ یلیم .دراد دوجو فلا ب ج د ه ریوصت ش هرام 2 : و نايب زيلانآ تورپ صيلخت نيئ AC طسوت SDS PAGE تلاب نرتسو و )فلا نایب طیارش یزاس هنیهب فلتخم یاه تظلغ یسررب( IPTG ) ؛ نوتس M ینیئتورپ رگناشن : (Fermentas) ، نوتس 1 زا لبق هنومن : اقلا ، نوتس 2 ، 3 ، 4 ، 5 یاقلا زا دعب یاه هنومن IPTG یاه تظلغ رد بیترت هب 2 / 0 ، 5 / 0 ، 8 / 0 و 1 رلاوم یلیم ؛ )ب یهب یزاس هن نامز یسررب( نایب طیارش یاقلا زا سپ فلتخم یاه ( IPTG )؛ نوتس 1 : هنومن 3 اقلا زا سپ تعاس ، نوتس 2 : هنومن 4 زا سپ تعاس اقلا ، نوتس 3 هنومن : 5 اقلا زا سپ تعاس ، نوتس M : ینیئتورپ رگناشن (Fermentas) ، نوتس 4 اقلا زا لبق هنومن : ، نوتس 5 زا سپ هنومن : 2 اقلا تعاس ؛ اقلا فلتخم یاه نامز یسررب( نایب طیارش یزاس هنیهب )ج IPTG ) ؛ نوتس 1 یامد رد اقلا : 38 یتناس هجرد دارگ ، نوتس 2 یامد رد اقلا : 37 یتناس هجرد دارگ ، نوتس M ینیئتورپ رکرام : ، نوتس 3 اقلا زا لبق هنومن : ، نوتس 4 رد اقلا : یامد 35 یتناس هجرد دارگ ، نوتس 5 یامد رد اقلا : 30 یتناس هجرد دارگ ؛ تلاب نرتسو زیلانآ )د ؛ نوتس 1 یفنم لرتنک : ، نوتس 2 : بیکرتون نیئتورپ ، نوتس M ینیئتورپ رکرام : ؛ بیکرتون نیئتورپ صیلخت )ه ؛ نوتس 1 هدش صیلخت بیکرتون نیئتورپ : ، نوتس 2 : د نیئتورپ یوشتسش ر 9 / 5 PH: نوتس ، 3 : رد نیئتورپ یوشتسش 3 / 6 PH: ، نوتس 4 : Super flew ، نوتس 5 اقلا زا دعب هنومن : ، نوتس 6 : اقلا زا لبق هنومن ، نوتس M ینیئتورپ رگناشن : (Fermentas) . 5 4 M 3 2 1 KD 45 45KD KD 45 KD 25 M 6 5 4 3 2 1 1 2 M 1 2 M 3 4 5 KD 45 KD 48 KD 35 KD 25 KD 17 KD 11 KD 45 48KD KD 35 KD 45 5 4 3 2 1 M
:ثحب ACT لمج زا زئاح سنلاوریو یاهروتکاف ه تیمها لاتدروب سیسوترپ هیحان رد ، N دوخ لانیمرت اب یروزیلاتاک نیمد یاراد 400 مان هب ،هنیمآ دیسا AC تیلاعف اب هک دشاب یم لباق ریغ لیدبت و یمیزنآ تشگزاب ATP هب cAMP زوتیسوگاف راهم زین و هفرس هایس یرامیب داجیا رد یمهم شقن اهژافورکام ( دراد 2 ، 8 ، 9 یمهم یدربراک شقن هیحان نیا .) رد زین هتشاد یناطرس دض یاهوراد کیتوتپوپآ تارثا شیازفا یاه لولس هب یرتکاب زا نیئتورپ لاقتنا اب دناوت یم و شقن یافیا یباختنا رگشرازگ کی ناونع هب تویراکوی ( دنک 13 -10 یاه پوتیپا هک نیا هب هجوت اب یفرط زا .) CD4+ و CD8+ ، T-cell نیمد نورد یکیتنژ روط هب AC و هتفرگ رارق طسوت یا هلاقم قبط زین Weingart و ه ناراکم یاه یداب یتنآ دوجو رب ینبم 3D1 و 5D1 وت یم ،نیمد نیا هیلع نا روصت رک هک د نیمد AC هب هیهت رد دناوت یم یکینژونومیا صاوخ نتشاد لیلد یاه تیک زینو لانولکونوم یاه یداب یتنآ ،نسکاو دریگ رارق هدافتسا دروم ،ازیلاا هیاپ رب یصیخشت ( 21 ، 22 ،) هکنیا هب هجوت اب اذل لاتدروب سیسوترپ قطانم یموب هیهت ،دنشاب یم نژورته ییایفارغج فلتخم و نسکاو تیمها یرتکاب ندوب یموب ساسا رب یصیخشت تیک نایب ،گنینولک یارب یهیجوت دوخ نیا هک هدرک ادیپ یم ناریا رد یموب هیوس زا نیئتورپ نیا صیلخت و امک .دشاب هیلع نویسانیسکاو ششوپ دوجو اب هکنیا دهاش ار یرتکاب نیا زا یشان تافلت هفرس هایس لاد زا یکی هک میشاب یم تلع هب دناوت یم نآ لی دشاب ناریا رد نسکاو ندوبن یموب . اب نیمد ،هدش هراشا بلاطم هب هجوت AC طسوت Vougier و ناراکمه و Johann دروم ناراکمه و ( تفرگ رارق هعلاطم 17 ، 18 ) . دیسا یور رب هعلاطم نیا آ هنیم 1 ات 384 دیسا یور رب و آ هنیم 1 ات 489 تروص م نیا یود ره رد .تفرگ نیئتورپ دیلوت تهج تاعلاط روتکو زا بیکرتون pTR نابزیم و E.coliBLR تهج تاعلاطم نیا رد .دیدرگ هدافتسا بیکرتون نیئتورپ نایب ندیسر زا سپ ،ام هعلاطم دننام زین 600 OD هب یرتکاب 6 / 0 نایب ، AC یامد رد 37 یتناس هجرد تروص دارگ و تفرگ د ،هدمآ تسد هب نیئتورپ صیلخت زا سپ هجر اب ربارب یصولخ 95 .داد ناشن ار % لک یور رب هعلاطم ،ام یاه یسررب قبط نیئتورپ ACT ًاتبسن و دشاب یم هدرتسگ رایسب هتشذگ زا نایب ،نآ نوگانوگ صاوخ یسررب روظنم هب لاح ات ببیکرتون نیئتورپ ACT نورد دراوم رثکا رد فلتخم یاه هیوس E.coli تسا هتفرگ تروص اهنت و ژافویرتکاب نورد صاخ دروم کی رد M13 رد و یرتکاب نورد رگید یدروم لاتدروب سیسوترپ شرازگ تسا هدش ( 26 -23 ،) تهج رد یا هعلاطم نونکات یلو کیتیلاتاک نیمد نایب طیارش یزاس هنیهب AC روظنم هب ، .تسا هتفرگن تروص نیئتورپ یلااب نازیم هب یسرتسد علاطم رد ،روظنم نیدب صاوخ ییاسانش زا سپ ،ام ه شور اب هیحان نیا یمیزنآ وتکو زا ،کیتامرفناویب یاه ر pET28a ک رتومورپ لرتنک تحت ار نژ نایب ه T7 ماجنا دهد یم ، هرهب اب ینایب روتکو ناونع هب لااب رایسب یرو دش هدافتسا ؛ یور رب یا هعلاطم رد نینچمه KD 100 زا نیئتورپ ACT روتکو زا ، ینایب pET15b یاراد هک رتومورپ T7 نازیم هب نیئتورپ دیلوت ،دشاب یم 20 ب تشک طیحم رتیل کی رد مرگ یلیم ه تسد دمآ ( 27 ) نابزیم زا رضاح هعلاطم دننامه زین هعلاطم نیا رد . ینایب E.coli BL21(DE3) دش هدافتسا یلااب نایب هک راک رب یمکحم لیلد هدش رکذ رادقم هب نیئتورپ آ ندوب دم نیا تظلغ .دشاب یم هیوس IPTG ا هعلاطم نیا رد هدش اقل یور رب هک KD 100 نیئتورپ زا ACT دوب هدش ماجنا ، 1 رلاوم یلیم یامد رد 37 یتناس هجرد هک دشاب یم دارگ هب ار تظلغ نیا ،نایب طیارش یزاس هنیهب اب ام 5 / 0 رلاوم یلیم و میدناسر نازیم هب ار نیئتورپ دیلوت یهدزاب 25 لیم رد عوضوم نیا تیمها .میداد شیازفا رتیل رب مرگ ی ناشن یبوخ هب ار دوخ نیئتورپ یتعنص و هوبنا دیلوت
دهد یم ، مک فرصم هک ارچ رت IPTG ًاتبسن تمیق هک( .ددرگ یم دیلوت یاه هنیزه شهاک ثعاب )دراد ییلااب نولک تهج ناریا رد یرگید هعلاطم هک تسا رکذ هب مزلا و نژ یتنآ نایب هتفرگ ماجنا سیسوترپ لاتدروب زا یرگید ( تسا 19 تینوی باس هک سنلاوریو روتکاف نیا .) S1 رد یزاس هنیهب تهج ،دشاب یم سیسوترپ نیسکوت ینایب یاهروتکو pET22b و pAED4 هک دیدرگ نولک دنداد ناشن همادا رد ، روتکو زا pET22b یاراد هک رتومورپ T7 م روتکو هب تبسن ،دشاب ی pAED4 م ناوت ی شیب نایب راظتنا هعلاطم نیا رد .تشاد ار نیئتورپ زا یرت ینایب نابزیم زا ام دننامه زین E.col BL21(DE3) تهج دمآراک هدنهد ناشن هک تسا هدش هدافتسا نایب یزاس هنیهب هیوس نیا ندوب E.coli نیئتورپ نازیم رثکادح دیلوت رد دشاب یم ، تینوی باس هدش رکذ هعلاطم رد اما S1 نیسکوت و جارختسا سیسوترپ لاتدروب درادناتسا هیوس زا سیسوترپ یلاح رد ،تسا هتفرگ رارق هعلاطم دروم ام هعلاطم رد هک یموب هیوس زا ،تسا هدش رکذ زین نآ لیلاد هک روط نامه لیلد دوخ نیا هک تسا هدش هدافتسا سیسوترپ لاتدروب دشاب یم قیقحت نیا بولطم یگژیو رب یمکحم . ن :یریگ هجیت ینایب روتکو زا هدافتسا اب ،رضاح هعلاطم رد pET28a و ینایب نابزیم E.coliBL21(DE3) اهنت یاقلا و 5 / 0 رلاوم یلیم ، IPTG یامد رد 37 یتناس هجرد هب دارگ تدم 4 ندیسر زا سپ ،تعاس OD600 هب یرتکاب 6 / 0 ، نازیم هب 25 رتیل رب مرگ یلیم بیکرتون نیئتورپ AC اب نازیم صولخ 95 درک دیلوت ار % . بیکرتون نیئتورپ طسوت یتحار هب و هتشادن یشهج هنوگ چیه لصاح Anti his tag نیا اذل ،تسا هتفرگ رارق ییاسانش دروم نینچ اب نیئتورپ یاهدربراک رثکا یارب صیلخت نازیم .تسا بسانم یصیخشت و یقیقحت :ینادردق و رکشت سنا حرط زا یتمسق لصاح هلاقم نیا روتساپ وتیت دک اب ناریا 1577 خیرات رد هک دشاب یم 15 / 11 / 92 تسا هدش بیوصت ، یشهوژپ زکرم نیا زا هلیسونیدب اذل و یلام یاه تیامح لیلد هب شخب ناراکمه هیلک یراکمه شهوژپ نیا رد ار ام هک یسانش بورکیم دنا هدرک ، و رکشت هنامیمص .میامن یم ینادردق انم :عب
1. Cookson BT, Cho HL, Herwaldt LA, Goldman WE. Biological activities and chemical composition of purified tracheal cytotoxin of Bordetella pertussis. Infect Immun 1989; 57(7): 2223-9.
2.Babu, M M, Bhargavi J, Singh Saund, R Kumar Singh S. Virulence factors of Bordetella pertussis. J Curr Res Sci. 2001; 80(12): 1512-22.
3. Mattoo S, Cherry JD. Molecular pathogenesis, epidemiology, and clinical manifestations of respiratory infections due to Bordetella pertussis and other Bordetella subspecies. Clin Microbiol Rev. 2005; 18(2): 326-82.
4. Wood N, McIntyre P. Pertussis: review of epidemiology, diagnosis, management and prevention. Paediatr Respir Rev. 2008; 9(3): 201-11.
5. Rieber N, Graf A, Hartl D, Urschel S, Belohradsky BH, Liese J. Acellular pertussis booster in adolescents induces Th1 and memory CD8+ T cell immune response. PloS one. 2011; 6(3): e17271.
6. Confer DL, Eaton JW. Phagocyte impotence caused by an invasive bacterial adenylate cyclase. Science. 1982; 217(4563): 948-50.
7. Veneziano R, Rossi C, Chenal A, Devoisselle JM, Ladant D, Chopineau J. Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin translocation across a tethered lipid bilayer. Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110(51): 20473-8.
8. Sebo P, Osicka R, Masin J. Adenylate cyclase toxin-hemolysin relevance for pertussis vaccines. Expert Rev Vaccines. 2014; 13(10): 1215-27.
9. Kamanova J, Kofronova O, Masin J, Genth H, Vojtova J, Linhartova I, et al. Adenylate cyclase toxin subverts phagocyte function by RhoA inhibition and unproductive ruffling. J Immunol. 2008; 181(8): 5587-97.
10. Hewlett EL, Donato GM, Gray MC. Macrophage cytotoxicity produced by adenylate cyclase toxin from Bordetella pertussis: More than just making cyclic AMP! Mol Microbiol. 2006; 59(2): 447-59.
11. Johansson D, Bergstrom P, Henriksson R, Grankvist K, Johansson A, Behnam-Motlagh P. Adenylate cyclase toxin from Bordetella pertussis enhances cisplatin-induced apoptosis to lung cancer cells in vitro. Oncol Res. 2006; 15(9): 423-30.
12.Cheung GY, Kelly SM, Jess TJ, Prior S, Price NC, Parton R, et al. Functional and structural studies on different forms of theadenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis. J Microb Pathog. 2009; 46 (1): 36–42.
13. Geddes K, Worley M, Niemann G, Heffron F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 2005; 73(10): 6260-71.
14. Sebo P, Osicka R, Masin J. Adenylate cyclase toxin-hemolysin relevance for pertussis vaccines. Expert Rev Vaccines. 2014; 13(10): 1215-27.
15. Cheung GY, Xing D, Prior S, Corbel MJ, Parton R, Coote JG. Effect of different forms of adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis on protection afforded by an acellular pertussis vaccine in a murine model. Infect Immun. 2006; 74(12): 6797-805.
16. Shahcheraghi F, Lotfi M, Parzadeh M, Nikbin V, Shouraj F, Zahraei. Isolation of Bordetella Pertussis and Bordetella Parapertussis of Clinical Specimens from Different Provinces of Iran. J Mazandaran Univ Med Sci. 2012; 22(88): 2-8.
17. Vougier S, Mary J, Dautin N, Vinh J, Friguet B, Ladant D. Essential role of methionine residues in calmodulin binding to Bordetella pertussis adenylate cyclase, as probed by selective oxidation and repair by the peptide methionine sulfoxide reductases. J Biol Chem. 2004; 279(29): 30210-8.
18.Karst JC, Barker R, Devi U, Swann MJ, Davi M, Roser SJ, et al. Identification of a Region That Assists Membrane Insertionand Translocation of the Catalytic Domain of Bordetellapertussis CyaA Toxin. J Biol Chem. 2012; 287(12): 9200-12.
19. Khafri A, Aghaiypour K, Peerayeh SN, Ghorbani R. Cloning and Expression of S1 Subunit of Pertussis Toxin in Escherichia coli. Avicenna J Med Biotechnol. 2011; 3(1): 19-24.
20. Maniatis T, fritsch EF, sambrook J. Molecular cloning a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1982; 76-85.
21. Fayolle C, Bauche C, Ladant D, Leclerc C. Bordetella pertussis adenylate cyclase deliverschemically coupled CD8+ T-cell epitopes to dendritic cells and elicits CTL in vivo. Vaccine. 2004; 23 (5): 604–14.
22. Weingart CL, Mobberley-Schuman PS, Hewlett EL, Gray MC, Weiss AA. Neutralizing antibodies to adenylate cyclase toxin promote phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infect Immun. 2000; 68(12): 7152-5.
23. Fayolle C, Osickova A, Osicka R, Henry T, Rojas MJ, Saron MF, et al. Delivery of multiple epitopes by recombinant detoxified adenylate cyclase of Bordetella pertussis induces protective antiviral immunity. J Virol. 2001; 75(16): 7330-8.
24. Dadaglio G, Morel S, Bauche C, Moukrim Z, Lemonnier FA, Van Den Eynde BJ, et al. Recombinant adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis induces cytotoxic T lymphocyte responses against HLA*0201-restricted melanoma epitopes. Int Immunol. 2003; 15(12): 1423-30. 25. Glaser P, Sakamoto H, Bellalou J, Ullmann A, Danchin A. Secretion of cyclolysin, the calmodulin-sensitive adenylate cyclase-haemolysin bifunctional protein of Bordetella pertussis. EMBO J. 1988; 7(12): 3997-4004.
26. Brownlie RM, Coote JG, Parton R, Schultz JE, Rogel A, Hanski E. Cloning of the adenylate cyclase genetic determinant of Bordetella pertussis and its expression in Escherichia coli and B. pertussis. Microb Pathog. 1988; 4(5): 335-44.
27. Pojanapotha P, Thamwiriyasati N, Powthongchin B, Katzenmeier G, Angsuthanasombat C. Bordetella pertussis CyaA-RTX subdomain requires calcium ions for structural stability against proteolytic degradation. Protein Expr Purif. 2011; 75(2): 127-32.
Cite this article as: Hashemi H, Baghbani-Arani F, Badmasti F, Shahcheraghi F. Cloning and optimization of expression and purification of the catalytic domain of adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis from an Iranian strain. J Shahrekord Univ Med Sci. 2016; 18(1): 63-72.
*Corresponding author:
Research Center of Pasteur Institute of Iran, Microbiology Dept., Tehran, I.R. Iran. Tel: 00982166405535, E-mail: [email protected]
Cloning and optimization of expression and purification of the catalytic
domain of adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis from an
Iranian strain
Hashemi H1, Baghbani-Arani F2, Badmasti F3, Shahcheraghi F3*
1
Microbiology Dept., Varamin-Pishva Branch, Islamic Azad University, Varamin, I.R. Iran; 2
Genetics and Biotechnology Dept., Varamin-pishva Branch, Islamic Azad University, Varamin, I.R. Iran;3Bacteriology Dept., Pasteur Institute of Iran, Tehran, I.R. Iran.
Received: 12/Mar/2015 Accepted: 26/Sep/2015
Background and aims: Adenylate cyclase toxin is one of the immunogenic virulence factors secreted by Bordetella pertussis, that consists of catalytic domain corresponding to the 400 N-terminal residues called AC. This domain can stimulate cAMP synthesis in eukaryotic cells, and it has an important role in development of pertussis. It also can be used as a cell biology tool and in anti-cancer drugs. The aim of this study was to achieve high expression of the antigenic properties of the AC to evaluate its use in vaccines, adjuvant or the provision of diagnostic kits. Methods: In this experimental study, AC domain amplified by PCR reaction, and cloned into pET28a vector and expressed in the E. coli BL21 (DE3) host. After the optimization of expression, protein analysis by SDS PAGE gel and Western blot analysis were performed. Purification was carried out on column chromatography (NI-NTA).
Results: AC fragment was cloned successfully into a pET28a vector and under expression system with a concentration of 0.5 mM IPTG induction after 4 hours at 37 °C, AC can be expressed as a function of maximum yields 25mg/L and 95% purity.
Conclusion: This study showed that the induction of expression using only 0.5 mM IPTG can result in the over expression of the catalytic domain of protein ACT with maximum purity. This amount is appropriate for many applications, including research and diagnosis.
Key words: Cloning, Expression optimization, Adenylate cyclase catalytic domain,
Bordetella pertussis.
